一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法与流程

本发明属于抗菌肽制备技术领域，具体涉及一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法。

背景技术：

细菌能够合成各式各样的抗菌肽，又被称作细菌素。细菌素主要是通过在靶细胞膜上形成孔道，从而造成内容物外泄或各种平衡机制失调，选择性抑菌或杀菌可保护肠道优势菌群。乳酸菌是目前世界公认安全的食品级微生物，乳酸菌在代谢过程产生很多抗菌物质，主要包括酸性物质、乳酸菌抗菌肽、过氧化氢等，可有效抵抗食物变质和食源性病原微生物。近几年，乳酸菌对其他细菌的拮抗作用的机理研究得最多的是乳酸菌抗菌肽。乳酸菌抗菌肽是在乳酸菌代谢过程中，合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌(尤其是亲缘性较近的细菌)具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽。乳酸菌抗菌肽可作为天然的食品防腐剂直接应用于食品工业，可以防止食品中腐败菌和病原菌的生长，作为一类天然食品防腐剂和饲料添加剂有着非常广阔的开发应用前景。

但是乳酸菌在自然条件或舒适条件下产生抗菌肽的周期长，且得率低。因此，有必要开发一种缩短乳酸菌抗菌肽生产周期并提高其得率的方法。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法，该方法不仅提高了乳酸菌产生抗菌肽的产率，而且大大缩短了培养周期。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法，该方法为：在乳酸菌发酵过程中加入沙门氏菌，待发酵液中不再有沙门氏菌活菌后停止培养，对最终发酵产物进行分离提取抗菌肽即可。

本发明通过在乳酸菌发酵过程中加入一定量的沙门氏菌，创造恶劣的培养环境，同时保证乳酸菌处于优势状态，让乳酸菌和沙门氏菌形成竞争关系，乳酸菌在沙门氏菌的刺激下，会产生大量的抗菌肽，以保证自身竞争优势和生长，每隔一段时间检测培养基中沙门氏菌的数量，待检测不到沙门氏菌时，停止培养，经过分离提取得到乳酸菌抗菌肽，从而既缩短了抗菌肽的制备周期，也提高了其产率。

优选的，具体是在乳酸菌发酵培养至稳定期中期时加入沙门氏菌。稳定期中期时乳酸菌的生长最稳定，此时加入沙门氏菌不会对其正常生长发育造成不利影响。

优选的，所述沙门氏菌的加入量为乳酸菌初始菌量的20％-40％。此时乳酸菌和沙门氏菌形成竞争关系，并保证乳酸菌处于优势状态。

优选的，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

优选的，所述分离提取抗菌肽的过程包括以下步骤：

s1、收集最终发酵产物进行离心，保留上清液；

s2、对步骤s1的上清液进行分离提纯后得到含抗菌肽的浓缩液。

优选的，步骤s2所述分离提纯采用透析浓缩法。

优选的，将步骤s2的含抗菌肽的浓缩液干燥处理成抗菌肽干粉。

更优选的，往步骤s2的含抗菌肽的浓缩液中添加麦芽糊精混匀后再干燥处理成抗菌肽干粉。具体的，所述麦芽糊精为质量浓度为25％的麦芽糊精溶液，所述麦芽糊精溶液的添加体积为含抗菌肽的浓缩液体积的2-3％。麦芽糊精是一种赋型剂，有利于抗菌肽干粉的定型和保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法，在乳酸菌的培养稳定期加入沙门氏菌，利用乳酸菌对沙门氏菌的竞争抑制作用，使乳酸菌在沙门氏菌的刺激下产生大量的抗菌肽，然后经过分离提取后得到乳酸菌抗菌肽，该方法工艺简单，可有效的降低生产成本和劳动强度，既提高了乳酸菌产生抗菌肽的产率，又大大缩短了培养周期。

附图说明

图1为混合菌液(乳酸菌和沙门氏菌)的共培养时间推移图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法，包括以下步骤：

s1、将活化后的乳酸乳球菌接种于乳酸菌培养基(ph5.5-6.0)置于37℃下培养至稳定期中期，然后加入沙门氏菌继续培养，加入沙门氏菌的量为乳酸乳球菌初始量的三分之一(cfu/l)，培养期间，每隔2h取样检测乳酸乳球菌和沙门氏菌的活菌含量，直至检测不到沙门氏菌为止，结束培养，如图1所示，加入沙门氏菌培养28h后，检测不到沙门氏菌；

s2、收集步骤s1中的培养液得到3kg培养物，将培养物置于gq-105型管式离心机中，以8000r/min的转速离心30min，所得上清液通过离心机出液管接到备用罐中备用，共得到2l上清液，下层固体杂质刮下后经过灭菌干燥处理，称干重量为116g；

s3、采用透析浓缩法对步骤s2得到的2l上清液进行分离提纯，即，将上清液装入分子量截留值为1200u的透析袋(sigma)内，包埋于聚乙二醇中，在4℃下透析过夜，透析浓缩后得到的样品50000g离心30min，收集上清得到400ml含抗菌肽的浓缩液；，

s4、往上述400ml浓缩液中添加10ml质量浓度为25％的麦芽糊精溶液，搅拌均匀后经过喷雾干燥即得到的抗菌肽干粉，所得抗菌肽干粉的干重为260mg。

s5、抗菌肽得率的计算：抗菌肽得率(％)＝抗菌肽干重/(抗菌肽干重+离心沉淀干重)×100％；

即上述制备方法制备得到的抗菌肽得率为：0.26g/(0.26g+116g)×100％＝0.22％。

实施例2一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法，包括以下步骤：

s1、将活化后的乳酸乳球菌接种于乳酸菌培养基(ph5.5-6.0)置于37℃下培养至稳定期中期，然后加入沙门氏菌继续培养，加入沙门氏菌的量为乳酸乳球菌初始量的20％(cfu/l)，培养期间，每隔2h取样检测乳酸乳球菌和沙门氏菌的活菌含量，加入沙门氏菌培养29h后，检测不到沙门氏菌，结束培养；

