一种CHO细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用与流程

文档序号：21407372发布日期：2020-07-07 14:41阅读：495来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种cho细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用。

背景技术：

中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary,cho)细胞表达系统是目前药用重组蛋白(抗体)等生物医药研发和生产的重要平台，是目前应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。cho细胞具有易进行遗传改造和扩增、易被转染、正确的蛋白折叠和糖基化修饰、产物可分泌表达并易于纯化、悬浮培养、细胞密度较高、可大规模生产等方面的优势。在重组药物蛋白工业化生产中，从cho重组表达种子细胞库扩大培养至大型生物反应器规模，细胞至少需要稳定传代培养30代。然而在长期传代培养过程中仍存在重组蛋白表达不稳定性、甚至表达量显著下降的问题，即不同重组cho细胞克隆之间转基因表达水平、稳定性存在差异。由于细胞克隆间的这种表达不稳定性和表型高度异质性，使得筛选获得稳定高效表达的cho细胞系费时费力且不可预测，造成研发和生产周期长、细胞大规模培养成本高，已成为制约重组药物蛋白工业化生产的“卡脖子”技术和“瓶颈”问题。因此，利用基因和细胞工程的方法对cho细胞表达系统进行优化改造并建立高效稳定的表达体系，不仅可以提高目的蛋白的表达水平和表达稳定性，还能有效地缩短研发周期、节省大量的生产成本，极大地推动生物制药行业的发展。

腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adeninephosphoribosyltransferase,aprt)是生物体内atp合成的补救途径中催化腺嘌呤碱基转化为腺嘌呤核苷一磷酸(amp)的关键酶。利用aprt基因突变株对2,6-diaminopurine(dap，二氨基嘌呤)或氮杂腺嘌呤(azaadenine)具有抗性作用，可以对aprt基因缺陷型细胞进行筛选验证。相反，具有aprt活性的细胞可在alasa培养基中生长，该培养基含有亚硝基羟基丙氨酸(alanosine)、重氮丝氨酸(azaserine)、腺嘌呤(adenine)，从头合成途径被药物alanosine(al)和azaserine(as)阻断，细胞依赖于腺嘌呤的补救途径而存活。

目前研究中，未见通过crispr/cas9基因编辑技术敲除cho细胞的aprt基因筛选获得aprt缺陷型细胞株，进而用于重组蛋白高效稳定表达的报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种cho细胞系，敲除表达腺嘌呤磷酸核糖转移酶的基因序列，获得aprt基因缺陷型cho细胞系，利用该细胞系进行重组蛋白表达时，具有表达量更高、长期表达更稳定的优点。

本发明的目的之二在于提供一种cho细胞系的构建方法，能够高效构建获得arpt基因缺陷型cho细胞系。

本发明的目的之三在于提供上述aprt基因缺陷型cho细胞系应用于重组蛋白表达，高效稳定表达重组蛋白。

本发明的目的之四在于提供一种重组蛋白表达系统，该系统由含aprt弱化表达盒和目的基因表达盒的表达载体转染本发明aprt缺陷型cho细胞而建立，能够高效稳定地表达目的蛋白

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种经基因敲除改造而不表达腺嘌呤磷酸核糖转移酶aprt的cho细胞系。

进一步的，上述cho细胞系为经基因编辑技术敲除aprt基因的cho细胞系，其中aprt基因序列如seqidno.1所示。

可选的，所述cho细胞系选自cho-k1、cho-s或cho-106。

上述cho细胞系的构建方法，包括利用crispr/cas9基因编辑技术敲除aprt基因。

进一步的，上述cho细胞系的构建方法，包括以下操作步骤：

1)确定打靶位点：根据ncbi的genebank中仓鼠腺嘌呤磷酸核糖转移酶aprt基因序列no.x03603.1，设计两个打靶位点sgrna序列；在aprt基因敲除时，能够敲除两个靶位点之间的序列，造成大片段的缺失，大片段缺失后的aprt基因的功能完全丧失；

2)sgrna载体的构建：将步骤1)设计的sgrna序列添加粘性末端并合成2对4条引物，将配对的引物退火获得对应的带有粘性末端的双链dna片段，将双链dna片段分别连接到两个带有不同荧光报告基因crispr/cas9系统表达载体中，获得两个crispr/cas9-sgrna载体；

3)将两个crispr/cas9-sgrna载体共同转染至cho细胞中；流式分选挑选包含两种荧光报告基因信号的单克隆细胞进行培养，经过敲除细胞aprt基因的pcr扩增和测序验证，即得。

