与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记的制作方法

本发明属于水产动物遗传育种技术领域，具体涉及一个与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的snp分子标记。

背景技术：

克氏原螯虾(procambarusclarkii)，隶属于甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属，原产于墨西哥北部和美国南部(邓沼泽2010)。因其营养丰富，口味独特，现已成为我国重要的经济养殖对象。据《2019中国小龙虾产业发展报告》报道，2018年小龙虾在中国的产量达到了1638700吨，养殖总面积达1680万亩，总产值达到3690亿元。白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)是影响克氏原螯虾健康养殖产业发展的重要因素之一，给克氏原螯虾产量造成了一定的经济损失。

wssv是一种具有囊膜的双链dna病毒，几乎可以感染所有的虾、蟹类等甲壳动物(ding2015)。虾感染wssv后，游泳速度明显变得缓慢，摄食量减少，行动迟缓，头胸甲与腹节分离，血淋巴变得稀薄不易凝固，最后病虾大规模死亡。整个发病过程一般持续3-10天，死亡率可达90％以上(闫冬春2007)。对克氏原螯虾携带wssv情况的研究表明，池塘养殖和江河的野生克氏原螯虾均有较高的带毒率(洪徐鹏2012)。在克氏原螯虾产量最高的湖北地区，对7个主要养殖克氏原螯虾的地区的携带wssv情况调查发现，克氏原螯虾携带wssv的比例在40-70％之间(李青彬2018)。

wssv主要通过水平传播、垂直传播和种间转播三种方式进行传播(chou1998)。目前，有研究报道了许多化学和物理方法用于预防和治疗该病，如病毒蛋白口服，在体内注射灭活的wssv(duetal2006，zhuetal2009)，高热疗法等，这些方法虽然具有一定的可行性，但在克氏原螯虾的养殖中广泛地应用仍具有一定的难度。

近年来，随着分子生物技术的发展，使得人们可以透过复杂的表面现象，剖析其遗传基础，估算其遗传的部分，dna重组技术、转基因技术、分子标记技术等逐渐地应用在育种领域。其中，分子标记技术因具有较高的多态性、检测手段简单、开发成本低廉等优点，现广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别等方面。目前在中国对虾(降锦菲2013)、半滑舌鳎(邢贺飞2015)、草鱼(王文静2014)和凡纳滨对虾(liuetal2014)等水产动物中已开发出了抗病分子标记，但在克氏原螯虾抗病snp分子标记的研究仍为空白，有必要通过分子育种技术，挖掘克氏原螯虾抗病关键基因，为该虾抗病品种选育提供依据。

大多数甲壳类动物缺乏适应性免疫，而依赖于先天免疫，后者分为体液免疫和细胞免疫，它们是抵抗病原体的第一道防线(lokeretal2004；cereniusand2004)。凝血系统，抗菌素蛋白的合成以及酚氧化酶原(propo)激活系统在无脊椎动物中形成体液免疫(iwanagaandlee2004；cereniusetal2008)。其中，酚氧化酶原(propo)激活系统被认为是甲壳类动物中最重要的免疫系统(zheng2019)，酚氧化酶原激活系统在丝氨酸蛋白酶(serineprotease，sp)的催化下可产生有毒的反应中间体和黑色素以抵抗病原体(jiangandkanost2000)。现有研究表明，propo在诸如结节形成，血淋巴吸引等生理过程中起着至关重要的作用(cereniusetal2008；nappiandchristensen2005)。propo系统可被病原体，身体损伤和微生物产物激活(amparyupetal2013；cereniusand2004)。在过去的几十年中，propo在各种生物中被广泛的研究，并显示了它们在无脊椎动物免疫中的重要作用(amparyupetal2013；guetal2019；dziedziechetal2019)。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一个与克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(wssv)相关的snp分子标记，该snp分子标记的多态性位点位于克氏原螯虾酚氧化酶原基因(prophenoloxidase,propo)第4内含子中，与克氏原螯虾抗wssv性状有显著相关性，具有良好的多态性，利用该snp分子标记对克氏原螯虾进行抗wssv检测，有利于提高克氏原螯虾的抗病育种效率，加快实现克氏原螯虾抗wssv新品种的选育。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明通过克氏原螯虾wssv攻毒处理及基因组dna提取，引物设计，pcr扩增，pcr产物直接测序以及snp分子标记的筛选与分析，用spss22.0软件进行数据处理，卡方检验基因型与抗病性状的显著性差异，在propo基因的第4内含子区发现1个与克氏原螯虾抗wssv性状显著相关的snp位点g.7081t/c，snp分子标记包括如seqidno：2所示的核苷酸序列，在该序列的第451bp处有一个等位基因突变，基因型是t或c。

