本发明是涉及异位发酵床高温菌种技术领域，具体地说是涉及一种用于处理粪污的高温菌种复配方法。
背景技术：
高温菌具有代谢快、活性高、代时短、酶的热稳定性高、营造高温条件杀死病原菌等特点，对于高温环境下有机物质的生物转化具有不可估量的作用，与常温菌相比具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率，在固体废弃物利用领域具有广阔的应用前景。
目前国内用于处理粪污的异位发酵床高温菌种主要依赖于日本进口，价格月120-150元/公斤,进口产品在扩培使用时受到培养基配方的严格限制。日本掌握核心菌种复配方案且不公布，扩培时的培养基方案过于复杂，国内使用时无法复制，另外，现有的降解菌种难以适应高温、高湿以及碳氮比失衡环境，分解效率较低。因此急需一种用于处理粪污的高温菌种复配方法来解决以上问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于处理粪污的高温菌种复配方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于处理粪污的高温菌种复配方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：初筛。样品制成悬浮液70℃～80℃高温富集后，将样品悬浮液制成60％、80％以及100％稀释度的菌液并分别涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置与70℃～80℃培养箱中培养24h。将形态特征不同的菌落挑出，在牛肉膏蛋白胨平板上经过5次的划线纯化，分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的耐高温纯菌株分别接种至纤维素刚果红培养基、淀粉选择培养基、蛋白选择培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现透明水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，按公式up＝(d/d)2来进行计算，up值的大小反映该菌水解能力的强弱.其中d为透明圈直径(mm)，d为菌落直径(mm)。
步骤二：复筛。在初筛得到的菌株中取出一部分，然后接种至纤维素培养基、淀粉培养基、蛋白液体发酵培养基中，70℃～80℃静止培养72小时后，将纤维素培养基所产生的发酵液、淀粉培养基所产生的发酵液和蛋白液体发酵培养基所产生的发酵液分别放置在离心机内部，每分钟4000～6000转，离心8～12分钟，得到粗酶液。分别用dns法、yoo法和福林试剂法测定粗酶液的纤维素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活力。测定结果用sas软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价，最后将测定结果较为优秀的，选为异位发酵床高温菌种，测定结果较差的，进行舍弃。
优选的，所述样品是从异位发酵床粪污堆积发酵过程中的腐殖质样品。
优选的，所述纤维素刚果红培养基包括以下重量份的各组份：羧甲基纤维素钠1.8～2.0份，磷酸二氢钾0.4～0.6份，泻盐0.2～0.3份，明胶1.0～3.0份，刚果红0.1～0.3份，植物凝胶9.0～11份，琼脂14～16份，蒸馏水1000ml，所述纤维素刚果红培养基ph值为7.0～7.2，所述纤维素刚果红培养基在配置完成后需要进行115℃～125℃灭菌20分钟。
优选的，所述蛋白选择培养基包括以下重量份的各组份：蛋白胨9.0～11份，牛肉膏2～4份，氯化钠4～6份，酪蛋白4～6份，氯化钙18～22份，l—酪氨酸0.05～0.15份，植物凝胶14～16份，蒸馏水1000ml，所述蛋白选择培养基ph值为7.0～7.2，所述蛋白选择培养基在配置完成后需要进行115℃～125℃灭菌，待冷却至55℃～65℃，再加入1％的经过110℃～120℃灭菌的聚山梨酯80。