进一步的，上述步骤1)中设计两个打靶位点sgrna序列的操作步骤包括：

a：根据选定的aprt基因组序列设计扩增引物，进行aprt基因片段pcr扩增，扩增引物序列为：

aprt-pcr-l：5'-ccaggctttcaatttgaggt-3'，如seqidno.2所示；

aprt-pcr-r:5'-actcatccagggtcaacgag-3'，如seqidno.3所示；

将pcr扩增片段进行克隆测序验证序列的准确性，验证得到的扩增序列如seqidno.4所示；

b：为了提高基因敲除的效率，应用在线工具辅助设计aprt基因的sgrna打靶位点序列：

aprtfw1：5'-gcagtctcggggatcttgtgggg-3'，如seqidno.5所示；

aprtfw2：5'-agtcaccttaagtccacgcatgg-3'，如seqidno.6所示。

sgrna表达载体使用的是u6启动子，如果在基因转录的起始位点有碱基g存在，则基因的表达量会有显著提高，所以步骤2)中具有粘性末端的引物的上游引物的5'端具有碱基g，对应的下游引物的3'端具有碱基c；如果上游引物的5'起始碱基不是g，则需要额外添加一个碱基g，对应的下游引物3'末端需要添加一个碱基c，以保证基因维持较高的表达量。

可选的，步骤2)中通过使用限制性内切酶bbsi分别将crispr/cas9系统表达载体px458-ecfp(带有荧光蛋白ecfp基因)和px458-dsred2(带有荧光蛋白dsred2基因)dna线性化并纯化回收，获得具有粘性末端的载体dna片段；然后将根据步骤1)设计的sgrna序列合成的带有粘性末端的双链dna片段与获得的具有粘性末端的载体dna片段连接、转化和筛选获得crispr/cas9-sgrna载体。

进一步的，为了获得稳定的基因敲除单克隆细胞，步骤3)中将两个crispr/cas9-sgrna载体共同转染至cho细胞72h后，通过流式细胞仪分选出dsred2和ecfp荧光双阳性的单细胞，培养14d后，继续扩大培养，并做后续pcr扩增验证分析。可选的，pcr扩增验证用扩增引物序列为步骤3)a中的aprt-pcr-l和aprt-pcr-r；对于未基因敲除改造的cho细胞系，该引物扩增的片段大小为738bp，在验证时，如扩增片段明显小于738bp，说明cho细胞系中的aprt基因得到了大片段的敲除。

上述cho细胞系能够应用于构建重组蛋白表达系统。

优选的，上述重组蛋白表达系统，其构建方法包括将aprt基因弱化表达盒插入到含有目的蛋白基因表达盒的表达载体中，构建重组蛋白表达载体，将该重组蛋白表达载体转染至上述cho细胞系，经筛选得到重组cho-aprt细胞，重组cho-aprt细胞能够高效稳定表达目的蛋白。

本发明cho细胞系，经基因敲除改造而不表达腺嘌呤磷酸核糖转移酶，具体的敲除如seqidno.1所示的aprt基因，得到aprt基因缺陷型cho细胞系，将本发明cho细胞系应用于构建重组蛋白表达系统，能够显著提高cho细胞中目的基因的表达量和长期表达稳定性，克服了目前cho细胞表达系统存在的表达不稳定的问题。

利用本发明aprt基因缺陷型cho细胞系构建重组蛋白表达系统进行重组蛋白表达时，无论是否存在g418筛选压力情况下，本发明第60代aprt基因缺陷型cho细胞构建的重组蛋白表达系统中目的蛋白egfp的表达维持率均高于100％，远高于正常重组cho细胞中egfp的表达维持率(低于57％)；在无g418筛选压力时，利用本发明aprt基因缺陷型cho细胞构建的重组蛋白表达系统第30代细胞中重组玻璃粘连蛋白(vitronectin,vtn)(314.22±25.14ng/ml)的表达量显著高于正常cho细胞中相应目的蛋白的表达量(239.14±19.13ng/ml)。

附图说明

图1为本发明实施例1中cho细胞aprt基因敲除单克隆细胞系筛选pcr扩增结果图；

图2为本发明实施例2中cck-8法检测aprt缺陷型cho单克隆细胞株及正常cho细胞增殖结果对比图；

图3为ef-1α启动子驱动的真核表达载体pwty3g-egfp示意图；

图4为本发明实施例3中aprt缺陷型细胞和正常cho细胞分别转染不含aprt弱化表达盒表达载体(正常载体)、含有aprt弱化表达盒表达载体(弱化载体)后筛选获得重组cho细胞中，荧光定量pcr(qpcr)检测aprt基因拷贝数相对量结果图；

