与自闭症相关的肠道菌群生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及微生物组学和医学分子生物学技术领域，具体涉及与自闭症相关的肠道菌群生物标志物及其应用。

背景技术：

自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorder，asd，以下简称自闭症)是一种复杂的神经发育障碍，以社交障碍、行为重复刻板、兴趣狭窄等为特征。近年来，在全球范围内asd的发病率不断上升。asd的病因尚未明确，与遗传、环境、免疫等因素相关。目前对于asd的诊断只能通过行为量表进行，尚无明确的生理诊断指标。

目前众多研究发现，母亲产前和孩子婴儿期早期接触有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯等毒素(农药)会影响孩子神经系统发育，增加asd患病几率。线粒体作为细胞中能量产生和毒物降解的重要结构，对于器官发育、机体免疫平衡有重要意义。研究证实，线粒体功能障碍是asd患者主要生理障碍之一。受损线粒体释放mtdna及损伤相关分子信号，引发机体炎症反应。在asd和其他许多精神疾病患者中，都发现存在伴随炎症因子、趋化因子升高的全身系统性炎症。大脑中小胶质细胞介导的炎症和线粒体损伤能够损伤神经胶质细胞和大脑发育的功能，引发asd。线粒体障碍源自自身遗传缺陷或外来毒素摄入，相比于正常人群，asd患者的线粒体更易受损伤，原因尚不清晰。

此外，越来越多的研究发现自闭症患者常伴随不同程度的肠胃症状以及肠道菌群失调。肠道微生物在asd的发病过程中扮演重要角色，但作用机制尚未完全明确。目前，尚未见将肠道菌群及其代谢通路用于肠道毒物降解能力和自闭症评估方面的相关报道。传统的asd诊断仅通过行为量表进行(cars、dsm-5、abc、adi-r、ados等)，该方法基于观察和问卷评分综合判定，与生理学改变相比，比较滞后，只能在神经发育受损、出现发育障碍及行为特征之后做出判断。因此，亟需开发与asd相关的生物标志物，为asd的早期、高效的诊断提供基础。

技术实现要素：

为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供与自闭症相关的肠道菌群生物标志物以及该生物标志物的检测试剂及其应用。

本发明通过对大量asd患者的粪便样本进行宏基因组shotgun测序分析发现，与正常样本相比，asd患者的肠道菌群中涉及甲基膦酸酯(methylphosphonate)、3-苯基丙酸酯(3-phenylpropanoate)、3-(3-羟苯基)丙酸甲酯(3-(3-hydroxyphenyl)-propanoate)、丙酮醛、卤代烃、对氨基苯甲酸、苯甲酰胺、苯乙烯、萘、二甲苯和苯甲酸等多种毒物降解的代谢通路及其相关代谢酶以及谷胱甘肽及l-谷氨酰胺合成的代谢通路及其相关代谢酶均存在显著的丰度差异，这些丰度差异使得肠道毒物降解能力下降，进而导致线粒体损伤，诱发asd的发生。即肠道菌群携带这些毒物降解代谢通路及其相关酶类，能够减轻毒物蓄积对宿主线粒体的损伤，相反，若肠道菌群较少携带这些毒物降解代谢通路及其相关酶类，则会加重毒物蓄积对宿主线粒体的损伤，进而诱发asd。基于此，本发明通过筛选获得与asd发生相关的生物标志物组合，利用该生物标志物组合构建了用于诊断asd的随机森林分类模型，对于asd的辅助诊断具有较好的作用。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供与自闭症相关的肠道菌群生物标志物，其包括生物分子或代谢通路；所述生物分子为蛋白质或其编码核酸；所述代谢通路包括如下代谢通路中的一种或多种：pwy-4041:谷胱甘肽合成；pwy-5505:谷氨酸和谷氨酰胺合成；methglyut-pwy:丙酮醛降解；pwy0-1277:3-苯基丙酸酯和3-(3-羟苯基)丙酸甲酯降解；pwy0-1533:甲基膦酸酯降解i；所述蛋白质包括所述代谢通路的相关酶或调控蛋白中的一种或多种。

