一种聚集诱导荧光客体功能化的复合无限配位聚合物纳米粒子及其制备和应用的制作方法

本发明属于纳米材料制备及检测领域，涉及一种基于聚集诱导发光客体功能化无限配位聚合物的双比例型荧光可视化分析方法-多通道咖啡环试纸及其在2，6-吡啶二羧酸现场分析中应用。

背景技术：

自2001年起，炭疽杆菌(b.anthracis)孢子作为潜在的恐怖袭击试剂受到了全世界的广泛关注。炭疽杆菌的生命力强，传染途径广，能在土壤中存活几十年致病力不减，由该菌引起的炭疽病几乎遍及世界各地，致死率高，尤其是肺炭疽，对社会公共卫生和经济发展产生的危害极大。因此，开发可靠的方法，针对炭疽污染的生物标记物吡啶二羧酸(dpa)进行现场检测，对于控制炭疽病的爆发和预防具有重要意义。目前，针对dpa的检测多为基于镧系金属离子(ln³⁺)开发的分析方法，但是大多数分析方法都为单通道荧光响应模式或内参比型荧光响应模式，一方面，其很容易受到环境波动的影响而产生假阳性结果；另一方面，在紫外灯的激发下，其荧光颜色变化的分辨率较低，对dpa的定量分析依赖于实验室大型光学仪器，在现场分析的实际应用中受到一定限制。由于快速响应以控制炭疽病暴发和防止生物恐怖袭击的需求不断增加，不仅在方法的传感机制研究方面，同时对保证复杂环境体系中的方法的可靠性方面都需要进行重大改进。

近年来，无限配位聚合物(infinitecoordinationpolymers，icps)作为一种新型金属有机配位聚合物纳米材料日益引起人们的关注。icps的空间网络结构具有高度的“灵活性”，可通过原位自组装包裹性能，将多种具有不同光学性能的客体包裹于主体icps网络结构中，得到兼具主客体双重光学优势的复合icps纳米粒子。此外，更为重要的一点是，结构的柔性使其可以快速响应外部刺激，为设计基于刺激响应型复合icps纳米粒子的快速双响应进而设计新的可视化传感机制研究提供了基础。目前，大部分复合icps纳米粒子其主体icps中心金属离子多为镧系金属离子(ln-icps)，其斯托克斯位移较大，发射波段较宽，为了实现双重响应，对客体荧光分子光谱条件要求高，而符合光谱条件的客体多为具有聚集诱导荧光淬灭效应(acq)的荧光分子或荧光纳米材料，一方面，依赖于客体acq效应传感模式限制了复合icps纳米粒子主客体材料的选择与新的传感机制的开发；另一方面，依赖于客体acq效应的在试纸化或芯片化的过程中，随着试样的浓缩易受到影响，限制了实际应用。因此，利用具有抗acq效应的新型客体，发展全新的可视化传感机制与可视化分析方法具有重要意义。

聚集诱导发光(aie)现象，从2001年提出到现在，由于其极大地解决了传统acq荧光探针分子所面临的问题，给光学分析领域带来了新的机遇。与acq荧光分子的光学响应模式完全相反，具有aie性质的荧光分子，在稀溶液状态下发光微弱甚至难以观察到，但是当它们在溶液中发生聚集时或在固体状态下却可发出明亮的荧光。因此，将具有aie现象的荧光分子作为客体引入icps主体网络结构中，通过复合icps纳米粒子的刺激响应来调控客体的aie效应，将为建立基于激响应型复合无限配位聚合物纳米粒子的可视化传感新机制、新方法提供全新的思路。

咖啡环效应(cre)人们日常生活经常能观察到的现象，它是由液滴边缘蒸发速率大于中心蒸发速率，而致使液滴内部产生一个外向的毛细流动并将悬浮的粒子携带至液滴边缘而在边缘沉积成环状的现象。由于其体系简单方便、所需样品量少，整个检测过程仅仅依赖于正常的蒸发过程，在便携式、高通量现场检测中展现出了较大的优势。2005年，美国工程院院士、加州大学洛杉矶分校细胞控制研究所所长何志明教授领导的研究小组，将咖啡环效应用于纳米尺度下的色谱，实现不同尺寸的纳米颗粒的分离。对于复合icps纳米粒子而言，发生刺激响应后，其空间结构的改变将引起纳米粒子尺寸的变化，同时，伴随着大粒径复合icps纳米粒子数目减少，而小粒径的客体纳米粒子或小分子数目增大。由于咖啡环效应在小分子，小粒径贵金属粒子、聚合物纳米粒子等体系中都普遍存在，将咖啡环效应所具有的尺寸依赖性纳米色谱分离现象与上述复合icps纳米粒子发生刺激响应前后的尺寸变化相结合，有望通过咖啡环斑环的大小、环径的不同等变化，来进一步拓展信号的读出方式，发展基于咖啡环效应调控的多通道传感新机制、新策略。