图5为本发明实施例3中aprt缺陷型细胞和正常cho细胞分别转染不含aprt弱化表达盒表达载体(正常载体)、含有aprt弱化表达盒表达载体(弱化载体)，筛选获得重组cho细胞中egfp表达荧光对比例图；

图6位本发明实施例3中aprt缺陷型细胞和正常cho细胞分别转染不含aprt弱化表达盒表达载体(正常载体)、含有aprt弱化表达盒表达载体(弱化载体)，筛选获得重组cho细胞中egfp表达量对比例图；

图7为本发明实施例3中目的蛋白egfp在重组aprt缺陷型cho细胞和正常cho细胞中长期表达60代表达维持率实验结果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。下述实施例中cho细胞选自市售的cho106细胞。

实施例1构建aprt基因缺陷型的cho细胞系

本实施例中aprt基因缺陷型的cho细胞系，其构建方法包括如下步骤：

1、针对候选基因确定打靶位点

1)扩增arpt基因的部分序列：

根据ncbi的genbank中aprt基因组序列(no.x03603.1,如seqidno.1所示)设计扩增引物：

aprt-pcr-l：5'-ccaggctttcaatttgaggt-3'(如seqidno.2所示)；

aprt-pcr-r:5'-actcatccagggtcaacgag-3'(如seqidno.3所示)；

对aprt基因片段进行pcr扩增，将pcr扩增片段进行克隆测序验证序列的准确性，验证得到的扩增序列如seqidno.4所示。

2)确定sgrna打靶位点序列：

应用在线工具(http://crispr.mit.edu/)辅助设计的aprt基因的sgrna打靶位点序列如下：

aprtfw1：5'-gcagtctcggggatcttgtgggg-3'(如seqidno.5所示)；

aprtfw2：5'-agtcaccttaagtccacgcatgg-3'(如seqidno.6所示)。

2、sgrna表达载体的构建

1)设计合成引物：根据上述步骤1的sgrna打靶位点序列设计合成2对4条引物，并在引物序列的5'端添加粘性末端；

需要说明的是，因sgrna表达载体使用的是u6启动子，如果在基因转录的起始位点有碱基g存在，则基因的表达量会有显著提高，所以在引物设计过程中，如果上游引物的5'起始碱基不是g，则需要额外添加一个碱基g，以保证基因维持较高的表达量，此种情形下，其对应的下游引物3’末端需要添加一个碱基c；

2)引物退火配对获得双链dna片段：将步骤1)中合成的2对引物用于退火配对获得带有粘性末端的双链dna片段。具体操作如下：先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系(10.0μl)为：引物(100μm)各1.0μl、10×t4ligationbuffer(neb)1.0μl、t4polynucleotidekinase(nebm0201s)0.5μl，ddh2o6.5μl，配制好反应体系并充分混匀，置于37℃孵育30min；将反应产物转移至pcr仪中进行变性和退火，反应程序如下：95℃变性5min，95℃-25℃(降温退火-5℃/min)；

3)线性化crispr/cas9系统表达载体：使用限制性内切酶bbsi分别将crispr/cas9系统表达载体px458-ecfp(带有荧光蛋白ecfp基因)和px458-dsred2(带有荧光蛋白dsred2基因)dna线性化并纯化回收，获得具有粘性末端的载体dna片段，酶切体系如下：px458-dsred2质粒或px458-ecfp质粒1.0μg、10×nebbuffer2.13.0μl、bbsi(neb)1.0μl、补充ddh2o至总体积30.0μl，置于37℃孵育2h；酶切完成后使用qiaquickpcrpurificationkit纯化酶切产物并用并ddh2o30.0μl溶解回收；

4)构建sgrna表达载体：通过连接反应、转化和筛选获得含有sgrna的crispr/cas9表达载体。具体实验操如下，连接反应体系：步骤2)获得的带有粘性末端的双链dna片段0.5μl和步骤3)中获得的具有相同粘性末端的载体dna2.0μl、t4dna连接酶(nebm0202s)0.5μl、10×t4ligationbuffer(neb)1.0μl、补充ddh2o至总体积10.0μl，反应1h后转化大肠杆菌dh5α并涂布氨苄青霉素抗性平板，置于37℃培养箱进行过夜培养，次日挑选单菌落进行测序验证，测序结果完全正确的质粒即可得到分别表达有ecfp的表达载体px458-aprt-1和表达有dsred2的表达载体px458-aprt-2。