上述snp分子标记在辅助选育克氏原螯虾抗白斑综合征病毒品种中的应用，具体方法为：扩增含有所述snp位点的片段，通过直接测序法对snp位点的基因型进行分型，tt基因型是克氏原螯虾白斑综合征病抗性的有利标记。

进一步地，用于扩增snp分子标记的引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示。

附图说明

图1：克氏原螯虾propo基因第4内含子中g.7081t/c位点不同基因型的测序峰图。

具体实施方式

实施例

1.1试验动物

本实验所需的克氏原螯虾来自华中农业大学水产养殖基地，实验前在聚乙烯塑料养殖箱中暂养1周，挑选健康有活力的189尾虾开展实验。室内养殖水温24-26℃，实验期间每天投喂1次商品饲料，每周换水2次。将189只健康克氏原螯虾注射0.1mlwssv(10⁹拷贝)，注射部位为第二腹节。随着病毒在体内的扩散，前50个发病死亡的克氏原螯虾作为敏感群体。15天后，将50个存活的克氏原螯虾作为抗性组。

1.2试验方法

1.2.1克氏原螯虾基因组dna提取

取两个群体克氏原螯虾的尾部肌肉保存在装有无水乙醇的2ml离心管中，按照以下步骤提取其dna：

(1)在实验开始前将水浴锅温度设置为55℃并于冰上解冻蛋白酶k，取肌肉组织于滤纸上，吸干附着于肌肉上的液体；将肌肉装入有600μl裂解液的2ml离心管中，将肌肉组织用剪刀剪碎后加入9μl蛋白酶k；

(2)将装有肌肉组织的离心管放入水浴锅中，让肌肉组织消解完全；

(3)提前打开冰冻离心机，快速降温至4℃，待肌肉组织完全消解后，将其取出，冷却，向离心管中加入200μl醋酸铵(此步骤及以后操作均在冰上进行)，用力摇晃充分混匀；

(4)离心后，用1000μl枪缓慢吸取上清液，将其加到1.5ml离心管中(约500μl)；加入等体积预冷异丙醇(轻轻摇晃有丝状物产生)，离心(4℃，12000r/min，10-15min)，缓慢倒出上清液，将白色白斑留下；

(5)加入1ml75％乙醇洗涤，离心(4℃，12000r/min，5min)；倒出上清液，将白色沉淀或白斑留下，重复一次后，再用100％乙醇洗涤一次(离心4℃，12000r/min，2-5min)；

(6)干燥(约30min)后加入适量灭菌双蒸水，振荡后低速离心，所得dna样本于-20℃保存。

1.2.2引物设计

根据本发明克隆得到的克氏原螯虾propo基因dna序列(seqidno:1)，设计扩增位于propo基因的snp位点，用primerpremier6.0软件设计引物(引物序列如表1所示)

表1本发明设计的引物序列

1.2.3pcr扩增

以抗性组和敏感组克氏原螯虾dna为模板，以表1所示引物进行pcr扩增，扩增体系见表2。

表2pcr扩增体系的组分

pcr扩增程序为：95℃条件下预变性5min，40个扩增循环(95℃，30s；55℃，45s；72℃，1min)，72℃延伸10min。

1.2.4小群体基因池构建及snp筛选

在抗性组和敏感组中各随机选取10个个体，将每个个体的dna等量混合后构成抗性组和敏感组基因池，利用设计的引物对抗性组和敏感组dna进行pcr扩增，取2μl扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，选择电泳目的条带清晰明亮的pcr产物送武汉擎科生物有限公司测序。测序结果由dnastar软件分析核苷酸序列以及比对测序峰图，将在小群体抗性组和敏感组中差异显著的位点在剩余的80个个体进行单个个体验证。

1.2.5数据分析

用popgene32软件计算snp的等位基因频率，基因型频率，多态信息含量，群体观测杂合度，期望杂合度，有效等位基因数，哈迪-温伯格平衡检验。用spss22.0对各snp基因型和抗病性状进行卡方检验。

