本发明涉及水产抗病毒微生态制剂技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌yfi-4及其在抗淡水养殖动物病毒病中的应用。
背景技术：
2019年全国渔业统计年鉴显示，我国水产养殖总产量为6457万吨，而淡水鱼类养殖产量为3156万吨，占水产养殖总量的49％。但是，随着我国水产养殖业的快速发展，淡水养殖动物病毒病的危害日趋严重，每年造成的经济损失达数百亿元，已经成为水产养殖业健康可持续发展的瓶颈。常见的淡水养殖动物病毒病有：草鱼出血病、锦鲤疱疹病毒病、鲫造血器官坏死症、斑点叉尾鮰呼肠孤病毒病、大鲵虹彩病毒病等。
当前，用于防治淡水养殖动物病毒病的方法主要有药物防治和疫苗免疫两种。然而药物防治引起的副作用、药物残留、耐药性以及水体污染等一系列问题逐渐受到社会各界的普遍重视，除此之外，药物防治针对病毒性疾病的治疗效果不十分明显；受敏感细胞系缺乏、病毒变异、免疫方式不便的影响，渔用疫苗的发展受到影响。因此，需要不断寻求可控制病毒性疾病的有效方法，益生菌因其无毒、无抗药性、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全的优点受到广泛关注。
目前，关于益生菌抗水产病毒也有部分报道，申请人于2019年针对可抵抗水产病毒的益生菌，做了一系列的申请，例如申请号为201910763441.x，报道了一株干酪乳杆菌yfi-5可以抗鲤疱疹病毒ii型，申请号为201910765613.7的申请，报道了一株鼠李糖乳杆菌yfi-6可以抗大鲵虹彩病毒。另外，申请号为201880004885.9的申请，报道了一种含有贝莱斯芽孢杆菌的复合微生态制剂，其可显著降低虾的由于副溶血弧菌感染，或者wssv感染引起的疾病死亡率。但上述病毒存在抗病毒谱窄，适用范围窄的问题，不利于工业上的大型推广。对于贝莱斯芽孢杆菌对于抗水产病毒的报道，尚未检索到；目前仅申请号为201910297167.1,201811371200.2公开了贝莱斯芽孢杆菌可抗植物病毒。
本发明首次从养殖水体中筛选出一株抗病毒谱更广的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4，该菌株可以对淡水养殖动物病毒具有抑制作用，对细胞低毒，为淡水养殖动物病毒病的防治提供了新产品。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种贝莱斯芽孢杆菌yfi-4，所述的菌株的保藏编号为：cctccno：m2019653。
本发明的另一个目的在于提供了贝莱斯芽孢杆菌yfi-4的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4是从健康鲫鱼肠道中分离得到。具体是解剖健康鲫鱼后取出肠道。挤压肠道，排出其肠道内容物后，将肠道剪开，用无菌刀片刮肠道内壁，获得肠道内壁样品。用磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)将肠道内壁品连续10倍倍比稀释6次，用移液枪分别在各个浓度梯度稀释液中吸取溶液100μl到bhi固体平板上，用涂布棒涂匀、编号，并做3个重复。将平板倒置后，置于30℃恒温培养箱中培养24h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化，并且对不同的菌进行抗病毒功能的测定，最终获得了一株可抗淡水养殖动物病毒的菌株，命名为yfi-4，菌株yfi-4经生理生化特征测定和16srdna序列同源性分析，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。
该菌株已于2019年8月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)yfi-4，保藏编号：cctccno：m2019653，地址：中国武汉武汉大学。
贝莱斯芽孢杆菌yfi-4的应用，包括利用贝莱斯芽孢杆菌yfi-4或其发酵上清液制备成治疗或预防淡水养殖动物病毒病药物，或制备成治疗或预防由淡水养殖动物病毒感染引起的疾病的药物，或是制备成抗淡水养殖动物病毒制剂；
上述应用中，优选的，所述的发酵上清液是通过贝莱斯芽孢杆菌yfi-4在bhi液体培养基中发酵后过滤获得。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明中用贝莱斯芽孢杆菌yfi-4抑制淡水养殖动物病毒对细胞的感染，贝莱斯芽孢杆菌yfi-4作为潜在的抗病毒微生态制剂与传统的抗病毒化学药物相比较具有如下优点：
1、无毒副作用、无残留、抗病毒、促生长、绿色安全。
2、具有使用方便、安全、无免疫应激、经济效益高等优点
3、通过口服的方式进入水产养殖，抑制淡水养殖动物病毒的入侵和增殖，有效预防和治疗淡水养殖动物病毒病。本发明中贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液对细胞无毒副作用。贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液对病毒有直接抑制作用，对鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)、锦鲤疱疹病毒(khv)、大鲵虹彩病毒(gsiv)的最高抑制率分别为48％、46％、52％。
