体外检测DNASE1L3蛋白的方法与流程

本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及体外检测dnase1l3蛋白的方法。

背景技术：

系统性红斑狼疮(sle)的一个重要特征是大量产生针对自体细胞核组分(核糖核蛋白、dna等)的抗体。这些抗体的产生是由体内过度活化的b细胞激发，然后经过天然免疫系统进一步增强。最终，这些抗体与核酸成分形成大的免疫复合物，沉淀在组织中，从而引发慢性炎症，例如血管炎、肾小球肾炎。igg抗体与双链dna的强结合是引起sle严重临床表现的重要原因。针对染色质抗体的产生被认为是sle的普遍特征，可以成为诊断sle的敏感标记物。凋亡细胞产生的dna在正常生理条件下可以被有效降解，并不会引发抗原反应。但在sle病人体内，来源于凋亡细胞的dna无法被清除，进而引发持续的抗原刺激，诱导抗体的产生，引起发病。

病人检测以及动物模型研究显示dnase1l3的失活性突变或缺失能够引发sle。重建dnase1l3的表达，可以有效清除血液中的dna成分，缓解甚至消除sle。

然而，目前尚无体外检测dnase1l3蛋白活性的方法。

技术实现要素：

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

taqman双链探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光报告基团，如fam、tet、vic、hex、cy3、cy5等，3’端携带荧光淬灭基团，如dabcyl、tamra、bhq1等。探针完整时，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团吸收；探针被破坏后，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

基于dnase1l3可以降解双链dna的机理，本申请的发明人采用纯化的dnase1l3与taqman探针在荧光定量pcr仪器中进行孵育，随着完整的探针被dnase1l3的降解，相互作用的荧光淬灭基团(b)与荧光报告基团(f)被分开，使得荧光基团发射的荧光可以被荧光定量pcr仪检测到，进而可以检测到dnase1l3蛋白的活性。原理可参考图1。

为此，本发明提出一种体外检测dnase1l3蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样品与taqman双链探针进行孵育和荧光信号检测；基于检测结果，确定所述待测样品中是否含具有酶活性的dnase1l3蛋白。本申请的发明人巧妙利用了dnase1l3可以降解双链dna的机理，并结合taqman技术，首次提出了一种体外检测dnase1l3蛋白的方法。该方法灵敏度高，弥补了现有技术体外快速检测dnase1l3蛋白的空白，实现了显著的技术进步，推动了科研工作的进展。

根据本发明的实施例，所述taqman双链探针的正向探针具有seqidno:1所示的核苷酸序列；所述taqman双链探针的反向探针具有seqidno:2所示的核苷酸序列，所述正向探针的5’端连接有荧光报告基团，所述正向探针的3’端连接有荧光淬灭基团。

aaagggaaagggaaagggaaagggaaagggaaagggaa(seqidno:1)。

ttccctttccctttccctttccctttccctttcccttt(seqidno:2)。

根据本发明的实施例，所述孵育是在25℃～37℃的条件下进行的，优选37℃。发明人发现，dnase1l3蛋白对taqman双链探针剪切作用在25℃～37℃最优，其中，在37℃下的剪切活性优于在25℃的剪切活性，将待测样品与taqman双链探针在25℃～37℃下进行孵育，可有效提高检测的灵敏度和准确度。

根据本发明的实施例，所述荧光信号检测是在荧光定量pcr仪中进行的。

根据本发明的实施例，荧光强度随循环数的增加而增加，是待测样品中具有酶活性的dnase1l3蛋白的指示。

在本发明的第二方面，本发明提出了taqman双链探针在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于体外检测待测样品中是否含具有酶活性的dnase1l3蛋白。

附图说明

图1是根据本发明实施例的设计原理图；

图2是根据本发明实施例的dnase1l3蛋白凝胶电泳图；

图3是根据本发明实施例的dnase1l3蛋白降解gfp表达质粒，使转入细胞的质粒显著减少的结果图；

图4是根据本发明实施例的dnase1l3在不同温度下对荧光释放的影响的结果图；

图5是根据本发明实施例的无关蛋白2在不同温度下对荧光释放的影响的结果图；

图6是根据本发明实施例的无关蛋白1在37℃对taqman探针荧光释放的影响的结果图；

图7是根据本发明实施例的无关蛋白2在37℃对taqman探针荧光释放的影响的结果图；以及

图8是根据本发明实施例的dnase1l3在37℃对taqman探针荧光释放的影响的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1dnase1l3蛋白表达质粒的构建