优选的，所述淀粉选择培养基包括以下重量份的各组份：可溶性淀粉5～15份，蛋白胨5～15份，酵母粉4～6份，氯化钠5～15份，植物凝胶16～20份，曲利苯蓝0.06～0.10份，蒸馏水1000ml，所述淀粉选择培养基ph值为7.0，所述淀粉选择培养基在配置完成后需要进行115℃～125℃灭菌20～40分钟。
优选的，所述纤维素发酵培养基包括以下重量份的各组份：羧甲基纤维素钠4～6份，硝酸钠22～23份，磷酸一钾0.8～1.2份，硫酸镁0.5～0.7份，氯化钠0.08～0.12份，氯化钙20.1份，氯化铁0.01份，明胶1～3份，酵母粉0.1份，蒸馏水1000ml，所述纤维素发酵培养基ph值为7.0。
优选的，所述蛋白发酵培养基包括以下重量份的各组份：干酪素5％，mandela盐10％，mandelb盐1％，蒸馏水1000ml，所述蛋白发酵培养基ph值为6.0；所述mandela由同等量的成分为2g/l的磷酸二氢钾、成分为4g/l的硫酸铵，成分为0.3g/l硫酸镁，成分为0.3g/l氯化钙构成；所述mandelb盐由同等量的成分为5mg/l的硫酸亚铁、成分为1.6mg/l的硫酸锰，成分为1.4mg/l皓矾，成分为2mg/l氧氯化碳构成。
优选的，所述牛肉膏蛋白胨包括以下重量份的各组份：牛肉膏8～12份，蛋白胨4～6份，氯化钠4～6份，蒸馏水1000ml，所述牛肉膏蛋白胨的ph值为7.0，所述牛肉膏蛋白胨在配置完成后需要进行115℃～125℃灭菌10～30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明从异位发酵床粪污堆积发酵过程中的腐殖质样品里筛选具有同时降解纤维素、蛋白质、淀粉三种有机大分子能力的高温菌，为堆肥提供优良菌株，有效的促进堆肥物料快速腐解、缩短堆肥周期，提高堆肥物料的腐熟程度和稳定化程度，得到高品质的堆肥产品。
2.本发明所筛选的菌种，由于菌种自身特性能在处理粪污时的发酵床垫料温度50℃～75℃范围内均能长期生长，并保持90天左右不变，可以适应较高温度环境，解决了现有菌种无法适应高温环境的问题。
3.本发明所筛选的菌种，由于菌种自身特性能在发酵床常规垫料中碳氮比保持20-30:1的环境下，长期存活；也可以在垫料碳氮比小于20:1或大于30：1的环境中，维持90天左右不变，可以适应碳氮比失衡环境，解决了现有产品无法在碳氮比失衡环境存活的问题。
4.本发明所筛选的菌种，由于菌种自身特性能在处理粪污时的发酵床垫料湿度达到65％左右时，该高温菌种活力仍可以维持90天左右，可以适应高湿环境，解决了现有产品无法在高湿环境存活的问题。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
干酪素、离心机、dns法、yoo法、福林试剂法、sas软件以及异位发酵床，均属于现有技术，均属于公知常识。
实施例1；
一种用于处理粪污的高温菌种复配方法，包括以下步骤：
步骤一：初筛。样品制成悬浮液70℃高温富集后，将样品悬浮液制成60％、80％以及100％稀释度的菌液并分别涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置与70℃培养箱中培养24h。将形态特征不同的菌落挑出，在牛肉膏蛋白胨平板上经过5次的划线纯化，分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的耐高温纯菌株分别接种至纤维素刚果红培养基、淀粉选择培养基、蛋白选择培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现透明水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，按公式up＝(d/d)2来进行计算，up值的大小反映该菌水解能力的强弱.其中d为透明圈直径(mm)，d为菌落直径(mm)。
步骤二：复筛。在初筛得到的菌株中取出一部分，然后接种至纤维素培养基、淀粉培养基、蛋白液体发酵培养基中，70℃静止培养72小时后，将纤维素培养基所产生的发酵液、淀粉培养基所产生的发酵液和蛋白液体发酵培养基所产生的发酵液分别放置在离心机内部，每分钟4000转，离心8分钟，得到粗酶液。分别用dns法、yoo法和福林试剂法测定粗酶液的纤维素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活力。测定结果用sas软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价，最后将测定结果较为优秀的，选为异位发酵床高温菌种，测定结果较差的，进行舍弃。