迄今为止，选用具有基于聚集诱导发光性能的材料作为客体，合理设计主客体作用，制备具有同时展现me与aie效应的复合icps纳米材料，进一步通过调控金属竞争配位作用，进而改变客体的单体发射(me)与聚集体荧光发射(aie)，构建多重响应可视化传感新机制，发展更加可靠的比例型荧光可视化分析新方法；并将复合icps的刺激响应与咖啡环效应相结合，通过复合icps纳米粒子刺激响应前后的尺寸、数目的变化调控咖啡环沉积的形貌，将其转变为新的信号读出方式，结合荧光颜色的变化发展多通道传感模式，开发低成本试纸，结合装有图像识别与处理软件的智能手机，真正意义上实现针对2，6-吡啶二羧酸的现场分析还未见报道。

技术实现要素：

为克服上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种同时展现me与aie效应的聚集诱导荧光客体功能化复合无限配位聚合物纳米粒子(复合icps)。进一步通过调控金属竞争配位作用，进而改变客体的单体发射(me)与聚集体荧光发射(aie)，构建多重响应可视化传感新机制，发展更加可靠的双比例型荧光可视化分析新方法；并将复合icps的刺激响应与咖啡环效应相结合，通过复合icps纳米粒子刺激响应前后的尺寸、数目的变化调控咖啡环沉积的形貌，将其转变为新的信号读出方式，结合荧光颜色的变化发展多通道传感模式(方法)，开发低成本试纸，结合装有图像识别与处理软件的智能手机，真正意义上实现针对2，6-吡啶二羧酸的现场分析。

本发明提供了一种聚集诱导荧光客体功能化的复合无限配位聚合物纳米粒子(复合icps)，其具体包括主体、客体。

其中，所述主体icps选自任意一种金属离子与相应的配体自由配位结合而成的一种icps。

所述金属离子作为中心离子，为镧系金属离子(此时对应的主体为ln-icp)，包括铕离子(eu³⁺)、铽离子(tb³⁺)、铈离子(ce³⁺)、镧离子(la³⁺)、钕离子(nd³⁺)、钆离子(gd³⁺)、铒离子(er³⁺)、镱离子(yb³⁺)等中的一种或多种；优选地，为铕离子(eu³⁺)。

所述配体为生物碱配体，包括鸟苷-5’-单磷酸(gmp)、腺苷-5’-单磷酸(amp)、尿苷-5’-单磷酸(ump)、胞苷-5’-单磷酸(cmp)、鸟苷-5’-二磷酸(gdp)、腺苷-5’-二磷酸(adp)、尿苷-5’-二磷酸(udp)、胞苷-5’-二磷酸(cdp)、鸟苷-5’-三磷酸(gtp)、腺苷-5’-三磷酸(atp)、尿苷-5’-三磷酸(utp)、胞苷-5’-三磷酸(ctp)等中的一种或多种；优选地，为鸟苷-5’-单磷酸(gmp)。

进一步地，所述复合无限配位聚合物纳米粒子的主体ln-icp具体为eu/gmpicp，gmp是通过配体上的n7-c8和磷酸基团上的o与铕离子配位形成的网络结构。

其中，所述客体为具有聚集诱导发光效应的客体，其为在主体ln-icp中呈现出aie、在分散态下呈现出me的水溶性的亲水性基团功能化四苯基乙烯及其衍生物，包括多种磺酸根，羧酸根，季胺盐等亲水性基团的四苯基乙烯(tpe)衍生物等中的一种或多种；优选地，为四(4-磺苯基)乙烯钠盐(wssu-tpe)。

其中，所述金属离子、配体、客体的摩尔比为37：37：(1-10)；优选地，为37:37:1。

本发明中所述客体分子通过主客体分子相互作用被包裹进主体中，具体体现在：客体与主体中的金属离子配位作用以及其与主体中的配体之间的弱键相互作用，进而可以同时展现me、aie效应。

本发明还提供了所述复合icps的制备方法，先将配体和客体在缓冲溶液中混合，随后将金属离子的水溶液加入进行搅拌，得到所述复合icps。

其中，所述包含配体和客体的缓冲溶液中配体的最终浓度为1-10mm；优选地，为5mm。

其中，所述包含配体和客体的缓冲溶液中客体的最终浓度为0.01-1mg/ml；优选地，为0.1mg/ml。

其中，所述金属离子的水溶液的最终浓度为1-10mm；优选地，为5mm。

其中，所述缓冲溶液的浓度为0.01m-1m；优选地，为0.1m。

其中，所述缓冲溶液的ph为3-10；优选地，为ph＝7.4。

其中，所述缓冲溶液为三(羟甲基)氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液等；优选地，为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液。