1.2.6结果分析

1.2.6.1克氏原螯虾propo基因snp小群体筛选

对克氏原螯虾propo基因片段1-5进行扩增测序，经过比对，片段1-3没有发现snp位点；在片段4中发现2个在抗性组和敏感组有显著性差异的snp位点，经比对这2个位点位于propo基因的第3内含子中；在片段5(seqidno：2)中发现1个在抗性组和敏感组中有显著性差异的snp位点，经比对该位点位于propo基因第4内含子中。

1.2.6.1克氏原螯虾propo基因大群体snp筛选及多态分析

使用引物propo-f4/r4和propo-f5/r5对剩余80个克氏原螯虾个体的propo基因片段4和片段5进行扩增，经测序比对后，用popgene32对这3个位点的多态信息进行分析，结果如表3所示。

表3克氏原螯虾propo基因snp位点多态参数分析

注：snp：单核苷酸多态；ho：杂合度；he：预期杂合度；hwe：哈迪温伯格平衡检验；pic：多态信息含量：ne：有效等位基因。

表3说明：3个snp的杂合度为0.24至0.33，预期的杂合度为0.270至0.367，有效等位基因数为1.368至1.613。多态性参数分析表明，3个snp位点均遵循hard-weinberg。3个snp均表现出中等多态性(0.25<pic<0.5)。

1.2.6.2克氏原螯虾propo基因snp位点与抗wssv性状关联分析

分别统计这3个snp位点在抗性组和敏感组中的等位基因频率和基因型频率，用spss22.0软件中的卡方检验对这3个snp位点在抗性组和敏感组的基因型频率和等位基因频率进行显著性差异检验，p<0.05视为存在显著性差异，反之则不存在显著性差异。

表4克氏原螯虾propo基因snp位点与抗wssv的关联分析

注：加粗的数字表明存在显著性差异(p<0.05)。

表4说明：在g.5057t/c、g.7081t/c和g.5061t/c中，抗性组的tt基因型克氏原螯虾比例均高于敏感组。对3个snp的基因型频率和等位基因频率在抗性组和敏感组卡方检验表明g.7081t/c位点基因型频率和等位基因频率在抗性组和敏感组中均存在显著性差异(p<0.05)。这些结果表明g.7081t/c与抗wssv性状具有显著相关性，且tt基因型在wssv抗性组中为优势基因型，因此可以通过选择propo基因g.7081t/c位点是tt基因型的克氏原螯虾进行抗wssv育种。

参考文献

1.邓沼泽.小龙虾的市场经济价值论述.现代商贸工业，2010，13：155

2.洪徐鹏.白斑综合征病毒(wssv)在市售克氏原螯虾中携带情况调查.江西水产科技，2012：13-15

3.降锦菲.“黄海2号”中国对虾高通量snp筛选及与抗wssv性状的关联分析.[硕士学位论文].上海：上海海洋大学，2013

4.李青彬.克氏原螯虾白斑综合征病毒的活体检测及流行病学调查.4.[硕士学位论文].武汉：华中农业大学，2018

5.王文静.草鱼3个toll样受体基因克隆和表达及与细菌性败血症关联分析.[硕士学位论文].上海：上海海洋大学，2014.

6.邢贺飞.半滑舌鳎抗病相关snp标记的筛选及两种免疫相关基因的克隆与初步分析.[硕士学位论文].上海：上海海洋大学，2015

7.闫冬春.对虾白斑综合征病毒(wssv)宿主研究进展.海洋湖沼通报，2007，(01)：136-140

8.amparyupp,charoensapsriw,tassanakajona.prophenoloxidasesystemanditsroleinshrimpimmuneresponsesagainstmajorpathogens.fishshellfishimmunol,2013,34:990–1001

9.chouhy,huangcy,locf,kough.studiesontransmissionofwhitespotsyndromeassociatedbaculovims(wsbv)inpenaeusmonodonandp.japonicusviawaterbomecontactandoralingestion.aquaculture,1998,164:263-276

10.cereniusl,leebl,k.thepropo-system:prosandconsforitsroleininvertebrateimmunity.trendsimmunol,2008,29:263–271.

