筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。
背景技术：
：familybdnapolymerase是新一代的高保真dna聚合酶。该酶基于pyrococcusfuriosisdnapolymerase，经基因工程改造而成。其蛋白结构包含5’→3’聚合酶结构域和经过改造的3’→5’外切酶结构域。这种组合大幅度提升了酶的耐热性，保真性。耐热温度达到98℃，保真性是taqdna聚合酶的52倍，普通pfudna聚合酶的6倍。酶溶液中添加了独特的延伸因子，扩增速度达到15sec/kb。本产品配备了优化后的酶缓冲液，添加了pcr增强组分，使得该酶具有极强的扩增效率和广泛的模板适应性，非常适合复杂模板的扩增。扩增产物为平末端，可磷酸化后克隆到平滑末端载体中。该酶可应用于高保真pcr、基因克隆、定点突变、高通量pcr。该familybdnapolymerase抗体与familybdnapolymerase具有很高的亲和力，高温50℃处理30min，依旧可以封闭其聚合酶活性，其热启动酶在预变性温度下加热30sec完全失活，释放出dna聚合酶活性。使用该热启动酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。但是，在筛选抗体之前，首先要解决的是如何建立筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。现有的方法，一般地，是通过测定dnapolymerase的活性来间接确定其抗体的活性。而标准的dnapolymerase活性测定方法采用放射性底物掺入法，即采用以3h标记的dttp为底物，经dnapolymerase将其掺入到活化的大马哈鱼精子dna上。经过tca沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出dnapolymerase的活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化，因此为筛选带来了困难。技术实现要素：本发明的的第一个目的是提供一种简便、灵敏、重现性好、非放射性的筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。本发明的第二个目的是提供一种筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：作为本发明的第一个方面，一种筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，包括如下步骤：步骤一、合成引物s1-f3和s1-r2，将引物混合并退火，其中，所述s1-f3和s1-r2的3’端部分互补；步骤二、加入足量dntps，在热启动酶的作用下延伸引物，在40℃下反应30min；所述热启动酶为familybdnapolymerase抗体和familybdnapolymerase的复合物；步骤三、取出，加入可以特异结合双链dna并发荧光的物质，上机，观察熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。根据本发明，所述可以特异结合双链dna并发荧光的物质为sybrgreen、evagreen、eb等。根据本发明，所述s1-f3和s1-r2的引物序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示；根据本发明，所述延伸引物的反应体系为：10xreactionbuffer，ph8.0，2μl；2.5mmdntps，3.2μl；引物s1-f3和s1-r2各1μl；热启动酶，10μl；ddw补足20μl。作为本发明的第二个方面，一种筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的的试剂盒，包括如seqidno：1和seqidno：2所示的引物s1-f3和s1-r2。本发明的有益效果是：无放射性污染，而且该方法的操作步骤简单快速，无需tca沉淀、洗涤、干燥、洗脱等；可实现高通量、自动化的检测、直观的检测热启动酶的封闭效果。附图说明图1为familybdnapolymerase抗体的筛选原理图。图2为熔解曲线设置程序。图3为familybdnapolymerase抗体+familybdnapolymerase(yeasen：10148)的检测示例图。图4为商品热启动酶(kapalibraryamplificationkits：kk2610)的检测示例图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。本发明通过研究，建立了筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，以用于筛选familybdnapolymerase抗体，筛选原理如图1所示。具体过程为：首先合成一对部分碱基互补的引物s1-f3和s1-r2，将引物混合并退火，接着，加入足量dntps，在热启动酶的作用下延伸引物，随后通过荧光染料检测反应体系中产物的熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。若抗体无聚合酶封闭活性，则在聚合酶的作用下延伸为双链dna，得到产物的特征峰(tm，dna双链解链50％的温度)；若抗体有聚合酶封闭活性，则不能进行延伸，仅有引物二聚体的特征峰，根据这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开。