具体地，所述缓冲溶液为浓度0.1m，ph＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液。

其中，所述搅拌的温度为20℃-40℃；优选地，为25℃。

其中，所述搅拌的时间为3min-15min；优选地，为5min。

本发明所述复合icps的制备方法还包括将搅拌后的体系进行洗涤离心数次弃去上清液的步骤。

在一个具体的实施方式中，所述复合icps是按照如下步骤的方法制备而得：将中心金属离子的水溶液加入含所述配体和客体的缓冲溶液中，在室温下搅拌5min，离心，洗涤，得到所述复合icps(水溶性四(4-磺苯基)乙烯钠盐客体功能化icps纳米粒子)。

本发明的技术难点在于加入客体、配体、金属离子的顺序：首先，需要将客体与配体混匀，由于配体和客体的非共价作用部分限制了客体中的苯环旋转，使其展现出me特性；随后，再加入金属离子，由于金属离子与客体的配位作用，此时形成复合icps，使其展现出aie特性。

因此，本发明复合icps的制备方法中配体必须与客体先混合敏化客体me，然后加入金属离子，形成复合icps，可以同时调控me与aie。

本发明还提供了由上述方法制备得到的所述聚集诱导荧光客体功能化复合无限配位聚合物纳米粒子。

本发明还提供了基于金属竞争配位调控所述聚集诱导荧光客体功能化复合无限配位聚合物纳米粒子的多重响应的可视化传感新机制，利用待测物质与icps中心金属离子具有较强配位作用的特点，可以改变主体中心金属离子的光学特性，同时，通过其与配体竞争与中心金属离子配位，改变复合icps的形貌，使客体由聚集态转变为分散态的过程中，aie下降，me升高，利用上述光谱的多重响应及其引起荧光颜色的明显改变，建立各种可视化传感新机制。

具体地，利用待测物质，如2，6-吡啶二羧酸(dpa)，与icps中心金属铕离子的强配位作用，破坏复合icps的配位方式，使其主体网络框架结构发生破裂，客体水溶性四苯基乙烯由聚集态向自由态转变，属于聚集态客体的荧光发射(aie，455nm)减弱，而属于单体态客体的荧光发射(me，390nm)增强；同时，待测物质(dpa)通过配位将自身的能量转移给中心金属铕离子(天线效应)，敏化其荧光(615nm)。通过调控金属竞争配位作用，利用wssu-tpe@eu/gmp复合icps(水溶性四(4-磺苯基)乙烯钠盐客体功能化icps纳米粒子)对待测物质(dpa)的刺激响应，改变主体空间构象，进而引起主客体多重光学响应与荧光颜色的明显变化，建立全新的可视化传感机制。

本发明还提供了所述基于金属竞争配位调控聚集诱导荧光客体功能化复合无限配位聚合物纳米粒子在可视化检测2，6-吡啶二羧酸中的应用。

本发明还提供了一种双比例型荧光可视化分析2，6-吡啶二羧酸的新方法，具体如下：

将2，6-吡啶二羧酸标准品加入至含有复合icps的缓冲分散液中，反应一段时间后，在一定的激发波长下用荧光仪进行测定。以dpa的浓度为横坐标，分别以390nm与455nm处荧光响应值的比值、以615nm与455nm(或592nm与455nm、652nm与455nm、693nm与455nm)处荧光响应值的比值为纵坐标，分别绘制标准曲线1和2，构建双比例型荧光可视化分析方法。同时，在紫外灯的激发下，于暗室内拍摄照片，使用色彩分析软件记录r值和b值。以dpa的浓度为横坐标，以照片中r值与b值的比值为纵坐标，绘制标准曲线3，建立直接可视化分析方法。

本发明所述的双比例型荧光可视化分析方法的特点为可以通过不同荧光波长处信号强度变化的比值表达检测信息，通常选用目标物作用后分别一升一降的两个峰。390nm与455nm分别属于wssu-tpe的me峰和aie峰，故标准曲线1选用f390/f455作为纵坐标；但因eu³⁺被敏化后有四个峰分别为592nm，615nm，652nm，693nm，故标准曲线2除f615/f455也可选用f592/f455、f652/f455、f693/f455作为纵坐标。若更换客体或者主体中的金属离子、配体均需要重新制备标准曲线。