其中上述技术方案中，所述样品是从异位发酵床粪污堆积发酵过程中的腐殖质样品。
其中上述技术方案中，所述纤维素刚果红培养基包括以下重量g的各组份：羧甲基纤维素钠1.8g，磷酸二氢钾0.4g，泻盐0.2g，明胶1.0g，刚果红0.1g，植物凝胶9.0g，琼脂14g，蒸馏水1000ml，所述纤维素刚果红培养基ph值为7.0，所述纤维素刚果红培养基在配置完成后需要进行115℃灭菌20分钟。
其中上述技术方案中，所述蛋白选择培养基包括以下重量g的各组份：蛋白胨9.0g，牛肉膏2g，氯化钠4g，酪蛋白4g，氯化钙18g，l—酪氨酸0.05g，植物凝胶14g，蒸馏水1000ml，所述蛋白选择培养基ph值为7.0，所述蛋白选择培养基在配置完成后需要进行115℃灭菌，待冷却至55℃，再加入1％的经过110℃灭菌的聚山梨酯80。
其中上述技术方案中，所述淀粉选择培养基包括以下重量g的各组份：可溶性淀粉5～15g，蛋白胨5g，酵母粉4g，氯化钠5g，植物凝胶16g，曲利苯蓝0.06g，蒸馏水1000ml，所述淀粉选择培养基ph值为7.0，所述淀粉选择培养基在配置完成后需要进行115℃灭菌20分钟。
其中上述技术方案中，所述纤维素发酵培养基包括以下重量g的各组份：羧甲基纤维素钠4g，硝酸钠22g，磷酸一钾0.8g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.08g，氯化钙20.1g，氯化铁0.01g，明胶1g，酵母粉0.1g，蒸馏水1000ml，所述纤维素发酵培养基ph值为7.0。
其中上述技术方案中，所述蛋白发酵培养基包括以下重量g的各组份：干酪素5％，mandela盐10％，mandelb盐1％，蒸馏水1000ml，所述蛋白发酵培养基ph值为6.0；所述mandela由同等量的成分为2g/l的磷酸二氢钾、成分为4g/l的硫酸铵，成分为0.3g/l硫酸镁，成分为0.3g/l氯化钙构成；所述mandelb盐由同等量的成分为5mg/l的硫酸亚铁、成分为1.6mg/l的硫酸锰，成分为1.4mg/l皓矾，成分为2mg/l氧氯化碳构成。
其中上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨包括以下重量g的各组份：牛肉膏8g，蛋白胨4g，氯化钠4g，蒸馏水1000ml，所述牛肉膏蛋白胨的ph值为7.0，所述牛肉膏蛋白胨在配置完成后需要进行115℃灭菌10min。
实施例2：
一种用于处理粪污的高温菌种复配方法，包括以下步骤：
步骤一：初筛。样品制成悬浮液经75℃高温富集后，将样品悬浮液制成60％、80％以及100％稀释度的菌液并分别涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置与75℃培养箱中培养24h。将形态特征不同的菌落挑出，在牛肉膏蛋白胨平板上经过5次的划线纯化，分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的耐高温纯菌株分别接种至纤维素刚果红培养基、淀粉选择培养基、蛋白选择培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现透明水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，按公式up＝(d/d)2来进行计算，up值的大小反映该菌水解能力的强弱.其中d为透明圈直径(mm)，d为菌落直径(mm)。