11.cereniusl,k.theprophenoloxidase-activatingsystemininvertebrates.immunol.rev,2004,77:116–126

12.dziedziecha,schmidm,arefinb,kienzlet,krautzr,theopoldu.dataondrosophilaclotsandhemocytemorphologiesusinggfp-taggedsecretoryproteins:prophenoloxidaseandtransglutaminase.dateinbrief,2019,25:104229

13.duh,xuz,wux,liw,daiw.increasedresistancetowhitespotsyndromevirusinprocambarusclarkiibyinjectionofenvelopeproteinvp28expressedusingrecombinantbaculovirus.aquaculture,2006,260:39-43

14.dingzf,yaoyf,zhangfx,wanjj,sunml,liuhy,zhoug,tangjq,panjl,xueh,zhaozm.thefirstdetectionofwhitespotsyndromevirusinnaturallyinfectedculturedchinesemittencrabs,eriocheirsinensisinchina.j.virol.methods,2015,220:49-54

15.guqj,zhousm,zhouyn,huangjh,shim,chenxx.atrypsininhibitor-likeproteinsecretedbycotesiavestalisteratocytesinhibitshemolymphprophenoloxidaseactivationofplutellaxylostella.j.insectphysiol,2019,116:41-48

16.iwanagas,leebl.recentadvancesintheinnateimmunityofinvertebrateanimals.j.biochem.mol.biol,2005,38:128–150

17.jiangh,kanostmr.theclip-domainfamilyofserineproteinasesinarthropods.insectbiochem.mol.biol,2000,30:95–105

18.lokeres,ademacm,zhangsm,keplert.invertebrateimmunesystems-nothomogeneous,notsimple,notwellunderstood.immunol.rev,2004,198:10–24

19.liujw,yuy,lifh,zhangxj,xiangjh.anewanti-lipopolysaccharidefactor(alf)genewithitssnppolymorphismsrelatedtowssv-resistanceoflitopenaeusvannamei.fishshellfishimmunol,2014,39:24-33

20.nappiaj,christensenbm.melanogenesisandassociatedcytotoxicreactions:applicationstoinsectinnateimmunity.insectbiochem.mol.biol,2005,35:443–459

21.zhengxc,chic,xucy,liujd,zhangcy,zhangl,huangyy,hecf,hec,jiaxy,liuwb.effectsofdietarysupplementationwithicariinongrowthperformance,antioxidantcapacityandnon-specificimmunityofchinesemittencrab(eriocheirsinensis).fishshellfishimmunol,2019,90:264-273

22.zhuf；duh；miaoz；quanh；xuz.protectionofprocambarusclarkiiagainstwhitespotsyndromevirususinginactivatedwssv.fishshellfishimmunol,2009,26,685-690

序列表

<110>华中农业大学

<120>与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的snp分子标记

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9085

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgcaggtgacccagaagttgccgagaagagagacgcaaagatgcaggtgacccagaagt60