上述pwy-4041、pwy-5505、methglyut-pwy、pwy0-1277和pwy0-1533均为metacyc数据库中对应的代谢途径编号。

具体地，所述蛋白质包括所述蛋白质包括选自丙酮醛还原酶、甘油脱氢酶、l-乳酸盐脱氢酶、乳醛脱氢酶、羟酰基谷胱甘肽水解酶、乙二醛酶i、3-(3-羟苯基)丙酸酯羟化酶、3-苯基丙酸酯双加氧酶、2,3-二羟基-2,3-二氢苯基丙酸酯脱氢酶、3-羧乙基邻苯二酚2,3-双加氧酶、2-羟基-6-氧壬-2,4-二烯二酸酯水解酶、2-氧戊四烯酸酯水合酶、乙醛脱氢酶、半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽合酶、γ-谷氨酰转移酶、半胱氨酰糖苷酶、膦酸甲酯降解复合物、α-d-核糖1-甲基膦酸酯5-三磷酸二磷酸酶、α-d-核糖1-甲基膦酸酯5-磷酸c-p-裂解酶、磷酸核糖基1,2-环磷酸二酯酶、谷氨酰氨合成酶、谷氨酸盐脱氢酶、酰基磷酸酶/乙酰磷酸酶、4-羟基苯甲酸酯脱羧酶、酰胺酶/酰基酰胺酶/酰基转移酶、3-氧己二酸辅酶a转移酶、苯甲酸酯1,2-双加氧酶/苯甲酸羟化酶、乙醇脱氢酶/醛还原酶、苯乙醛脱氢酶和芳基醇脱氢酶中的一种或多种。

上述蛋白质所对应的ec编号以及代谢通路(metacyc数据库编号)和功能如表1所示。

表1生物标志物对应的ec编号和代谢通路或功能

上述生物标志物的组合能够在保证较少的检测靶标的同时，更加特异、准确地预测asd的发生，更适于在实践中用于asd的辅助诊断。

上述生物标志物中，还原型谷胱甘肽(gsh)合成途径(pwy-4041)基因丰度以及l-谷氨酰胺合成途径(pwy-5505)基因丰度在asd患者中显著下降。还原型谷胱甘肽(gsh)是人体主要的抗氧化剂之一，也是许多解毒酶的关键辅助因子，在降解有机毒物和排出重金属方面起着关键作用，有助于维持线粒体的功能。作为谷胱甘肽的前体，l-谷氨酰胺不仅参与了有机毒素的降解，还能维持肠道屏障的完整性，并能阻止lps等有机毒物进入循环系统。

上述生物标志物中，与甲基膦酸酯、3-苯基丙酸酯和3-(3-羟苯基)丙酸甲酯、丙酮醛、卤代烃、对氨基苯甲酸、苯甲酰胺、苯乙烯、萘、二甲苯和苯甲酸等毒物的降解相关的酶及其编码基因的丰度也在asd患者中显著下降。

本发明利用由表1中所示的31种毒物代谢相关酶组成的生物标志物组合，构建了用于辅助诊断asd的随机森林分类模型，其auc值可达0.88，证明本发明所述的生物标志物可较为准确地预测asd的发生。

第二方面，本发明提供所述生物标志物的检测试剂。

具体地，所述检测试剂包括用于所述生物标志物的丰度检测的引物或探针。

所述检测试剂还可包括用于宏基因组测序分析所需的试剂。

第三方面，本发明提供所述生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备用于辅助诊断自闭症或评价自闭症患病风险的试剂、试剂盒或系统中的应用。

第四方面，本发明提供所述生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备用于评价肠道毒物降解能力的试剂、试剂盒或系统中的应用。

第五方面，本发明提供所述生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备用于自闭症患者指导用药或评价自闭症患者预后的试剂、试剂盒或系统中的应用。

具体地，上述应用中，通过检测所述生物标志物在待测样本中的丰度，根据所述生物标志物在待测样本和正常样本中的丰度差异，辅助诊断自闭症、评价自闭症患病风险、肠道毒物降解能力或自闭症患者的预后。

第六方面，本发明提供包含所述生物标志物的检测试剂的试剂或试剂盒。

第七方面，本发明提供一种用于评估自闭症患病风险或辅助诊断自闭症的系统，其包括生物标志物检测模块和数据处理模块；所述生物标志物检测模块用于检测待测样本中所述生物标志物的丰度；所述数据处理模块与所述生物标志物检测模块相连，用于接收所述生物标志物检测模块得到的丰度数据，将其与正常样本中所述生物标志物的丰度数据进行比较，输出结果。

优选地，所述与正常样本中所述生物标志物的丰度数据进行比较通过调用数学模型进行。

更优选地，所述数学模型为根据所述生物标志物在自闭症患者样本和正常样本中的丰度差异构建的随机森林分类模型。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次发现肠道菌群可以辅助肠道毒物的降解，减少线粒体因毒物积累带来的损伤以及由此诱发的asd的发生。