3、cho细胞转染、基因敲除单克隆细胞系筛选及验证

将上述构建好的px458-aprt-1和px458-aprt-2表达载体等质量混合，利用脂质体介导的转染方式转染cho106细胞并筛选、验证aprt基因敲除的单克隆细胞系：

具体实验操作如下：1)将cho106细胞在含10％灭活胎牛血清的dmem-f12培养基中于37℃和5％co2条件下进行生长培养，转染前将2.0×10⁵个cho106细胞接种于24孔培养板中，铺板培养24h后当细胞融合度达到约90％时用于细胞转染。

2)将px458-aprt-1和px458-aprt-2载体dna各取1.5μg，加入到150.0μl减血清培养基(opti-mem)中进行稀释；取0.75μl脂质体lipofectamine3000稀释于150.0μl减血清培养基(opti-mem)中，然后将脂质体稀释液加入至表达载体dna稀释液中并充分混匀，置于室温条件下孵育20min；

3)将步骤1)中24孔板中接种培养细胞的培养基弃去，并将步骤2)孵育后的表达载体dna和脂质体混合液分别按300μl/孔加入cho106细胞中，另加三孔以作平行对照组和未加入转染混合液的细胞作为阴性对照组；所有细胞在37℃和5％浓度co2培养箱中孵育1.5h后，弃去培养基，更换新鲜的培养基继续培养；

4)为了获得稳定的基因敲除单克隆cho106细胞，转染72h后，通过流式细胞仪将dsred2和ecfp荧光双阳性的单克隆cho106细胞分选至已加有150μl新鲜培养基的96孔细胞培养板中，培养14d后，将单克隆cho106细胞转移至48孔细胞培养板中继续扩大培养并做后续pcr扩增验证分析，通过验证分析的单克隆cho106细胞即为构建成功的aprt基因缺陷性cho细胞；

其中pcr扩增验证分析的具体步骤包括：

a：单克隆细胞基因组dna的提取：取少量细胞(约100-1000万即可)，离心(350g、5min)，弃上清液，保留底部细胞沉淀，加入20.0μl细胞裂解液(100mmkcl、20mmtris-hclph9.0、0.3％tritonx-100、1.0mg/ml蛋白酶k)，使用移液器将细胞轻轻吹打混匀，置于55℃孵育15min，使细胞充分裂解，转移至95℃孵育10min，使蛋白酶k变性，此裂解液即含有细胞基因组dna可作为pcr模板使用，置于-20℃保存备用；

b：利用aprt-pcr-l(如seqidno.2所示)和aprt-pcr-r(如seqidno.3所示)进行pcr扩增包含打靶位点的目的片段，并通过pcr产物分析以检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入；

本实施例中琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物结果如图1所示，wt为阳性质粒对照，nc为空白阴性对照，m为dna分子量标记；其中8、14号单细胞克隆为大片段缺失纯合子。进一步的测序结果比对表明8、14号单细胞克隆即为aprt基因敲除细胞株。将已验证的基因敲除单克隆细胞株扩大培养、液氮冻存保种。

实施例2实施例1制备的aprt基因缺陷型cho细胞的生物学特性验证

1、验证方法：通过检测细胞增殖和倍增时间等细胞生物学特性验证缺陷型细胞系能否进行正常的生长和传代培养。以野生型cho106细胞作为对照，对实施例1制备的aprt基因缺陷型cho细胞单克隆进行细胞生长特性验证，包括细胞形态和生长状态观察、cck-8法检测细胞增殖情况，验证实施例1制备的aprt基因缺陷型cho细胞系能否进行正常的生长和传代培养。

2、验证结果：采用cck-8试剂盒(cellcountingkit-8试剂盒，碧云天beyotime生物技术有限公司)检测细胞增殖情况，结果如图2所示。

实验结果表明，本发明aprt基因缺陷型cho细胞株细胞生长状态、形态、细胞增殖、倍增时间等生物学特性与正常cho细胞无显著性差别，能够正常进行生长增殖和传代培养。

实施例3利用本发明实施例1构建的aprt基因缺陷性cho细胞进行目的基因egfp的表达系统构建及表达分析

1、aprt弱化载体pwty3g-aprt-egfp-mut的构建

本发明以真核表达载体piresneo2(clontech公司)为基础载体，构建由ef-1α启动子驱动表达绿色荧光蛋白(egfp)的真核表达载体pwty3g-egfp(见图3)，其序列如seqidno.7所示。合成由弱化sv40启动子驱动及起始密码子突变的aprt基因表达盒序列(如seqidno.8所示)并插入到基础载体ef-1α启动子的上游，构建好的真核表达载体可同时表达egfp和弱化的aprt，命名为pwty3g-aprt-egfp-mut，其序列如seqidno.9所示。