步骤二：复筛。在初筛得到的菌株中取出一部分，然后接种至纤维素培养基、淀粉培养基、蛋白液体发酵培养基中，75℃静止培养72小时后，将纤维素培养基所产生的发酵液、淀粉培养基所产生的发酵液和蛋白液体发酵培养基所产生的发酵液分别放置在离心机内部，每分钟5000转，离心10分钟，得到粗酶液。分别用dns法、yoo法和福林试剂法测定粗酶液的纤维素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活力。测定结果用sas软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价，最后将测定结果较为优秀的，选为异位发酵床高温菌种，测定结果较差的，进行舍弃。
其中上述技术方案中，所述样品是从异位发酵床粪污堆积发酵过程中的腐殖质样品。
其中上述技术方案中，所述纤维素刚果红培养基包括以下重量g的各组份：羧甲基纤维素钠1.88g，磷酸二氢钾0.5g，泻盐0.25g，明胶2.0g，刚果红0.2g，植物凝胶10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，所述纤维素刚果红培养基ph值为7.1，所述纤维素刚果红培养基在配置完成后需要进行121℃灭菌20分钟。
其中上述技术方案中，所述蛋白选择培养基包括以下重量g的各组份：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，酪蛋白5g，氯化钙20.1g，l—酪氨酸0.1g，植物凝胶15g，蒸馏水1000ml，所述蛋白选择培养基ph值为7.1，所述蛋白选择培养基在配置完成后需要进行121℃灭菌，待冷却至60℃，再加入1％的经过115℃灭菌的聚山梨酯80。
其中上述技术方案中，所述淀粉选择培养基包括以下重量g的各组份：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，植物凝胶18g，曲利苯蓝0.08g，蒸馏水1000ml，所述淀粉选择培养基ph值为7.0，所述淀粉选择培养基在配置完成后需要进行121℃灭菌30分钟。
其中上述技术方案中，所述纤维素发酵培养基包括以下重量g的各组份：羧甲基纤维素钠5g，硝酸钠22.5g，磷酸一钾1g，硫酸镁0.6g，氯化钠0.1g，氯化钙20.1g，氯化铁0.01g，明胶2g，酵母粉0.1g，蒸馏水1000ml，所述纤维素发酵培养基ph值为7.0。
其中上述技术方案中，所述蛋白发酵培养基包括以下重量g的各组份：干酪素5％，mandela盐10％，mandelb盐1％，蒸馏水1000ml，所述蛋白发酵培养基ph值为6.0；所述mandela由同等量的成分为2g/l的磷酸二氢钾、成分为4g/l的硫酸铵，成分为0.3g/l硫酸镁，成分为0.3g/l氯化钙构成；所述mandelb盐由同等量的成分为5mg/l的硫酸亚铁、成分为1.6mg/l的硫酸锰，成分为1.4mg/l皓矾，成分为2mg/l氧氯化碳构成。
其中上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨包括以下重量g的各组份：牛肉膏10g，蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，所述牛肉膏蛋白胨的ph值为7.0，所述牛肉膏蛋白胨在配置完成后需要进行121℃灭菌20min。
实施例3：
一种用于处理粪污的高温菌种复配方法，包括以下步骤：
步骤一：初筛。样品制成悬浮液80℃高温富集后，将样品悬浮液制成60％、80％以及100％稀释度的菌液并分别涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置与80℃培养箱中培养24h。将形态特征不同的菌落挑出，在牛肉膏蛋白胨平板上经过5次的划线纯化，分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的耐高温纯菌株分别接种至纤维素刚果红培养基、淀粉选择培养基、蛋白选择培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现透明水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，按公式up＝(d/d)2来进行计算，up值的大小反映该菌水解能力的强弱.其中d为透明圈直径(mm)，d为菌落直径(mm)。