(2)本发明提供的与asd相关的肠道菌群生物标志物对于评估asd患者肠道毒物降解能力以及asd的诊断和患病风险评估具有较高的准确性、敏感性和特异性。

(3)利用本发明提供的肠道菌群生物标志物进行asd的检测，样本采集便捷、不会造成机体损伤、检测方便快速、可进行定期检测，与传统的行为量表相比，可及早发现肠道毒物降解能力的变化，辅助asd的早期诊断和筛查，为指导治疗及康复方案的及时调整提供依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中10种线粒体损伤及毒物代谢标志物在asd患者粪便样本中的超标比例。

图2为本发明实施例1中asd患者大多存在10项中的多项线粒体损伤及毒物代谢标志物超标。

图3为本发明实施例2中asd患者肠道菌群所含毒物代谢通路的丰度差异分析结果；所列代谢通路的丰度在asd患者(asd)和正常人(对照)之间差异显著(威尔科克森符号秩检验(wilcoxonsigned-rank),p-value<0.05)。

图4为本发明实施例2中asd患者肠道菌群中毒物代谢酶类的丰度差异分析结果(wilcoxonsigned-rank,*标注为p-value<0.05)。

图5为本发明实施例4中利用31种肠道毒物代谢酶构建的asd预测模型的roc曲线；其中，specificity代表特异性，sensitivity代表敏感性。

图6为本发明实施例4中利用31种肠道毒物代谢酶构建的asd预测模型对实施例1的全部样本进行肠道毒物降解损伤程度评估的评分结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1asd患者的尿液代谢物分析

以3～8岁的asd儿童为研究对象，所有参与者均根据精神疾病诊断和统计手册，第5版进行诊断，基于ados(autismdiagnosticobservationschedule，自闭症诊断观察表)、cars(ratingorscoringinstrumentsofchildhoodautismratingscale，儿童自闭症测评表)、rbs-r(repetitivebehaviorscale-revised，刻板重复行为量表)以及abc(autismbehaviorchecklist，孤独症行为量表)量表进行行为评估。年龄和性别匹配的典型发育儿童从周围社区招募，并根据入学体检和家长面谈排除任何精神疾病。所有参与者在入组前三个月内有临床明显感染或服用抗生素、抗精神病药、益生菌、益生元或特殊饮食(如生酮饮食)的儿童也被排除在外。最终纳入39例asd患儿和40例正常发育儿童的肠道粪便样本和尿液样本。

采用gc-ms方法对尿液代谢物进行检测，检测结果如图1和图2所示，结果表明，所有参与尿液有机酸检测的asd患儿尿液有机酸中均出现不同程度的线粒体损伤标志物或毒物代谢标志物的浓度超标，包括富马酸、琥珀酸、辛二酸、2-羟基马尿酸、4-羟基马尿酸、焦谷氨酸、乌头酸等，这与已往asd研究中的发现一致。

实施例2asd患者粪便样本中肠道菌群毒物代谢通路的丰度检测

利用宏基因组shotgun测序分析对实施例1中的39例asd患儿和40例正常发育儿童的肠道粪便样本进行肠道菌群毒物代理通路及其相关酶的丰度检测。

代谢通路丰度检测结果如图3和表2所示，代谢酶类的丰度检测结果如图4和表3、表4所示，结果分析如下：

1、asd患者粪便样本中还原型谷胱甘肽及l-谷氨酰胺合成途径及其所含酶类丰度显著下降

asd患者粪便样本中谷胱甘肽合成酶类ec:6.3.2.2、ec:6.3.2.3、ec:2.3.2.2和ec:3.4.13.18以及l-谷氨酰胺合成酶类ec:6.3.1.2和ec:1.4.1.4的丰度显著下降。还原型谷胱甘肽(gsh)是人体主要的抗氧化剂之一，也是许多解毒酶的关键辅助因子，在降解有机毒物和排出重金属方面起着关键作用，这两方面都有助于维持线粒体的功能。作为谷胱甘肽的前体，l-谷氨酰胺不仅参与了有机毒素的降解，还能维持肠道屏障的完整性，并能阻止lps等有机毒物进入循环系统。

2、asd患者粪便样本中毒物降解代谢途径及其所含酶类丰度显著不足

其中，涉及甲基膦酸盐、3-苯基丙酸酯、3-(3-羟苯基)丙酸甲酯，丙酮醛、卤代烃、对氨基苯甲酸、苯甲酰胺、苯乙烯、萘、二甲苯和苯甲酸等多种毒物的降解酶类。

asd患者样本中，降解甲基膦酸盐的酶类ec:2.7.8.37、ec:3.6.1.63、ec:4.7.1.1和ec:3.1.4.55的丰度显著下降。甲基膦酸盐是最常见的一类有机磷化合物，许多细菌可以将其作为磷源分解利用。草甘膦作为世界上使用最广泛的除草剂，也是一种甲基膦酸盐，其会产生核毒性和线粒体毒性。