2、cho细胞转染

实验用细胞分为两组实施例1构建的aprt基因缺陷型cho106细胞和正常对照cho106细胞。培养两个实验组cho细胞，细胞转染前1天，以2×10⁵细胞密度传代到新鲜的含10％灭活胎牛血清的dmem培养基，待细胞融合度达90％时即可用lipofectamine3000(invitrogen，usa)进行转染。将两组实验组cho细胞转染的载体质粒分别为不含弱化aprt基因表达盒的对照载体pwty3g-egfp和步骤1构建的aprt弱化载体pwty3g-aprt-egfp-mut，每种质粒平行转染3个复孔，转染后筛选获得各组重组cho细胞中aprt基因拷贝数相对量对比结果如图4所示。

3、转染细胞株瞬时表达观察

在步骤2)两组细胞两种质粒分别转染48h后，倒置荧光显微镜观察瞬时转染两组细胞中egfp的表达情况。

结果表明，两种表达载体在aprt基因缺陷型和正常cho106细胞转染效率相当，两者egfp表达阳性细胞率无明显差别(如图5所示)。这说明aprt基因敲除对细胞转染效率无显著影响。筛选获得稳定转染的第一代重组cho细胞池，其中含有aprt基因弱化表达载体的aprt敲除细胞中egfp表达量显著高于正常对照组和基因敲除对照组细胞(如图6所示)。

4、稳定表达多克隆cho细胞株筛选及egfp长期稳定表达分析

加g418进行重组cho细胞筛选，筛选培养两周后获得的稳定转染的重组cho多克隆细胞池(cellpools)。将各组重组cho多克隆细胞池在有筛选压力(加g418，记为g418⁺)和无筛选压力(不加g418，记为g418^-)下传代培养60代，分别将各组cho细胞按照每个样本10⁶个细胞进行流式细胞仪检测分析，测定重组cho细胞中egfp的平均荧光强度(meanfluorescenceintensity,mfi)。

流式检测结果表明，按照衡量表达量稳定性的判断标准(与第1代细胞中egfp表达量相比，第60代细胞重组蛋白egfp的表达维持率要高于70％)，无论是否存在g418筛选压力，第60代本发明重组aprt基因缺陷型cho细胞中转染aprt弱化表达载体的egfp表达稳定性显著高于重组正常cho细胞(如图7，p＜0.05)。

实施例4利用本发明实施例1构建的aprt基因缺陷性cho细胞进行目的基因玻璃粘连蛋白(vitronectin,vtn)的表达系统构建及表达分析

以上述实施例3构建的aprt弱化表达载体为pwty3g-aprt-egfp-mut为基础载体，用玻璃粘连蛋白(vtn)序列(如seqidno.10所示)替换基础载体中的egfp序列，构建表达vtn和弱化aprt的载体pwty3g-ap/vitin-m，对照载体为不含弱化aprt表达盒只表达vtn的载体pwty3g-vtn。

将构建的表达载体质粒分别转染本发明实施例1构建的aprt基因缺陷型cho细胞和正常cho细胞。转染后的细胞在含有g418(800μg/ml)的培养基中培养两周以筛选稳定转染的重组细胞池(cellpools)，每隔3天将各重组cho细胞进行传代培养至30代。随后将重组cho细胞在125ml培养摇瓶中用30ml无蛋白、无血清、化学成分确定的cdcho培养基(lifetechnologies公司，培养基中含8mm的l-谷氨酰胺)培养6天至细胞数达到1.5×10⁷，每天收集细胞通过biotech细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)检测细胞密度和活力，第6天离心收集上清液用于重组玻璃粘连蛋白表达elisa检测分析。

结果表明，在无g418筛选压力条件下，利用本发明实施例1构建的aprt基因缺陷性cho细胞构建的重组蛋白表达系统第30代细胞中重组玻璃粘连蛋白(vitronectin,vtn)(314.22±25.14ng/ml)的表达量显著高于正常cho细胞中相应目的蛋白的表达量(239.14±19.13ng/ml)，表达量差异均具有统计学意义(p<0.05)。结果表明本发明构建的aprt基因缺陷型cho细胞可明显提高重组玻璃粘连蛋白的表达水平和表达稳定性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110>新乡医学院

河南医学高等专科学校

河南普诺易生物制品研究院有限公司

<120>一种cho细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用

<141>2020-03-20

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>11

<211>3960

<212>dna

<213>天然序列(naturalsequence)

<400>11

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