本发明建立“双比例型荧光可视化分析方法”目的为提升在复杂环境体系中的分析结果的准确性与可靠性，克服“假阳性”干扰的问题。

本发明建立“直接可视化分析方法”目的为通过装有图像颜色识别软件的智能手机处理分析结果的照片，摆脱可视化现场准确定量分析受大型光学仪器制约的问题。

本发明中所述反应的温度为20℃-40℃；优选地，为25℃。

本发明中所述反应的时间为5s-30s；优选地，为15s。

本发明中所述激发波长为260nm-300nm；优选地为275nm。

本发明优选采用智能手机拍摄照片。

本发明采用智能手机拍摄所分析样品的时间为3-7min；优选地，为5min。

本发明中所述复合icps的缓冲分散液中，复合icps的浓度为0.3235mg/ml-1.294mg/ml；优选地，为0.647mg/ml。

本发明中所述复合icps的缓冲分散液中，缓冲分散液为浓度为10mm，ph为3-10的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液，具体地，缓冲分散液为浓度为10mm，ph＝7.4的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液。

所述含有复合icps的缓冲分散液总体积为1.0ml。

所述2，6-吡啶二羧酸标准品的体积为1-100μl；优选地，为10μl。

具体地，本发明采用双比例型荧光可视化分析2，6-吡啶二羧酸的方法为：

(1)建立标准曲线：对2，6-吡啶二羧酸标准品进行定量分析，以2，6-吡啶二羧酸浓度为横坐标，分别利用客体wssu-tpe的单体荧光发射强度(me，390nm)与聚集体荧光发射强度(aie，455nm)的比值f390/f455、被dpa敏化的eu³⁺的荧光发射与聚集体荧光发射强度(aie，455nm)的比值f615/f455(或f592/f455、f652/f455、f693/f455)为纵坐标，分别绘制标准曲线1和2，建立双比例型荧光可视化分析方法。

(2)在254nm紫外灯的激发下，使用智能手机于暗室内记录上述混合溶液的照片，以2，6-吡啶二羧酸浓度为横坐标，以照片中r/b值的比值为纵坐标，建立直接可视化分析方法。

本发明还提供了一种基于复合icps刺激响应调控咖啡环沉积形貌的多通道响应新模式(方法)，具体为：在亲水性或者疏水性基底上，通过调控水平方向上毛细驱动力作用下咖啡环色谱分离效应与垂直方向上蒸发效应的竞争作用，同时改变复合icps刺激响应过程中的粒子尺寸与数目，最终以不同咖啡环沉积形貌反映出来，作为新的信号读出方式，与荧光、颜色等结合起来，建立多通道响应新模式(方法)。结合客体独特的aie效应，开发多通道可视化试纸实现对待测分子(如dpa)的灵敏、可靠分析。

其中，所述亲水性基底具体指whatman1#试纸及其与性能相近的其他定性，定量滤纸及氨丙基三乙氧基硅烷(aps)处理后的玻璃芯片。

其中，所述疏水性基底具体指十六烷基三甲氧基硅烷(hds)处理后的玻璃芯片。

其中，所述不同咖啡环沉积形貌包括：成斑(咖啡环抑制)，成环(咖啡环生成)，斑与环的面积不同，斑与环的环径不同或形貌上的其他区别。

本发明还提出了所述复合icps刺激响应调控咖啡环沉积形貌的多通道响应模式(方法)在测定枯草芽孢杆菌孢子中2，6-吡啶二羧酸中的应用。

本发明还提出了一种咖啡环产品，所述咖啡环产品为基于复合icps刺激响应调控咖啡环在不同基底上沉积形貌的多通道响应产品，具体为：在各种定性、定量滤纸试纸或各种玻璃芯片基底上，通过调节温度、试纸基底的孔径、基底的亲疏水性等条件，利用咖啡环色谱分离效应与其他效应(如过滤效应、蒸发效应、marangoni效应等)的竞争作用，同时改变复合icps纳米粒子刺激响应过程中的粒子尺寸与数目，以不同咖啡环沉积形貌(如成斑(抑制)、成环、斑环的面积大小，环径大小)反映出来，并将其拓展为新的信号读出方式，结合颜色、荧光等变化，开发可用于精确定量分析的咖啡环产品。

所述咖啡环产品包括咖啡环试纸、咖啡环芯片等。

本发明还提出了所述咖啡环产品在检测2，6-吡啶二羧酸中的应用。

本发明还提出了一种咖啡环产品的制备方法，具体包括如下步骤：

将一系列不同浓度的2，6-吡啶二羧酸标准样品加入到复合icps的缓冲分散液中制成混合物，将一定体积的混合物滴涂于基底上，在一定温度和湿度的条件下，等待其干燥后制成多通道响应式咖啡环产品。

本发明中所述复合icps的缓冲分散液中，复合icps的浓度为1.941mg/ml-3.882mg/ml；优选地，为3.24mg/ml。

本发明中所述复合icps的缓冲分散液中，缓冲分散液为浓度为10mm，ph为3-10的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液，具体地，缓冲分散液为浓度为10mm，ph＝7.4的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液。

