本发明涉及一种色谱分离技术，具体说是病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质及其应用方法。
背景技术：
：病毒是重要的疫苗种类，选用免疫原性好的病毒，经人工培养，再用物理或化学方法将其灭活制成疫苗。传统上的病毒纯化主要通过硫酸铵、醋酸锌、磷酸铝等沉淀方法以及密度梯度离心进行。虽然沉淀方法简易，但是分辨率较低，不能够有效去除宿主dna等杂质。而密度梯度离心虽然分辨率高，但操作周期较长，放大生产需要重复购买昂贵设备。因此这两种方法在生产上越来越多的被色谱技术所替代。在疫苗的纯化中应用最多的是凝胶过滤色谱和离子交换色谱。由于病毒结构复杂、稳定性差，易失活的特点，要求层析介质的孔径要与病毒颗粒体积相适应，一般要大于病毒颗粒直径10~20倍。目前，传统的层析介质孔径较小，普遍低于200nm，甚至低于50nm，而病毒颗粒的大小一般都在20nm以上，导致传统层析介质对于病毒颗粒的载量相比蛋白载量仅有百分之一甚至更低。而且，病毒在狭窄的层析介质孔径内很容易发生结构变化、聚集或解聚，造成活性损失、免疫原性降低。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质及其应用方法，该层析介质对病毒颗粒的载量较高；采用该层析介质纯化病毒后，病毒活性不会损失、免疫原性较高。为解决上述问题，提供以下技术方案：本发明的病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质的特点是所述超大孔径层析介质的基材为聚苯乙烯-二乙烯苯微球，聚苯乙烯-二乙烯苯微球的孔径≥4000å，粒径≥60μm；所述基材表面修饰亲和功能基团。其中，所述聚苯乙烯-二乙烯苯微球的孔径在4000å~7000å之间。所述聚苯乙烯-二乙烯苯微球的粒径在60~100μm之间。所述亲和功能基团为硫酸酯。所述超大孔径层析介质的纯化收率≥70%。所述基材的表面需要做亲水层修饰。本发明的病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质的应用方法的特点包括如下步骤：首先，将超大孔径层析介质装入到玻璃柱中；接着，用平衡液对玻璃柱内进行平衡；然后，将含有病毒颗粒的样品上样到玻璃柱内的超大孔径层析介质上；之后，再次用平衡液对玻璃柱内的超大孔径层析介质进行清洗；最后，用洗脱液对玻璃柱内的超大孔径层析介质进行洗脱，收集洗脱组分即为纯化后的病毒颗粒。采取以上方案，具有以下优点：由于本发明的超大孔径层析介质的基材为聚苯乙烯-二乙烯苯微球，亲水性聚苯乙烯-二乙烯苯微球的孔径≥4000å，粒径≥60μm，基材表面修饰亲和功能基团。本发明的超大孔径层析介质的孔径显著大于传统层析介质，超大孔径层析介质有效克服了传统层析介质的缺点，孔内对流传质削弱了扩散传质速度慢的影响，降低了传质阻力，提高传质速率，同时增加了吸附病毒的有效表面积，也降低了病毒颗粒在纯化过程中结构不稳定的问题，从而大大提高了对病毒颗粒的载量，且确保纯化后的病毒活性不会损坏，免疫原性较高。具体实施方式以下对本发明做进一步详细说明。本发明的病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质的基材为聚苯乙烯-二乙烯苯微球，聚苯乙烯-二乙烯苯微球的孔径≥4000å，粒径≥60μm。所述基材表面修饰亲和功能基团。所述聚苯乙烯-二乙烯苯微球的孔径在4000å~7000å之间。所述聚苯乙烯-二乙烯苯微球的粒径在60~100μm之间。所述亲和功能基团为硫酸酯。所述超大孔径层析介质的纯化收率≥70%。所述基材的表面需要做亲水层修饰。本发明的病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质的应用方法包括如下步骤：首先，将超大孔径层析介质装入到玻璃柱中。接着，用平衡液对玻璃柱内进行平衡。然后，将含有病毒颗粒的样品上样到玻璃柱内的超大孔径层析介质上。之后，再次用平衡液对玻璃柱内的超大孔径层析介质进行清洗。最后，用洗脱液对玻璃柱内的超大孔径层析介质进行洗脱，收集洗脱组分即为纯化后的病毒颗粒。本发明的超大孔径层析介质的孔径显著大于常规层析介质，有效克服了常规层析介质的缺点，孔内对流传质削弱了扩散传质速度慢的影响，降低了传质阻力，提高传质速率，同时增加了吸附病毒的有效表面积，也降低了病毒颗粒在纯化过程中结构不稳定的问题。下表是采用本发明的病毒颗粒纯化用超大孔径（635nm）层析介质纯化狂犬病毒的测试结果序号体积mlgpg滴度ui/ml总gpgui样品305.82174.6流穿液3000洗脱液342.7128.1从上表面可见，用超大孔径层析介质纯化狂犬病毒，流穿液中无目标病毒组分，计算洗脱液中gpg含量/样品中gpg含量，回收率达到73.3%。下表是用传统孔径（30nm）的层析介质（纤维素亲和填料）纯化狂犬病毒测试结果序号体积mlgpg滴度ui/ml总gpgui样品305.82174.6流穿液302.163洗脱液514.974.5从上表面可见，传统30nm小孔的层析介质在纯化狂犬病毒时，收率仅有42.7%。下表是用传统孔径（50nm）的层析介质（琼脂糖亲和填料）纯化狂犬病毒测试结果序号体积mlgpg滴度ui/ml总gpgui样品305.82174.6流穿液302.5275.6洗脱液512.5462.7从上表面可见，传统50nm小孔的层析介质在纯化狂犬病毒时，收率仅有35.9%。当前第1页12