tgccgagaagagagacgcaaagatggctaacgttcaggcgcaaatgcttaaactgttcga120

gcggccgtacgaccctatgaacttgcggcgaagtgatgttcccacaggatcagcagacac180

agtaagcaccagggccggcacgagccccgggaacaccgtgacggtccgctcacgtccaga240

gatcaacaagaacagtctgggactgacaacctccgtgcctcgaggggtggttttctgtta300

cttcctcaagtcacaccgccaggccgccaggtgtctctgtgatatcttcatgagagctcg360

aacttccaccgacctgatggagttggcactcaatgtgagggaccaagtcaacgagtccct420

ctttatttacgcgctctccttcaccattcttcggaagcaggaattgcgaagtgttcgtct480

gccgccaatcgtggaagtctttccccagaagttcattccaacagaagatctgacaaagat540

gcaggttgagatgaacaggactcccgctagtcagacaacaccgatggtgattgaatacgg600

agcggactttgccaacaccaccctgaagccagagcaccgagtgtcatactggagggagga660

ctacggcatcaactcccaccactggcactggcaccttgtttaccccattgacatgaatgt720

taactgggaccgtaaaggagaacttttctattatatgcatcagcagatgatagccaggta780

cgacatggagcggctcagcgttaacctcaaacgtgtggagaagctggagaactggcggga840

gcccatcccagatggttacttctccaagcttactgttaacaactccggtcggccctgggg900

cacccgccaggataataccctactcaaggatttgagacgtaatgagttcgggctggatgt960

tacagacattagtgatatggagctctggcggtcccgactgatggacgccatccaccaagg1020

atatatgctaaatcggaatggtgagcgcatcccactctctgataacgtcacgacaggaaa1080

gcgagggattgacatctcagcagacgcatttgaggcagatggtcagctgagcccaaattt1140

cctcttctatggcgaccttcacaacataggccacctgatgctggcattctgccatgacag1200

cgacaacgcacatatggaagagatgggagtggtgggagacaatacgactgccatgagaga1260

cccagtcttctaccgctggcacaagtttgtggacgacgtcttccaggagtacaagctgac1320

gcagccgccctacaccatggaggacctgactctgccgggcgtggtgcttgacaaggtggg1380

tgttgtgagggacaaccagctcaacaccctcacaactggctggaacgtgcgggagtttga1440

ggcttccagagggtcggacttcaactctaccaaccccgtaatgctgcgcatcacccatct1500

cgaccatgctcccttcgattatcatctccaggtatgaattcttctgagttttatatattt1560

ctagtatagccagtaagtgtaatggctctttccacgtttttgtcgctttattcgtatgcc1620

ggaaaaacaatctggtgttgaaatccattatactgtgtaagagatttatcggtatttata1680

aaacaaatcggcaaatgattgtagatataaaatactaaagttacgaatttgcctgagagt1740

aaatctttcttctaaagtttcattgttaaataaaatagctgctttagcggactgatacat1800

gaataatgttccctaaaacgttgacgctatacgtctggaacggtgcttacgttaaccaat1860

aacacgacatcaaaagtaaattgagatatgacccacgatgtcattcacgaaggagggacg1920

catgctaatgagactgaacaaattatcgtattccttcctatacagagaatatcaaggcat1980

acataattaaatgcacacttattgctgaggtcccataaggttgcctgtgccaggtcacca2040

gacagctttaaaagtgctgtattatgttgcgtggtgagctgtggtgttgtttgatgttgt2100

actgggtactgtcacctgttgtgtggtgaggtgttgatgtggtgcactctgtttagtatg2160

ctgtggtgtgtgctgtgttgcatattgtgcggtgggttgttggctgtgtctactaggaca2220

ccaaacagctttcctatattgtgttgtggtatattgtgttgcgtagtgagctgttgtgtt2280

gtttgatgatgtactgtgtactgtcacttgtagtgtgttgtgtggtgagctgttgatgtg2340

gtgcactgtgtagtgtgacatggtgtgcactgtgtttagtatgctgtggtgtgtgttgtg2400

ttgcatattgtgtggtgggttgttagctgtggcattacagtactttatgtacatggaact2460

tgcaattcaaagtgaggtgcaaatcataccgtatcaacaagaaacatggtttgtcctact2520

tgaaaggtcacatgtagctacgtttaacatgtgtaggtattaaaaacctacgacataact2580

ttatcgtattaaaagagcgagattcatagcaaaacaatagtttaagatgcaggcgatgag2640

tcacaataacatggctgaagtatgttgaccagactacacactaaaaggtgaagggacgac2700

gacgtttcggtccgtcctgatccctcaagtcgattgtgagacgattgaacgtcgtcgtcc2760

cttcaccttctagtgtatggtctggtcaacaatagtttaagattatatttttactcctgg2820

cgatgagcacgccttcgttaacacgctacacgacgcataagaaaatgcctatatgatttg2880