所述含有复合icps的缓冲分散液总体积为1.0ml。

所述2，6-吡啶二羧酸标准品的体积为1-100μl；优选地，为10μl。

所述基底为各种定性、定量滤纸试纸或各种玻璃芯片。

所述定性、定量滤纸试纸具体指whatman1#试纸。

所述一定体积具体指5μl。

所述一定温度和湿度具体指25℃，相对湿度46％。

本发明所述的干燥是自然干燥。

本发明还提出了一种咖啡环试纸，所述咖啡环试纸其基底为亲水性试纸，包含whatman1#试纸及其与性能相近的其他定性，定量滤纸，所述滤纸的直径为5-10mm；优选地，为6mm。

本发明所述的咖啡环试纸上可以呈现不同的沉积形貌，包括：成斑(咖啡环抑制)，成环(咖啡环生成)，斑与环的面积不同，斑与环的环径不同或形貌上的其他区别。

本发明所述的“咖啡环试纸”的多重响应模式，不同通道之间可以作为自身对照，克服了现有试纸和技术中信号读出方式单一的问题，提升了复杂环境体系中的分析结果的准确性与可靠性。

本发明还提供了一种咖啡环试纸在检测2，6-吡啶二羧酸中的应用。

本发明还提供了一种多通道咖啡环试纸检测2，6-吡啶二羧酸的方法，将一系列不同浓度的2，6-吡啶二羧酸标准品加入至上述复合icps的缓冲分散液中，混匀后，将其滴涂于试纸基底上，在紫外灯的激发下，于暗室内拍摄分析结果照片，依据不同浓度2，6-吡啶二羧酸标准样品使得试纸斑环图案、中心斑点的颜色产生的相应变化，构建多通道咖啡环试纸，实现对2，6-吡啶二羧酸标准品进行定量分析。

具体地，本发明所述多通道咖啡环试纸检测2，6-吡啶二羧酸的方法为：

将一系列不同浓度的2，6-吡啶二羧酸标准品加入至上述复合icps的缓冲分散液中，混匀后，将其滴涂于亲水性试纸上。在254nm紫外灯的激发下，使用智能手机于暗室内拍摄分析结果的照片，使用色彩分析软件记录试纸光斑中心r值和b值，以r/b值的比值作为纵坐标，以dpa浓度为横坐标，绘制标准曲线4(通道1)。同时，使用图像分析软件分析eu/dpa小分子覆盖的光环面积aring与复合icps材料覆盖的光斑面积aspot，以aring/aspot纵坐标为纵坐标，以dpa浓度为横坐标，绘制标准曲线5(通道2)。

本发明绘制标准曲线4和5的目的为使用该试纸的不同通道实现对样品中2，6-吡啶二羧酸浓度测定，各通道之间检测结果可进行自身对照，提高了该试纸的可靠性。

所述复合icps的浓度为3.24mg/ml

所述2，6-吡啶二羧酸标准品与复合icps混合物的体积为5μl。

本发明还提供了一种可直接用于细菌孢子中2，6-吡啶二羧酸现场分析的可视化方法，具体为：

将所述针对2，6-吡啶二羧酸的双比例型荧光可视化分析新方法中2，6-吡啶二羧酸标准品替换为细菌孢子悬浮液，按照所述针对2，6-吡啶二羧酸的双比例型荧光可视化分析新方法测得实际样品的对应的荧光响应值的比值，代入标准曲线1、标准曲线2，对实际样品2，6-吡啶二羧酸的浓度进行测定，获得结果1，2。按照所述针对2，6-吡啶二羧酸的双比例型荧光可视化分析新方法，结合智能手机测得所述实际样品的对应的r/b的比值，代入标准曲线3，对实际样品2，6-吡啶二羧酸的浓度进行测定，获得结果3，然后与结果1，2进行自身对照。

将所述针对2，6-吡啶二羧酸的咖啡环试纸中2，6-吡啶二羧酸标准品替换为细菌孢子悬浮液，结合智能手机测得试纸上光斑中心r/b的比值，代入标准曲线4，获得结果4；分析试纸上aring/aspot，代入标准曲线5，获得结果5；将所得结果4，5进行自身对照，确保分析结果的准确性。

所述细菌孢子悬浮液，具体为枯草芽孢杆菌在70℃的条件下丙氨酸溶液处理30分钟和60分钟，过滤去除菌体后制备的孢子悬浮液，也不局限于该种细菌。

利用本发明所述的复合icps可以实现对细菌孢子悬浮液中2，6-吡啶二羧酸进行现场分析的实际应用。

利用本发明所述的多通道咖啡环试纸可以实现对细菌孢子悬浮液中2，6-吡啶二羧酸进行现场分析的实际应用。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