3-苯基丙酸酯和3-(3-羟苯基)丙酸甲酯的降解通路中包含芳香烃类水解酶。asd患者样本中，ec:1.14.13.127、ec:1.14.12.19、ec:1.3.1.87、ec:1.13.11.16、ec:3.7.1.14、ec:4.2.1.80和ec:1.2.1.10的丰度显著下降。芳香烃是含有一个苯环或多个稠环(多芳香烃-多环芳香烃)的化合物，亲脂性强，在长期摄入后容易在体内积聚，因此往往对膜结构和脂肪组织(如大脑)产生毒性。

asd患者样本中，降解丙酮醛至乳酸的乙二醛酶(ec:4.4.1.5)和水解酶(ec:1.1.1.283)丰度显著下降。丙酮醛是糖酵解和脂肪酸、蛋白质代谢过程中不可避免的副产物，是一种对细胞有害的高效糖化剂，可与蛋白质脂质和核酸形成糖基化的终产物(ages)，这些终产物参与包括脑损伤在内的各种退行性过程。丙酮醛能改变线粒体的功能和氧化状态，导致asd患者大脑线粒体损伤。丙酮醛可在包括肠道在内的所有组织中被宿主细胞和微生物产生，在原位快速降解，保持在低无毒水平。

此外，还发现asd患者有13种代谢通路相关酶的丰度显著低于正常样本，它们参与降解多种毒物，包括氯烷烃/氯代烯烃、氨基苯甲酯、苯甲酰胺、苯乙烯、萘、二甲苯和苯甲酯(表4)，这些毒物广泛用于杀虫剂和食品添加剂的生产。这些关键酶的缺乏暗示了肠道菌群更广泛的解毒功能的损害。

表2asd患者的差异代谢通路

注：表2中hc代表正常样本，asd代表asd患者

表3asd患者的差异肠道毒物代谢途径所含酶类(1)

表4asd患者的差异肠道毒物代谢酶类(2)

实施例3asd患者肠道毒物代谢酶与线粒体标志物浓度的相关性分析

将实施例2中asd患者中丰度存在差异的毒物代谢通路酶类与实施例1中asd患者尿液中线粒体损伤标志物的检测结果进行关联分析发现，asd患者中丰度存在差异的毒物代谢通路酶类与线粒体损伤标志物2-羟基马尿酸、乌头酸、柠檬酸、焦谷氨酸和辛二酸呈现负相关(表5)。例如：gsh合成通路中ec:6.3.2.2、ec:6.3.2.3、ec:2.3.2.2和ec:3.4.13.18的丰度与尿液中乌头酸、柠檬酸、焦谷氨酸呈强负相关(rho<-0.5)，而焦谷氨酸正是线粒体内gsh代谢耗尽的标志物。又如：甲基磷酸盐降解起始过程的酶ec:2.7.8.37、ec:3.6.1.63、ec:4.7.1.1与焦谷氨酸、辛二酸呈现更强的负相关(rho：-0.6～-0.8)。结果表明，这些酶对线粒体具有丰度依赖的保护作用。

表5asd患者肠道缺乏的毒物代谢酶类与尿液有机酸中线粒体损伤标志物呈负相关

注：表5中的数值代表对应的酶(ec)与有机酸标志物之间的相关性(spearman相关系数，即rho值，rho>0为正相关，rho<0为负相关，阴影即为负值，绝对值越大相关性越强)。

实施例4用于asd预测的随机森林分类模型的构建

以实施例1中的asd患者和正常样本为对象，利用筛选出的如表1所示的31种肠道毒物代谢酶作为生物标志物，基于实施例1中的asd患者和正常样本中上述酶的丰度数据构建了用于诊断asd的随机森林分类模型，具体构建方法如下：模型由50％的样本通过双重交叉验证进行训练，并对所有样本进行测试，自展(bootstrapping)1000次。对于每个bootstrap结果，记录每个酶对模型的贡献和每个受试者的诊断分数。然后根据auc(roc曲线下面积)评估模型的诊断准确性和特异性。该模型对asd的预测准确率可达0.88(如图5所示，auc值为0.88)，可用于asd的评估。

利用上述构建的随机森林分类模型，依据所含31种肠道毒物代谢酶的丰度，对实施例1中asd患者和正常样本中的每个样本进行预测诊断评分。所得分值代表肠道毒物降解能力损伤程度，范围是0-1，若评分为0.5以上，则判断发生asd可能性大，分值越高概率越大。asd患者与正常组的评分结果见图6，结果表明，构建的随机森林分类模型的评估分数可以很好的区分asd患者和正常人群。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。