aatagcaaagccacctatcataatttagcctagtgcaaaggaatgagcgttaagttggac2940

tccattgaaaagagataatgttgcctggcgttgtttcccaaaggtagaatcctatgtatg3000

ctttagatactagaaaataggtatcattatggtagtctggtgggtcagtgcattgtgtcg3060

gtgtgtccttttaagtaatcgttaatgcagtggatgtcgtctgtaagtaagaaaacaaaa3120

gaaaatgcgaagcccgggagactatttagcaccttctgtgtcacagaataatcaaaaggg3180

cttaaatatcgtccaataagatagcaaaaagatttcagacgagctatgttaatgctatct3240

cactcttgtcaaggggcaaatgacacttaaataatccttgacttactatagcatatataa3300

tatgtactatattagacctcagacagcgtgtattaggcctaggatggttaggttaggttt3360

ggttaagttttctttgcaacatcagtacaaaaacgtttgttttgtgcaaattcagtagtt3420

ctgatttctacttcctaatttatttttacgtcaatatatgtaccatggtcctcatcgtta3480

ctataagtactatctaaacaggaggttgggctcgttttacggtttatactaaaagaaacc3540

aatcgctattctgaaagactactcaccagtgatgtgtgctgatgcgattctgtcagccgt3600

tgcccaaaaaccctcaaatgcgacaagttcaagctactgtgaaactggtgcgaaacctga3660

actattgctgaaatattttatctttgcttaaaatactgccagttgtcacaaaagatgaat3720

tgctataatttttagtaagttcacaggaattaaaaattttaatttgcttttaaaatagct3780

ttatcattcttgtaagtcaatacctcgattaaaactgccaatttctttgcaagacgaaat3840

tcatatggtgaattaaaatgaatttgtgtgttgcagataacaaacaacacaggaaagtcc3900

aagccagcgacagtgaggatcttcatggctcctaaacacaacgagcgtggcctggagatg3960

ggcttcatggagcagcggctcctctgggctgagatggacaagttcactgagaactgtaag4020

tcacgccacacactctcattattatatattgttccttcagtaatatatattactgtaagt4080

cacgtcacacactctcattattatatattgttccttcagtaatatgtattactgtaaatc4140

acgtcacactctcattattatatattactccttcagtaatatatatgacatatttagcac4200

ctgtcagtttggctttcgccctcaaaagagtaccaacgattttattaatagtctgctgta4260

tataatctactcagcccttgacaaaaatgagtttccgattggactcttcattgacctgaa4320

aggcctttgatactgttaaccataacttcctcttacttaaactctaccattatggaatcc4380

gaggccttgccctgaactatatccgatcctatcttagtgtcggacaccattatgtatcca4440

tcaattatataacctctcccattctacaattaaccgtaggggtgccacagtgcagcatcc4500

ttacttattaggtgataagttgagtttgagatccatgaagtatgaagactgctgccttaa4560

tgacactggcagtcgatgtgacttcaattttgtatgattctaacaaaaaatatttattct4620

cagcactgctgtaattactgtcgaatgacatgactgttgttactatttagattaattaac4680

atatagataaatatgatttgctgatgacaaatgtaaacactggccttgtctaaatgatcc4740

catatttgttatgtacaatatactgacgtgttcacgtaagctatatggactaccagaact4800

aatgcactagttaacagtgaagcctgggaagaaccagattgtgcgtccttccagcgaatc4860

ttccatcaccacctccagcgagttcaccttcaggagcctggaggctgtcaaccccgctat4920

gccaggtaagggagaagtagagggcattgaactagaaagggtgaacataaatacagtata4980

attgtctatactgtgattggacaagtcgctcttacttcaagccgagtccattaatatata5040

tgttacttactggcgattaccagttagagaccggacctactcattgacgatcaacccgtc5100

ctcttaaaaaagaacgtcaattttggcccgtatgcgcactatggccaaatttggacgtaa5160

tttgaaatgaaatcgactcacaaaagtgacgttctgttccgttttctattgagtcgtctg5220

gcgtacgcgcagaggttataagaggacactttaaattaacgtttttcataacgttttgaa5280

actttatgagaatttcctgcccacctaacctatcagaggacccttaacttactgttgttg5340

aaaaaaaaatcccacatttattttcattttttttttcaatttcaaattacgtccaaattc5400

ggtcatacgggtaaacggccaaaagcgacgttctttttaagaggacaggttgcaactgac5460

cggatctacttactggtgatcaccagttcgagcccggcccatgctctttgtaatgtgata5520

gagaatatgaccaaaaaggttagagtaataattctagcatgaatcttttctatagttctc5580

atattctttacttaggaagtgatttcttcaatttactcttcagtgataagtgtcgctaaa5640

ggacgcgtttcactttatcgtccttagaggtagaagaaagtgattacagattatcagagg5700