1)本发明创新性地选择聚集诱导发光材料作为客体，通过调控主客体相互作用制备一种同时具有me与aie效应的复合无限配位聚合物纳米粒子，降低了对主体材料光学性能的要求，为开发基于刺激响应型复合icps的可视化传感新机制设计提供了可能；

2)本发明通过设计金属竞争配位作用，利用复合icps对dpa的刺激响应改变主体构象，同时调控客体的me，aie效应及主体中心金属离子的敏化效应，建立了刺激响应型复合icps的全新可视化传感机制，解决了传感机制单一的问题；发展了双比例型荧光可视化分析方法，有效提升了dpa现场分析结果的准确性与可靠性；

3)本发明创新性地将复合icps刺激响应与咖啡环效应相结合，通过复合icps纳米粒子刺激响应前后的尺寸、数目的变化调控咖啡环沉积的形貌，将其转变为新的信号读出方式，结合荧光颜色的改变构建了多通道的传感新模式。在此基础上，充分利用客体的独特光学优势开发多通道咖啡环试纸，各通道分析结果可作为自身对照，保证了试纸在实际定量分析应用中的可靠性。

4)本发明通过装有图像识别与数据处理软件的智能手机处理分析结果的照片，真正意义上解决了可视化分析中依赖大型光学仪器的问题，可以满足突发公共安全事件中大批量样品的现场快速检测的需求。

附图说明

图1是wssu-tpe@eu/gmpicps的sem图、sem-eds(插图)(a)及荧光图谱(b)。

图2是本发明制备的wssu-tpe@eu/gmpicps检测dpa的工作原理。

图3是wssu-tpe@eu/gmpicps在dpa作用后的sem图(a)及荧光图谱(b)。

图4是dpa作用下wssu-tpe@eu/gmpicps双比例型荧光响应曲线(a)及线性图(b、c)。

图5是dpa作用下wssu-tpe@eu/gmpicps的荧光颜色改变照片(a)及基于智能手机分析的线性图(b)。

图6是多通道响应式咖啡环试纸检测dpa的工作原理。

图7是多通道响应式咖啡环试纸的沉积图案(a)及线性图(b、c)。

图8是基于智能手机对枯草芽孢杆释放孢子的dpa的可视化现场分析与多通道咖啡环试纸。

图9为使用激光共聚焦显微镜对枯草芽孢杆菌释放dpa的实时监测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原料如无特别说明，均能从公开商业途径而得。

实施例1.同时展现me与aie响应性能的聚集诱导荧光单体功能化复合无限配位聚合物纳米粒子的制备与表征

wssu-tpe是按照文献报道的方法制备而得的(newj.chem.2017,41,4747-4749；supramol.chem.2017,30,1-8)，将四苯乙烯(1.00g，3.0mm)分散于20ml浓硫酸中，并在120℃下加热3小时。此后，将10ml水和30ml乙酸乙酯加入到该混合物中以终止反应。过滤所得沉淀物，用10ml乙酸乙酯洗涤两次，得到纯的tpe-so3h，为灰色固体。随后，tpe-so3h物溶解于20ml水中，并用0.1m的naoh水溶液中和。冷冻干燥后，将得到的固体用10ml丙酮洗涤两次，得到黄色固体tpe-so3na，即为wssu-tpe。

在搅拌状态下，将5ml浓度为10mm的硝酸铕的水溶液加入到5ml含有10mm鸟苷-5’-单磷酸和0.2mg/ml的wssu-tpe的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲溶液(0.1m，ph＝7.4)。其中，硝酸铕的最终浓度为5mm，鸟苷-5’-单磷酸的最终浓度为5mm，wssu-tpe的最终浓度为0.1mg/ml。室温搅拌5min，离心，用2ml的去离子水洗涤3次，所得产物即为复合icps(wssu-tpe@eu/gmp)。图1a是wssu-tpe@eu/gmp的sem图，从图中可以看出wssu-tpe@eu/gmp为规则的球形纳米粒子，sem-eds(插图)中s元素(来自wssu-tpe)的出现也表明客体被成功包裹于主体网络结构中，图1b是wssu-tpe@eu/gmpicps的荧光光谱图，其表明当配体存在时，wssu-tpe的me被敏化，而通过主客作用的调控当wssu-tpe@eu/gmp形成后，wssu-tpe由分散态转变为聚集态，敏化的me(390nm)减弱，而aie(455nm)增强。