具体实施方式
本发明实施例中试验方法和条件如无特别说明，均为常规方法。这些实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围不受这些实施例的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
菌株yfi-4分离鉴定
1、菌株yfi-4分离及鉴定
菌株yfi-4是从健康鲫鱼肠道中分离得到。具体是解剖健康鲫鱼后取出肠道。挤压肠道，排出其肠道内容物后，将肠道剪开，用无菌刀片刮肠道内壁，获得肠道内壁样品。用磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)将肠道内壁品连续10倍倍比稀释6次，用移液枪分别在各个浓度梯度稀释液中吸取溶液100μl到bhi固体平板上，用涂布棒涂匀、编号，并做3个重复。涂布均匀后在超净工作台中放置5～10min，使培养基表面菌液被充分吸收。将平板倒置后，置于30℃恒温培养箱中培养48h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化，并且对不同的菌进行抗病毒功能的测定，获得了一株可抗淡水养殖动物病毒的菌株，命名为yfi-4。
2、yfi-4菌株的鉴定
(1)菌株yfi-4的生理生化鉴定
取经bhi固体培养基纯化培养的菌株yfi-4，单菌落划线接种于bug鉴定平板上，30℃培养16h-24h，待菌落大小适宜时取biolog细菌鉴定试剂盒if-a接种液，将管外壁擦拭干净，置入biolog浊度仪中调整其读数为100％t；用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在92％t-98％t之间，用8孔移液枪将混合液以每孔100μl体积转移至genⅲ鉴定板中。将鉴定板装载于biolog系统中培养，系统自动读数并最终输出鉴定结果为贝莱斯芽孢杆菌。
(2)菌株yfi-4的分子生物学鉴定。
扩增菌株16srrna的基因采用通用引物，16sf(27f)：agagtttgatcmtggctcag，16sr(1492r)：ggttaccttgttacgactt，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。提取菌株yfi-4的核酸，用上述引物进行扩增，将扩增产物送公司测序。将测序结果比较分析后显示，菌株yfi-4为贝莱斯芽孢杆菌。
菌株yfi-4经生理生化特征测定和16srdna序列同源性分析，都将菌株yfi-4鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。
该菌株已于2019年8月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)yfi-4，保藏编号：cctccno：m2019653，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
病毒液的准备：
(1)细胞培养：
本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(gicb，cctccno：c2013179)、草鱼肾脏细胞系(cik)、锦鲤鳍条细胞(koi-fin)、斑点叉尾鮰卵巢细胞系(cco)、鲤上皮细胞系(epc)。上述细胞均用10％fbs的m199培养72h左右传代；
细胞传代：传代时用0.25％的胰酶消化，约5min左右即可消化下来。具体步骤如下：
贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液，用pbs溶液洗去残留的旧培养基；
向瓶内加入1-2ml消化液(0.25％胰酶)轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；
在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终止消化(吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终止消化)；
用移液管吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液；
分装到新培养瓶中，并补加一定量的含血清的新鲜培养液；
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，将培养瓶放回25℃恒温培养箱中培养。
(2)淡水养殖动物病毒的增殖：
本实施例所用的病毒是草鱼呼肠孤病毒(gcrv)、鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)、锦鲤疱疹病毒(khv)、斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(ccrv)、大鲵虹彩病毒(gsiv)。