tgacagtatacatgtctttgaggatgaggtgaggtgctgcccaaccaaggcactgggtac5760

tcatgtctttcattgtcattggtcgattggttgaataggtgaggtgtgttctggcagtac5820

taaagggttttatgagtgtatttgagttggaggagctgcctcgtatgggccaataggcct5880

tctgcagtcacctttgttcttatgttatttcatgtgtagcacttcggctatgtctaatat5940

agacataattttcattgtcacggacataaagactttactcaggcttgtattgaggtccgg6000

atagctcgacttactgcttcttcaccaggatgcaacccacaacagttgcctaatgcctaa6060

ctctaggggggctatttactgctgggtgaatagaggtatcagatgaaaggaaacatgcca6120

aactatttctgcctacgtggttaacaaacccgggatccccgagtcgaaaacgtagaccgg6180

cgtactataagacccgagcttgagcaaaaagtcacctgggctttcaagaaagacataacc6240

ggagtcacaaccctggaaacacaaaccgaaactgtctctattttccgcttattaaaactt6300

gtaataaagttgttacatcttggcttaacgtgtttatgacgtattagaacgttcttacaa6360

cttgctatattggttgttataactggttaggtggtgttaaaacttgttccaacgttgtac6420

caacgtcgtagtttcggtgtgtgtttggcgggaacacatcagacattcatctaactataa6480

atagacagcttagtcctgcaaaattacaagcattagtctcccatttaaaagtagcaatac6540

ctagcttatgatgccgcatgcgactggagtaatgtggcaataggacactaccaaaatgtt6600

cctactaactgaaataatcaccttcacctcaggagcaccacaaaatactgaagccaactt6660

ctgtgggtgtgggtggcctgaccacctgctgctgccccgaagtaaaccagaaggcatgac6720

ttaccagctcttcttcatgctcaccgacctggacaaggataaggtgcagtcaccattttt6780

gtcctcaccatttttgtcacagctcttcaacacacaatgaaacttctcattttttcatga6840

gtcgttggaattgactgttgtattatattagtttaaatttgtatgttaattaacaatacg6900

atttattactattaatatcagtatcttctgcgaaatttccacgtttcctttttatcataa6960

tataatcgaaactgagttcactgagactatatgttcactgagtgtacgtaatctgttttg7020

acgtgcaagaagaggaaccttaaatgttggtgttacaacttgttcaaactttattattat7080

cattagtgttatttcatgggattaatttgtcagtgaacttcctggggctgggaatgagtg7140

aagacaataaacagatagtgaccaactccggcccctgacaggtgatcagccagcagtacg7200

cagatgtgccgacgctgtgtccttctgcgggatcctggacgccaagttccctgacaaacg7260

tcctatgggcttccccttcgaccgccgccctccgcctagcctgcaagatgctgaggtcac7320

ctccgctgctgactacgctagactgggcaacataactattcaagatattaccatcacttt7380

cctcaacaacaaccttcagaagtcgaacaattaagaaaagtatgtgctaagccactaggt7440

tatatagagctgtttgtgttgtccagaatattcaagaatttctagctatcgttcaggatg7500

gtcgtaagatgatccatgtcaaaaggggtcagattcatatatcaattaccttgatatatg7560

tagcgtaatagaacagtgggtggaaacaaacaatttacaaatcaggacatgcaattagga7620

gaaaagaggaagactgcaattgacaataaggttcagtggggccggattcacgaaagcact7680

tatgcaaatacttacgaacgtgtacatctttcctcaatctttgacggctttggttacatt7740

tattaaacagtttacatgcatgaaaacttcccaatcaactgttgttattgttaaaaacag7800

cctccttttgcttcggagctcattaactgtttaataattggaaacaaagccgccaaagat7860

tgagaaaagatgtacaggttcgtaagtgcttgtgtaagtactttcgtgaatctggcccca7920

ggtctcttacattgtaacaccagcgtcttaaccttgtagttgataccttaccttgtagtt7980

gatacctaaccttgccattaacgttcccaactttatagtttttaatctttctcggtgata8040

ggaagccgaagcgaatatgtctgacggtagtagtagtagtagtagtattaggcttctatc8100

aatcacaggagactatggagttacgctctggttgtccatccctttgacgcaatttgttat8160

ttgtaatagctgagctatctttgtaacgaatgacaatcggactctgaataacatagtgga8220

tatgatagtggtatttactcactgccaatattgtcttaaacaaatcaagatgaagaatac8280

aaaataataaatttcagggccattcgaataattattcgtctcaatatgaaaccagttaat8340

tattttttggtatatatgaaaatactgatacatgggggcggggctttttaatataccttg8400

tgatgatatcggggctcagcgtccccgcggcccaggcctcctaaataaacatagtaattt8460

attttatgtgaatgaatacatgcggtgatatgttttataaagatataaacatttgattat8520