实施例2.基于wssu-tpe@eu/gmpicps的dpa双比例型荧光可视化分析方法

本发明双比例型荧光可视化分析方法的原理如图2所示，利用dpa与eu之间极强的配位作用(logkeu-dpa＝7.46±0.02)破坏配体gmp与eu³⁺的配位(logkeu-gmp＝4.04±0.02)，进而使主体结构发生破坏，一方面wssu-tpe由聚集态转变为分散态，me(390nm)增强，而aie(455nm)减弱，另一方面dpa与eu³⁺配位后会将自身能量转移给eu³⁺敏化其荧光(615nm)。图3a是本发明实施例1制备的wssu-tpe@eu/gmpicps与dpa作用后的sem图，其表明dpa存在时，复合icps主体结构确实被完全破坏。同时如图3b所示，dpa存在时，wssu-tpe@eu/gmpicps的荧光光谱呈现出中心金属离子与客体三重光学响应，且三重光学响应并无光谱交叉干扰，荧光颜色呈现出明显的由蓝至红的改变，为构建双比例型荧光可视化方法奠定了基础。

将10μl一系列浓度(依次为0μm，8μm，10μm，50μm，0.1mm，0.3mm，0.5mm，0.7mm，1mm，1.5mm，2mm，2.5mm，3.0mm，3.5mm，4.0mm)的dpa标准样品加入990μl含有0.647mg/ml本发明实施例1制备的wssu-tpe@eu/gmp的hepes缓冲液(浓度为10mm，ph＝7.4)(最终浓度依次为0，0.08，0.10，0.50，1.0，3.0，5.0，7.0，10，15，20，25，30，35，40μm)15秒后，使用荧光仪进行测定(λex＝275nm)，所得荧光图谱如图4a所示。以dpa浓度为横坐标，分别以390nm与455nm处荧光响应值的比值、615nm与455nm处荧光响应值的比值为纵坐标，可绘制标准曲线1，2，如图4b、c所示。如图4b所示，标准曲线1对应的一元线性方程为a＝0.084x+0.217(r²＝0.995)，a为f390/f455，无单位，x为dpa浓度，单位为μm，最低检测限为30nm。如图4c所示，标准曲线2对应的一元线性方程为0.247x+0.099(r²＝0.996)，a为f615/f455，无单位，(或a＝0.012x+0.355(r²＝0.978)，a为f592/f455，无单位；a＝0.0055x-0.0006(r²＝0.970)，a为f652/f455，无单位；a＝0.039x-0.046(r²＝0.983)，a为f693/f455，无单位。)x为dpa的浓度，单位为μm，最低检测限为27nm。在254nm紫外灯的激发下，使用智能手机于暗室内拍摄上述混合溶液的照片(如图5a)，使用色彩分析软件记录r值和b值。以dpa的浓度为横坐标，以图片中r值与b值的比值为纵坐标，绘制标准曲线3，如图5b所示，一元线性方程为a＝0.025x+0.167(r²＝0.992)，a为r/b，无单位，x为dpa的浓度，单位为μm，最低检测浓度为100nm。

实施例3.基于wssu-tpe@eu/gmpicps对dpa刺激响应的多通道咖啡环试纸

将10μl一系列浓度(依次为500μm，1mm，5mm，10mm，15mm，20mm)的2，6-吡啶二羧酸标准样品加入990μl3.24mg/ml的本发明实施例1制备的复合icps的缓冲分散液中制成混合物(最终浓度为5，10，50，100，150，200μm)。滴加5μl的混合物于直径约为6毫米的whatman#1亲水性试纸上，在温度25℃，相对湿度～46％时，等待其干燥后制成多通道响应式咖啡环试纸。

如图6所示，本发明中基于的原理是在试纸上固定的分析区间内，基于毛细驱动力的咖啡环色谱分离效应与垂直蒸发效应的竞争，当2，6-吡啶二羧酸的浓度不同时，wssu-tpe@eu/gmp所形成的咖啡环的图案也不同。由于较大尺寸的wssu-tpe@eu/gmp蒸发可以抵消毛细驱动力的咖啡环效应，从而沉积成斑点覆盖试纸。同时，由于客体wssu-tpe的aie效应，该斑点在254nm紫外灯的激发下呈现出亮蓝色荧光色。但随着dpa的加入，复合icps材料wssu-tpe@eu/gmp的结构被破坏，形成了尺寸较小且具有强烈红色荧光发射eu/dpa复合物，从而试纸外围出现具有红色荧光的环形结构。随着2，6-吡啶二羧酸浓度的进一步提高，毛细管流可同时调节复合icps材料粒径和量的变化，使得斑点的荧光颜色逐渐从蓝色变为红色，同时外围环面积变大、中心斑点面积变小。