s2、收集步骤s1中的培养液得到2.91kg培养物，将培养物置于gq-105型管式离心机中，以8000r/min的转速离心30min，所得上清液通过离心机出液管接到备用罐中备用，共得到1.96l上清液，下层固体杂质刮下后经过灭菌干燥处理，称干重量为114.9g；

s3、采用透析浓缩法对步骤s2得到的1.96l上清液进行分离提纯，即，将上清液装入分子量截留值为1200u的透析袋(sigma)内，包埋于聚乙二醇中，在4℃下透析过夜，透析浓缩后得到的样品50000g离心30min，收集上清得到395ml含抗菌肽的浓缩液；

s4、往上述395ml浓缩液中添加7.9ml质量浓度为25％的麦芽糊精溶液，搅拌均匀后经过喷雾干燥即得到的抗菌肽干粉，所得抗菌肽干粉的干重为248mg。

s5、抗菌肽得率的计算：0.248g/(0.248g+114.9g)×100％＝0.216％。

实施例3一种促进乳酸菌快速分泌抗菌肽的方法，包括以下步骤：

s1、将活化后的乳酸乳球菌接种于乳酸菌培养基(ph5.5-6.0)置于37℃下培养至稳定期中期，然后加入沙门氏菌继续培养，加入沙门氏菌的量为乳酸乳球菌初始量的40％(cfu/l)，培养期间，每隔2h取样检测乳酸乳球菌和沙门氏菌的活菌含量，加入沙门氏菌培养30h后，检测不到沙门氏菌，结束培养；

s2、收集步骤s1中的培养液得到3.07kg培养物，将培养物置于gq-105型管式离心机中，以8000r/min的转速离心30min，所得上清液通过离心机出液管接到备用罐中备用，共得到2.1l上清液，下层固体杂质刮下后经过灭菌干燥处理，称干重量为117.7g；

s3、采用透析浓缩法对步骤s2得到的2.1l上清液进行分离提纯，即，将上清液装入分子量截留值为1200u的透析袋(sigma)内，包埋于聚乙二醇中，在4℃下透析过夜，透析浓缩后得到的样品50000g离心30min，收集上清得到405ml含抗菌肽的浓缩液；

s4、往上述405ml浓缩液中添加12.15ml质量浓度为25％的麦芽糊精溶液，搅拌均匀后经过喷雾干燥即得到的抗菌肽干粉，所得抗菌肽干粉的干重为250mg。

s5、抗菌肽得率的计算：0.25g/(0.25g+117.7g)×100％＝0.21％。

对比例1一利用乳酸菌制备抗菌肽的方法，包括以下步骤：

s1、将活化后的乳酸乳球菌接种于乳酸菌培养基(ph5.5-6.0)置于37℃下培养36h；

s2、收集步骤s1中的培养液得到2.97kg培养物，将培养物置于gq-105型管式离心机中，以8000r/min的转速离心30min，所得上清液通过离心机出液管接到备用罐中备用，共得到1.97l上清液，下层固体杂质刮下后经过灭菌干燥处理，称干重量为114.5g；

s3、采用透析浓缩法对步骤s2得到的1.97l上清液进行分离提纯，即，将上清液装入分子量截留值为1200u的透析袋(sigma)内，包埋于聚乙二醇中，在4℃下透析过夜，透析浓缩后得到的样品50000g离心30min，收集上清得到390ml含抗菌肽的浓缩液；

s4、往上述390ml浓缩液中添加9.75ml质量浓度为25％的麦芽糊精溶液，搅拌均匀后经过喷雾干燥即得到的抗菌肽干粉，所得抗菌肽干粉的干重为90mg。

s5、抗菌肽得率的计算：0.09g/(0.09g+114.5g)×100％＝0.079％。

实验例1采用本发明方法和常规方法制备得到的乳酸菌抗菌肽的抑菌效果比较

以实施例1-3和对比例1中分离提纯后得到含抗菌肽的浓缩液为试验样品进行抑菌试验，实施例1-3为实验组，对比例1为对照组，实验用指示菌为大肠杆菌，每组样品除了做浓缩液的测试外，还分别做5个稀释度的实验(分别稀释10倍、20倍、30倍、50倍和100倍)，具体试验方法如下：

(1)将经活化的大肠杆菌培养至浓度为1×10⁶cfu/ml的菌液，然后将其均匀涂布于lb测试培养基上，在测试培养基上打2个上样孔，并将上样孔处的测试培养基挑出，用记号笔在上样孔旁边做好标记，对照组标记为1，实验组标记为2，对照组和实验组均做5个平行试验；

(2)用移液枪分别取150ul实施例1-3和对比例1中的上清液，并加入对应的上样孔内，然后将接种后的培养基置于37℃的培养箱中培养24h。

(3)用游标卡尺分别测量对照组和实验组的抑菌圈直径，并计算出5个平行直径的平均值，结果如表1所示。

通过表1可以看出，与常规制备方法相比，采用本发明方法制备得到的含抗菌肽的浓缩液具有更显著的抑菌效果，在稀释一定浓度的情况下，本发明的抑菌效果表现出递减的现象，说明在相同的条件下，采用本发明方法可以制备得到的更高浓度的乳酸菌抗菌肽。

表1本发明方法和常规方法制备得到的乳酸菌抗菌肽的抑菌效果比较

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。