以下为本发明的实验材料1、familybdnapolymerase：高保真dna聚合酶(yeasen：10148)；2、商品热启动酶：hifiamplificationmixkapalibraryamplificationkits(kapa：kk2610)。实施例1反应体系的建立(1)引物s1-f3和s1-r2的设计引物s1-f3和s1-r2的3’端的部分碱基互补，两引物不完全互补，具体序列如下：s1-f3：5’-gagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgatagg-3’：(seqidno：1)s1-r2：5’-gaacaggacaaaggaagagagtcagtgcctatcagaaacccaagagtctt-3’。(seqidno：2)(2)延伸反应体系，反应体系如表1所示表1延伸反应体系组分加入量10xreactionbuffer(ph8.0)2μldntps(2.5mm)3.2μls1-f3(10um)1μls1-r2(10um)1μl热启动酶10μlddwto20μl40℃30min。一种筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，包括如下步骤：步骤一、合成引物s1-f3和s1-r2，将引物混合并退火，其中，所述s1-f3和s1-r2的引物序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示。步骤二、加入足量dntps，在热启动酶的作用下延伸引物，在40℃下反应30min；其中，所述热启动酶为familybdnapolymerase抗体和familybdnapolymerase的复合物；所述延伸引物的反应体系为：10xreactionbuffer(ph8.0)，2μl；dntps(2.5mm)，3.2μl；引物s1-f3和s1-r2各1μl；热启动酶，10μl；ddw补足20μl。应当说明，10xreactionbuffer组成也可为其他形式，只要满足familybdnapolymerase能够在其中有活力即可。步骤三、取出12μl，加入1.6μl100xsybrgreen，上机，观察熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。应当说明，在检测溶解曲线，除了sybrgreen，还可以是evagreen、eb等其他可以特异结合双链dna并发荧光的物质。实施例2筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法本实施例的热启动酶的配制，如表2所示。表2热启动酶的配制rt30min。步骤一、合成引物s1-f3和s1-r2，将引物混合并退火；步骤二、加入足量dntps，在表2所示的热启动酶的作用下，按照表1的延伸反应体系延伸引物，在40℃下反应30min；步骤三、取出12μl，加入1.6μl100xsybrgreen，上机，程序设置如图2所示，观察并分析熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。结果如图3所示。图3结果显示，实验组1(10148+抗体)仅有引物二聚体的特征峰，与阴性对照(即，空白对照)一致，说明familybdnapolymerase抗体对familybdnapolymerase(yeasen：10148)具有封闭活性；但是，实验组2(10148+bsa)有产物特征峰，与阳性对照(10148)组一致，说明bsa对familybdnapolymerase(yeasen：10148)不具有封闭活性。结论：该方法可以用于筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性。因此可以用方法将具有活性的抗体和无活性的蛋白区分开。实施例3实际验证本实施例的空白对照为不加热启动酶mix(kk2610)；kapa热启动mix为添加热启动酶mix(kk2610)。步骤一、合成引物s1-f3和s1-r2，将引物混合并退火；步骤二、加入外购kapa商品化热启动酶mix(kk2610)延伸引物，按照表1的延伸反应体系延伸引物，在40℃下反应30min；步骤三、取出12μl，加入1.6μl100xsybrgreen，上机，程序设置如图2，观察并分析熔解曲线，由该检测结果确定其是否为热启动酶，对本发明进行验证。结果如图4所示。图4结果显示，kapalibraryamplificationkits(kapa：kk2610)热启动酶特征峰较宽，与阴性对照有大部分重叠，说明其具有封闭功能，但封闭效率并未达到100％。结论：本发明的方法可以有效的筛选familybdnapolymerase抗体，并且可以直观的检测热启动酶的封闭效果。若抗体无聚合酶封闭活性，则在聚合酶的作用下延伸为双链dna，得到产物的特征峰(tm，dna双链解链50％的温度)；若抗体有聚合酶封闭活性，则不能进行延伸，仅有引物二聚体的特征峰。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。序列表<110>武汉翌圣医疗科技有限公司<120>筛选familybdnapolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgatagg57<210>2<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaacaggacaaaggaagagagtcagtgcctatcagaaacccaagagtctt50当前第1页12