使用智能手机中安装的图像识别和处理软件分析制成的多通道响应式咖啡环试纸(图7a)，以dpa的浓度为横坐标，分别以咖啡环试纸环状图案的r值与中心斑点图案的b值的比值、咖啡环试纸环状图案的面积与中心斑点图案的面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线4，5，如图7b所示，标准曲线4对应的一元线性方程为a＝0.0054x+0.171(r²＝0.991)，其中a为咖啡环试纸中心斑点处的r/b值的比值，无单位，x为dpa的浓度，单位为μm，最低检测浓度为5μm；如图7c所示，标准曲线5对应的一元线性方程为a＝0.0296x+0.138(r²＝0.990)，其中a为环斑面积aring/aspot，无单位，x为dpa浓度，单位为μm，最低检测浓度为5μm。

实施例4.基于双比例型荧光可视化方法及多通道咖啡环试纸现场分析dpa

孢子悬浮液的制备方法如下：将枯草芽孢杆菌接种在luria-bertani培养基(10g/l胰蛋白，5g/l酵母提取物，10g/lnacl)上，在37℃的恒温振荡培养箱(150r/min)中培养72小时，离心洗涤数次直至上清液无色，随后收集枯草芽孢杆菌冷冻干燥，储存在4℃的冰箱中。取10mg枯草芽孢杆菌粉末溶解于100μl浓度为10mm的丙氨酸溶液中，在70℃的条件下分别水浴一段时间，过滤去除菌体后制得孢子悬浮液。

将本发明实施例2中2，6-吡啶二羧酸标准品替换为孢子悬浮液，按照实施例2所述方法检测水浴30分钟和60分钟的孢子悬浮液，根据孢子悬浮液的荧光响应，分别代入标准曲线1、2、3，结果如图8a所示。丙氨酸处理30分钟与60分钟后，标准曲线1中测得的dpa的浓度分别为22.56±0.03μm；36.07±08.06μm，标准曲线2中测得的dpa的浓度分别为22.53±0.02μm，36.09±0.07μm，标准曲线3中测得的dpa的浓度分别为23.94±0.26μm，34.13±0.15μm。

将本发明实施例3中2，6-吡啶二羧酸标准品替换为孢子悬浮液，并按照实施例3分析所得咖啡环图案，代入标准曲线4与5，得到孢子悬浮液中dpa浓度，如图8b所示。丙氨酸处理30分钟与60分钟后，试纸标准曲线4中测得的dpa的浓度分别为26.04±0.31μm，37.05±0.24μm；试纸标准曲线5中测得的dpa的浓度分别为25.19±0.46μm；38.41±0.35μm。由多通道响应式咖啡环试纸的不同通道所得dpa浓度吻合程度高，此外，不论是双比例型可视化方法还是多通道试纸，其分析结果具有较好的一致性，从本质上确保了该发明在复杂样品分析中的可靠性，可直接用于实际样品中的dpa的现场分析。

实施例5.枯草芽孢杆菌释放dpa的实时监测

使用本发明实施例4中的孢子悬浮液，分别水浴0min，30min，60min后将其与本发明实施例1制备的复合icps混合均匀。随后，使用激光共聚焦显微镜分别采集蓝色通道(430-500nm)与红色通道(580-650nm)的图像，如图9所示。随着水浴时间的增加，其图像表现出明显的变化：蓝色通道的荧光颜色变弱，红色通道的发光变强。此现象是由于复合icps可以通过静电作用吸附在孢子上，进而与孢子释放的dpa反应。随着孢子释放dpa的增多，复合icps被破坏导致蓝色通道荧光强度减弱；释放的dpa与eu³⁺反应生成eu/dpa复合物，导致红色通道荧光增强。据此，便可观察孢子周围的双响应光学变化，从而实现对枯草芽孢杆菌释放dpa的实时监测。

综上，本发明创新性地选用具有基于聚集诱导发光性能的wssu-tpe作为客体，对主客体相互作用进行合理设计，制备具有同时展现me与aie效应的wssu-tpe@eu/gmpicps纳米材料。通过设计dpa、配体与中心金属离子之间的竞争配位作用，进而破坏主体空间构象，调控wssu-tpe的单体发射(me)与聚集体荧光发射(aie)，同时敏化eu³⁺荧光，利用上述三重光学响应构建可视化传感新机制，发展更加可靠的双比例型荧光可视化分析新方法；同时基于该复合icps材料纳米粒子刺激响应调控咖啡环沉积形貌，发明了一种多通道响应式咖啡环试纸，具有成本低廉，携带方便，反应时间快，所需样品量小，操作简单，分析结果吻合度高等优点，可直接实现对待测样品中dpa的简单可靠的定量检测。以上发明可直接用于枯草芽孢杆菌孢子中dpa的现场分析，在社会公共安全相关领域具有较大的实际应用前景。

以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。