本实施例所用病毒与接种细胞的对应关系为：gcrv接入长成单层的cik细胞，cyhv-2接入长成单层的gicb细胞，khv接入长成单层的koi-fin细胞，ccrv接入长成单层的cco细胞，gsiv接入长成单层的epc细胞。
将消化好的细胞接t75细胞培养瓶，置于25℃恒温培养箱培养至长出单层细胞；
将-80℃保存的病毒液0.1ml接种到长有单层细胞的培养瓶中，25℃恒温培养箱孵育1h；
用移液器小心吸出病毒孵育液，加入10ml含2％fbs的m199细胞维持液，同时添加胰酶，25℃恒温培养箱中培养72-96h；
每天观察细胞状态，80％以上细胞出现病变时收获病毒细胞增殖液；
病毒细胞增殖液反复冻融3次，4000rpm离心10min，收集上清病毒液-80℃保存备用。
病毒增殖产物pcr检测：收集的病毒液，提取病毒核酸，用引物扩增病毒特异的基因片段，对病毒增殖产物进行验证。
不同病毒的扩增引物分别为：
gcrv
gcrv-f5’-tctctaccatccgttggttgtcc-3’
gcrv-r5’-atcgttgttgagctgagcctctt-3’
扩增目的片段大小461bp。
cyhv-2
cyhv-2-f5’-cccagcaacatgtgcgacgg-3’
cyhv-2-r5’-ccgtartgagagttggcgca-3’
扩增目的片段大小362bp。
khv
khv-f5’-gacaccacatctgcaaggag-3’
khv-r5’-gacacatgttacaatggtcgc-3’
扩增目的片段大小292bp。
ccrv
ccrvf5’-tctctaccatccgttggttgtcc-3’
ccrv-r5’-atcgttgttgagctgagcctctt-3’
扩增目的片段大小461bp。
gsiv
gsiv-f5′-gacttggccacttatgac-3′
gsiv-r5′-gtctctggagaagaagaa-3′
扩增目的片段大小531bp。
病毒液毒价测定：采用tcid50测定增殖的病毒液中病毒的滴度(tcid50/0.1ml)，具体步骤如下：
将消化好的细胞接96孔板，置于25℃恒温培养箱中培养至长出单层细胞；
在2ml无菌离心管中用m199将病毒液连续10倍稀释至10-9；
将稀释好的病毒液接种到长有单层细胞的96孔板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种病毒量为100ul，第7、8纵排接无病毒的m199培养基做对照，置于25℃恒温培养箱孵育1h；
用移液器小心吸出病毒孵育液和m199培养基，加入100ul含2％fbs的m199细胞维持液，置于25℃恒温培养箱培养120h；
每天观察并记录细胞病变(cpe)情况，按照reed-muench法计算上述淡水养殖动物病毒的半数组织细胞感染量(tissuecultureinfectivedose，tcid50)。结果见表1。
表1按reed-muerch法计算各病毒液的tcid50
实施例3：
贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清的制备：
挑取平板复壮的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4一个单菌落接种于150mlbhi液体培养基中，37℃培养24h，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，储存于无菌离心管中4℃保存备用，用于本实施例4-6。
实施例4：
贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清的细胞毒性测定
本实施本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(gicb，cctccno：c2013179)、草鱼肾脏细胞系(cik)、锦鲤鳍条细胞(koi-fin)、斑点叉尾鮰卵巢细胞(cco)、鲤上皮细胞系(epc)。
将gicb细胞，cik细胞，koi-fin细胞，cco细胞，epc细胞分别接种在96孔板中，培养至长出单层细胞；
取实施例3制备的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4的发酵上清原液用无菌naoh调节至ph7.0的发酵上清液后，用无菌pbs10倍梯度稀释，选取稀释102倍、103倍、104倍，3个梯度的发酵上清稀释液。
不同处理各做一纵排，每孔加入100ul不同稀释液，置于25℃培养箱中孵育60min；
弃掉孵育液，用pbs洗涤一次后加入2％fbsm199细胞维持液继续培养，同时设立pbs对照；
每天观察细胞病变情况，待细胞病变80％后，采用mtt法染色细胞，用酶标仪在波长570nm下检测各孔的od值，依据以下公式计算细胞的成活率，确定细胞成活率为100％时发酵上清最高浓度为安全浓度上限，根据细胞成活率计算药物半数毒性浓度，结果见表2.