其中，质粒中所含表达dnase1l3蛋白的核酸序列如seqidno:3所示。

gccaccatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattcggactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaaggggggtggaggctctatgaggatctgctccttcaacgtcaggtcctttggggaaagcaagcaggaagacaagaatgccatggatgtcattgtgaaggtcatcaaacgctgtgacatcatactcgtgatggaaatcaaggacagcaacaacaggatctgccccatactgatggagaagctgaacagaaattcaaggagaggcataacgtacaactatgtgattagctctcggcttggaagaaacacatataaagaacaatatgcctttctctacaaggaaaagctggtgtctgtgaagaggagttatcactaccatgactatcaggatggagacgcagatgtgttttccagggagccctttgtggtctggttccaatctccccacactgctgtcaaagacttcgtgattatccccctgcacaccaccccagagacatccgttaaggagatcgatgagttggttgaggtctacacggacgtgaaacaccgctggaaggcggagaatttcattttcatgggtgacttcaatgccggctgcagctacgtccccaagaaggcctggaagaacatccgcttgaggactgaccccaggtttgtttggctgatcggggaccaagaggacaccacggtgaagaagagcaccaactgtgcatatgacaggattgtgcttagaggacaagaaatcgtcagttctgttgttcccaagtcaaacagtgtttttgacttccagaaagcttacaagctgactgaagaggaggccctggatgtcagcgaccactttccagttgaatttaaactacagtcttcaagggccttcaccaacagcaaaaaatctgtcactctaaggaagaaaacaaagagcaaacgctcctaa(seqidno:3)

其中，

“gccacc”为kozak序列，

“atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattcg”为il2信号肽序列，

“gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaag”为flag标签序列，

“gggggtggaggctct”为连接肽序列，

“atgaggatctgctccttcaacgtcaggtcctttggggaaagcaagcaggaagacaagaatgccatggatgtcattgtgaaggtcatcaaacgctgtgacatcatactcgtgatggaaatcaaggacagcaacaacaggatctgccccatactgatggagaagctgaacagaaattcaaggagaggcataacgtacaactatgtgattagctctcggcttggaagaaacacatataaagaacaatatgcctttctctacaaggaaaagctggtgtctgtgaagaggagttatcactaccatgactatcaggatggagacgcagatgtgttttccagggagccctttgtggtctggttccaatctccccacactgctgtcaaagacttcgtgattatccccctgcacaccaccccagagacatccgttaaggagatcgatgagttggttgaggtctacacggacgtgaaacaccgctggaaggcggagaatttcattttcatgggtgacttcaatgccggctgcagctacgtccccaagaaggcctggaagaacatccgcttgaggactgaccccaggtttgtttggctgatcggggaccaagaggacaccacggtgaagaagagcaccaactgtgcatatgacaggattgtgcttagaggacaagaaatcgtcagttctgttgttcccaagtcaaacagtgtttttgacttccagaaagcttacaagctgactgaagaggaggccctggatgtcagcgaccactttccagttgaatttaaactacagtcttcaagggccttcaccaacagcaaaaaatctgtcactctaaggaagaaaacaaagagcaaacgctcctaa”为编码dnase1l3蛋白的序列。

实施例2dnase1l3蛋白的表达与浓缩

将实施例1的序列构建入cmv启动子下游，得到受cmv启动子控制的dnase1l3表达质粒。将15μg质粒与20μllipofectamine2000转染试剂(#11668019，thermofisherscientific)混合，按照说明书，将dnase1l3表达质粒转染入293t细胞中。转染12小时后，将全细胞培养基换成无血清细胞培养基，再过24小时，收集细胞培养液，通过透析管对含有dnase1l3蛋白的培养基进行浓缩。我们也构建了与dnase1l3无关的对照蛋白，包括gfp蛋白表达质粒和pdgfa表达质粒，也进行了同样的转染和浓缩实验。所得样品进行过滤除菌后存放于4℃。取少量所得样品进行western实验，用flag抗体检测dnase1l3的浓缩效果(图2)。结果显示带有flag标签的dnase1l3能够被显著富集。

实施例3dnase1l3蛋白降解质粒dna

等量的dnase1l3浓缩液或无关蛋白浓缩液分别与等量gfp表达质粒孵育30分钟后，再用lipofectamine2000转染试剂转染293t细胞，24小时候用荧光显微镜观察绿色荧光(图3)。结果显示，dnase1l3可以显著降低gfp质粒的表达，说明dnase1l3可以降解质粒dna。

实施例4taqman探针合成

正向探针序列：

fam-5’-aaagggaaagggaaagggaaagggaaagggaaagggaa-3’-bhq1(fam——荧光报告基团；bhq1——荧光淬灭基团)

反向探针序列：

5’-ttccctttccctttccctttccctttccctttcccttt-3’

实施例5dnase1l3蛋白降解taqman探针与数据采集

所得正向和反向探针首先进行等量的退火反应，由单链变为双链。在荧光定量pcr仪中，将2ug探针与1ug蛋白分别在37℃、25℃、4℃孵育，每3分钟采集一次荧光，共采集75次。结果显示dnase1l3能够在37℃有效降解taqman探针，使被淬灭的荧光得以释放(图4)。dnase1l3在25℃也有活性，但比在37℃时明显降低(图4)。dnase1l3在4℃时没有表现出活性(图4)。其他无关蛋白在三个温度都不具有这一活性(图5)。37℃条件下，无关蛋白1(图6)和无关蛋白2(图7)都不能引起荧光释放，但dnase1l3处理可以检测到显著的荧光释放(图8)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

sequencelisting

<110>浙江帝格生物科技有限责任公司

<120>体外检测dnase1l3蛋白的方法

<130>pidc3195842

<160>3

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>taqman双链探针的正向探针

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<212>dna

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<223>taqman双链探针的反向探针

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<211>1005

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>表达dnase1l3蛋白的核酸序列

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