atacttgactaaaaggattaccaggctttgcccagggctgtctgcctgccttccatccat8580

ttcatctatctatcaatctatcctcctcctccttccctttatctcaaaaaatacattaag8640

aagcactgaaacaactttataggactaataaattatattattatggaatttattcatatg8700

ctaaatttctaacctgactataaaaatgccttaggggtgttttaattgttaatatttact8760

aaagcatttaccttaggcctactccgaccagcctatgtccgtcccgtacccaagaccagt8820

caccctgataatttggatgaggctaacctcaagcgtttgggctccacctttggacaaata8880

tatgttctttcatgtactaaagatgatctggatctgatcctgcatttgataatggatttt8940

tatctggatttgttattgcattttagtatgctatacgagatattattgttacatccatgt9000

ctgtcgactcgtacaagaattgtaattttattgtattatgcatgatttaatcactaataa9060

aatcaactaaaaaaaaaaaaaaaaa9085

<210>2

<211>1020

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aggagcaccacaaaatactgaagccaacttctgtgggtgtgggtggcctgaccacctgct60

gctgccccgaagtaaaccagaaggcatgacttaccagctcttcttcatgctcaccgacct120

ggacaaggataaggtgcagtcaccatttttgtcctcaccatttttgtcacagctcttcaa180

cacacaatgaaacttctcattttttcatgagtcgttggaattgactgttgtattatatta240

gtttaaatttgtatgttaattaacaatacgatttattactattaatatcagtatcttctg300

cgaaatttccacgtttcctttttatcataatataatcgaaactgagttcactgagactat360

atgttcactgagtgtacgtaatctgttttgacgtgcaagaagaggaaccttaaatgttgg420

tgttacaacttgttcaaactttattattatcattagtgttatttcatgggattaatttgt480

cagtgaacttcctggggctgggaatgagtgaagacaataaacagatagtgaccaactccg540

gcccctgacaggtgatcagccagcagtacgcagatgtgccgacgctgtgtccttctgcgg600

gatcctggacgccaagttccctgacaaacgtcctatgggcttccccttcgaccgccgccc660

tccgcctagcctgcaagatgctgaggtcacctccgctgctgactacgctagactgggcaa720

cataactattcaagatattaccatcactttcctcaacaacaaccttcagaagtcgaacaa780

ttaagaaaagtatgtgctaagccactaggttatatagagctgtttgtgttgtccagaata840

ttcaagaatttctagctatcgttcaggatggtcgtaagatgatccatgtcaaaaggggtc900

agattcatatatcaattaccttgatatatgtagcgtaatagaacagtgggtggaaacaaa960

caatttacaaatcaggacatgcaattaggagaaaagaggaagactgcaattgacaataag1020

<210>3

<211>1020

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aggagcaccacaaaatactgaagccaacttctgtgggtgtgggtggcctgaccacctgct60

gctgccccgaagtaaaccagaaggcatgacttaccagctcttcttcatgctcaccgacct120

ggacaaggataaggtgcagtcaccatttttgtcctcaccatttttgtcacagctcttcaa180

cacacaatgaaacttctcattttttcatgagtcgttggaattgactgttgtattatatta240

gtttaaatttgtatgttaattaacaatacgatttattactattaatatcagtatcttctg300

cgaaatttccacgtttcctttttatcataatataatcgaaactgagttcactgagactat360

atgttcactgagtgtacgtaatctgttttgacgtgcaagaagaggaaccttaaatgttgg420

tgttacaacttgttcaaactttattattattattagtgttatttcatgggattaatttgt480

cagtgaacttcctggggctgggaatgagtgaagacaataaacagatagtgaccaactccg540

gcccctgacaggtgatcagccagcagtacgcagatgtgccgacgctgtgtccttctgcgg600

gatcctggacgccaagttccctgacaaacgtcctatgggcttccccttcgaccgccgccc660

tccgcctagcctgcaagatgctgaggtcacctccgctgctgactacgctagactgggcaa720

cataactattcaagatattaccatcactttcctcaacaacaaccttcagaagtcgaacaa780

ttaagaaaagtatgtgctaagccactaggttatatagagctgtttgtgttgtccagaata840

ttcaagaatttctagctatcgttcaggatggtcgtaagatgatccatgtcaaaaggggtc900

agattcatatatcaattaccttgatatatgtagcgtaatagaacagtgggtggaaacaaa960

caatttacaaatcaggacatgcaattaggagaaaagaggaagactgcaattgacaataag1020

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aggagcaccacaaaatactgaagc24

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cttattgtcaattgcagtcttcctc25