细胞存活率＝(发酵上清稀释液组平均od值-空白对照组od值)/(细胞对照组od值-空白对照组od值)×100％。
表2贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清对细胞安全浓度
基于上述实验的结果，以细胞成活率为100％时发酵上清最高浓度为安全浓度上限，在后续试验中贝莱斯芽孢杆菌yfi-4的发酵上清的稀释倍数为104倍。
实施例5：
贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清液抗病毒谱检测
取贝莱斯芽孢杆菌yfi-4的发酵上清原液，用无菌naoh调节至ph7.0的发酵上清液后，用无菌pbs稀释104倍，制备成贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液。分别检测贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清液对草鱼呼肠孤病毒(gcrv)、鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)、锦鲤疱疹病毒(khv)、斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(ccrv)、大鲵虹彩病毒(gsiv)的抑制效果。
本实施本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(gicb，cctccno：c2013179)、草鱼肾脏细胞系(cik)、锦鲤鳍条细胞(koi-fin)、斑点叉尾鮰卵巢细胞(cco)、鲤上皮细胞系(epc)。
本实施例中加入的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液体积为每孔100μl，加入的100tcid50/0.1ml的病毒液与发酵上清液的体积相同。
分别将贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与gcrv接入长成单层的96孔培养板中的cik细胞，贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与cyhv-2同时接入长成单层的96孔培养板中的gicb细胞，贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与khv接入长成单层的96孔培养板中的koi-fin细胞，贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与ccrv接入长成单层的96孔培养板中的cco细胞，贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与gsiv接入长成单层的96孔培养板中的epc细胞，对照组接入等量病毒和100μlpbs，孵育60min后，弃混合液并用pbs洗涤细胞表面一次，加入细胞维持液继续培养。光学倒置显微镜下观察细胞病变(cpe)，根据cpe数量判断贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清液对草鱼呼肠孤病毒(gcrv)、鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)、锦鲤疱疹病毒(khv)、斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(ccrv)、大鲵虹彩病毒(gsiv)的抑制效果。见表3。+表示具有抗性，-表示无抗性。
表3贝莱斯芽孢杆菌yfi-4的抗病毒谱
实施例6：
贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清液在抗淡水养殖动物病毒中的应用：
取贝莱斯芽孢杆菌yfi-4的发酵上清原液，用无菌naoh调节至ph7.0的发酵上清液后，用无菌pbs稀释104～108倍，制备成贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液。
分别检测贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清液对草鱼呼肠孤病毒(gcrv)、鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)、锦鲤疱疹病毒(khv)、斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(ccrv)、大鲵虹彩病毒(gsiv)的抑制效果。
本实施本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(gicb，cctccno：c2013179)、草鱼肾脏细胞系(cik)、锦鲤鳍条细胞(koi-fin)、斑点叉尾鮰卵巢细胞(cco)、鲤上皮细胞系(epc)。
本实施例中加入的不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液体积为每孔100μl，加入的100tcid50/0.1ml的病毒液与发酵上清液的体积相同。
分别将不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与gcrv接入长成单层的96孔培养板中的cik细胞，不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与cyhv-2同时接入长成单层的96孔培养板中的gicb细胞，不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与khv接入长成单层的96孔培养板中的koi-fin细胞，不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与ccrv接入长成单层的96孔培养板中的cco细胞，不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清稀释液与gsiv接入长成单层的96孔培养板中的epc细胞，对照组接入等量病毒和100μlpbs，孵育60min后，弃混合液并用pbs洗涤细胞表面一次，加入细胞维持液继续培养。每隔24h观察记录各稀释度单层细胞的cpe现象，并记录相应病变孔数，待细胞病变80％后，采用mtt法染色细胞，用酶标仪在波长570nm下检测各孔的od值，依据以下公式计算病毒抑制率，结果见表4。
病毒抑制率＝(发酵上清稀释液处理组od－病毒对照组od)/(细胞对照组od－病毒对照组od)×100％
表4贝莱斯芽孢杆菌yfi-4发酵上清液对病毒的抑制率
序列表
<110>中国水产科学研究院长江水产研究所
<120>一种贝莱斯芽孢杆菌yfi-4及其在制备淡水养殖动物病毒病药物中的应用
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tctctaccatccgttggttgtcc23
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atcgttgttgagctgagcctctt23
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cccagcaacatgtgcgacgg20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ccgtartgagagttggcgca20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gacaccacatctgcaaggag20
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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gacacatgttacaatggtcgc21
<210>7
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
tctctaccatccgttggttgtcc23
<210>8
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
atcgttgttgagctgagcctctt23
<210>9
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
gacttggccacttatgac18
<210>10
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
gtctctggagaagaagaa18
<210>11
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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agagtttgatcmtggctcag20
<210>12
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
ggttaccttgttacgactt19