步骤二：复筛。在初筛得到的菌株中取出一部分，然后接种至纤维素培养基、淀粉培养基、蛋白液体发酵培养基中，80℃静止培养72小时后，将纤维素培养基所产生的发酵液、淀粉培养基所产生的发酵液和蛋白液体发酵培养基所产生的发酵液分别放置在离心机内部，每分钟6000转，离心12分钟，得到粗酶液。分别用dns法、yoo法和福林试剂法测定粗酶液的纤维素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活力。测定结果用sas软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价，最后将测定结果较为优秀的，选为异位发酵床高温菌种，测定结果较差的，进行舍弃。
其中上述技术方案中，所述样品是从异位发酵床粪污堆积发酵过程中的腐殖质样品。
其中上述技术方案中，所述纤维素刚果红培养基包括以下重量g的各组份：羧甲基纤维素钠2.0g，磷酸二氢钾0.6g，泻盐0.3g，明胶3.0g，刚果红0.3g，植物凝胶11g，琼脂16g，蒸馏水1000ml，所述纤维素刚果红培养基ph值为7.2，所述纤维素刚果红培养基在配置完成后需要进行125℃灭菌20分钟。
其中上述技术方案中，所述蛋白选择培养基包括以下重量g的各组份：蛋白胨11g，牛肉膏4g，氯化钠6g，酪蛋白6g，氯化钙22g，l—酪氨酸0.15g，植物凝胶16g，蒸馏水1000ml，所述蛋白选择培养基ph值为7.2，所述蛋白选择培养基在配置完成后需要进行125℃灭菌，待冷却至65℃，再加入1％的经过120℃灭菌的聚山梨酯80。
其中上述技术方案中，所述淀粉选择培养基包括以下重量g的各组份：可溶性淀粉15g，蛋白胨15g，酵母粉6g，氯化钠15g，植物凝胶20g，曲利苯蓝0.10g，蒸馏水1000ml，所述淀粉选择培养基ph值为7.0，所述淀粉选择培养基在配置完成后需要进行125℃灭菌40分钟。
其中上述技术方案中，所述纤维素发酵培养基包括以下重量g的各组份：羧甲基纤维素钠6g，硝酸钠23g，磷酸一钾1.2g，硫酸镁0.7g，氯化钠0.12g，氯化钙20.1g，氯化铁0.01g，明胶3g，酵母粉0.1g，蒸馏水1000ml，所述纤维素发酵培养基ph值为7.0。
其中上述技术方案中，所述蛋白发酵培养基包括以下重量g的各组份：干酪素5％，mandela盐10％，mandelb盐1％，蒸馏水1000ml，所述蛋白发酵培养基ph值为6.0；所述mandela由同等量的成分为2g/l的磷酸二氢钾、成分为4g/l的硫酸铵，成分为0.3g/l硫酸镁，成分为0.3g/l氯化钙构成；所述mandelb盐由同等量的成分为5mg/l的硫酸亚铁、成分为1.6mg/l的硫酸锰，成分为1.4mg/l皓矾，成分为2mg/l氧氯化碳构成。
其中上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨包括以下重量g的各组份：牛肉膏12g，蛋白胨6g，氯化钠6g，蒸馏水1000ml，所述牛肉膏蛋白胨的ph值为7.0，所述牛肉膏蛋白胨在配置完成后需要进行125℃灭菌30min。
本发明从异位发酵床粪污堆积发酵过程中的腐殖质样品里筛选具有同时降解纤维素、蛋白质、淀粉三种有机大分子能力的高温菌，为堆肥提供优良菌株，有效的促进堆肥物料快速腐解、缩短堆肥周期，提高堆肥物料的腐熟程度和稳定化程度，得到高品质的堆肥产品。
本发明所筛选的菌种，由于菌种自身特性能在处理粪污时的发酵床垫料温度50℃～75℃范围内均能长期生长，并保持90天左右不变，可以适应较高温度环境，解决了现有菌种无法适应高温环境的问题。
本发明所筛选的菌种，由于菌种自身特性能在发酵床常规垫料中碳氮比保持20-30:1的环境下，长期存活；也可以在垫料碳氮比小于20:1或大于30：1的环境中，维持90天左右不变，可以适应碳氮比失衡环境，解决了现有产品无法在碳氮比失衡环境存活的问题。
本发明所筛选的菌种，由于菌种自身特性能在处理粪污时的发酵床垫料湿度达到65％左右时，该高温菌种活力仍可以维持90天左右，可以适应高湿环境，解决了现有产品无法在高湿环境存活的问题
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。