一种乳腺癌21基因检测试剂盒的制作方法

本发明涉及体外诊断领域，尤其涉及一种乳腺癌21基因检测试剂盒。
背景技术：
：21基因表达测定法包括16个与癌症相关的基因和5个参考基因，被开发为多基因阵列，用于评估患有hr阳性，her2阴性和淋巴结阴性的早期乳腺癌患者手术后的残留风险。16个癌症相关基因分成五组：1、细胞增殖相关的基因：ki67、stk15、survivin、ccnb1(cyclinb1)、mybl2；2、细胞侵袭相关基因：mmp11(stromolysin3)、ctsl2(cathepsinl2)；3、雌激素相关基因：er、pgr、bcl2、scube2；4、her2相关基因：grb7和her2(erbb2)；5、三个独立的基因：gstm1、cd68、bag1；6、5个内参基因：actb(b-actin)、gapdh、rplpo、gus、tfrc。这个检测能够为早期乳腺癌患者手术后预后效果提供治疗效果预测和10年复发风险的预测，从而可预测乳腺癌复发指数以及接受化疗的效益比，来帮助雌激素受体阳性、淋巴结阴性的乳腺癌患者制定术后是否需要化疗的方案。目前，市面上销售的乳腺癌检测的试剂盒主要有两种，一种是传统荧光定量pcr检测21基因表达水平，尽管该方法效果评价良好，但是耗时较长，获得结果所需时间较长；另外一种是原位杂交技术检测，该技术同样效果评价良好而且假阳性较低，但是同样耗时较长。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种乳腺癌21基因检测试剂盒，该检测试剂盒的检测时间短，评价效果好，操作简单，易于推广使用。为实现以上目的，本发明提供一种乳腺癌21基因检测试剂盒，包括：恒温荧光pcr扩增酶混合液，所述混合液包括:链置换重组蛋白uvsx、链置换辅助蛋白uvsy、单链结合蛋白gp32、恒温扩增酶bsu，用于检测所述21基因的上下游引物以及探针，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团，所述21基因依次包括1-21号基因：ki67、stk15、survivin、ccnb1、mybl2、mmp11、ctsl2、grb7、erbb2、er、pgr、bcl2、scube2、gstm1、bag1、cd68、gapdh、actb、rplpo、gus、tfrc，检测1号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.1～seqidno.3，检测2号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.4～seqidno6，检测3号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.7～seqidno.9，检测4号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.10～seqidno.12，检测5号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.13～seqidno.15，检测6号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.16～seqidno.18，检测7号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.19～seqidno.21，检测8号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.22～seqidno.24，检测9号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.25～seqidno.27，检测10号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.28～seqidno.30，检测11号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.31～seqidno.33，检测12号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.34～seqidno.36，检测13号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.37～seqidno.39，检测14号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.40～seqidno.42，检测15号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.43～seqidno.45，检测16号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.46～seqidno.48，检测17号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.49～seqidno.51，检测18号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.52～seqidno.54，检测19号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.55～seqidno.57，检测20号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.58～seqidno.60，检测21号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.61～seqidno.63。进一步的，第1、6、8、10、13、15、17、19号基因的探针5’端标记的荧光基团为fam，第2、7、9、11、14、16、18、20号基因的探针5’端标记的荧光基团为hex，第3、4、5、12、21号基因的探针5’端标记的荧光基团为rox。进一步的，还包括所述21基因的dna质粒。进一步的，还包括mgac溶液。进一步的，所述mgac的摩尔浓度为250-300mm。进一步的，所述mgac的使用体积为2.0-3.0μl。本发明的有益效果：本发明克服了传统荧光定量pcr耗时长的问题，通过在乳腺癌21基因检测试剂盒中加入恒温荧光定量pcr扩增酶混合液，引入最新恒温荧光定量pcr扩增的技术，使得整个扩增时间由原来的的2-3h缩短到40min-1h，而且操作比传统方法更简便，大大的节约了医检人员的时间成本。同时，也减短了医生与病人等待结果的时间，可以更早更快的为病人后续的化疗提供最优方案。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。图1为本发明实施例乳腺癌样本mrna提取凝胶电泳结果图。图2为本发明实施例恒温荧光pcr扩增反应程序。图3为本发明实施例21基因检测对照实验结果图。图4为本发明实施例试剂盒21基因检测结果图。具体实施方式如本文所用之术语：“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说a组分的质量份为a份，b组分的质量份为b份，则表示a组分的质量和b组分的质量之比a：b。或者，表示a组分的质量为ak，b组分的质量为bk(k为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。本发明提供一种乳腺癌21基因检测试剂盒，包括：恒温荧光扩增酶混合液，所述混合液包括:链置换重组蛋白uvsx、链置换辅助蛋白uvsy、单链结合蛋白gp32、恒温扩增酶bsu，用于检测所述21基因的上下游引物以及探针，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团，所述21基因依次包括1-21号基因：ki67、stk15、survivin、ccnb1、mybl2、mmp11、ctsl2、grb7、erbb2、er、pgr、bcl2、scube2、gstm1、bag1、cd68、gapdh、actb、rplpo、gus、tfrc，检测1号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.1～seqidno.3，检测2号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.4～seqidno6，检测3号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.7～seqidno.9，检测4号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.10～seqidno.12，检测5号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.13～seqidno.15，检测6号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.16～seqidno.18，检测7号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.19～seqidno.21，检测8号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.22～seqidno.24，检测9号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.25～seqidno.27，检测10号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.28～seqidno.30，检测11号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.31～seqidno.33，检测12号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.34～seqidno.36，检测13号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.37～seqidno.39，检测14号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.40～seqidno.42，检测15号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.43～seqidno.45，检测16号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.46～seqidno.48，检测17号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.49～seqidno.51，检测18号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.52～seqidno.54，检测19号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.55～seqidno.57，检测20号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.58～seqidno.60，检测21号基因的上下游引物及探针序列分别为seqidno.61～seqidno.63。通过在乳腺癌21基因检测试剂盒中加入恒温荧光定量pcr扩增酶混合液，引入最新恒温荧光定量pcr扩增技术检测乳腺癌样本，使得整个扩增时间由原来的的2-3h缩短到40min-1h，而且操作比传统方法更简便，大大的节约了医检人员的时间成本。同时，也减短了医生与病人等待结果的时间，可以更早更快的为病人后续的化疗提供最优方案。进一步的，第1、6、8、10、13、15、17、19号基因的探针5’端标记的荧光基团为fam，第2、7、9、11、14、16、18、20号基因的探针5’端标记的荧光基团为hex，第3、4、5、12、21号基因的探针5’端标记的荧光基团为rox。具体的，fam为绿色荧光基团，hex为紫色荧光基团，rox为红色荧光基团。进一步的，还包括所述21基因的dna质粒。具体的，21基因的dna质粒作为阳性对照。进一步的，还包括mgac溶液。进一步的，所述mgac的摩尔浓度为250-300mm。进一步的，所述mgac的使用体积为2.0-3.0μl。下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例121基因pcr引物和检测探针设计在uniprot上查找的21个基因的蛋白序列，从refseq找到ncbi上相对应的信息，从cds中查找基因核苷酸序列，并且按照恒温荧光扩增pcr的引物设计与探针设计原则设计引物和探针，其中探针设计原理包括5’端第一个序列不能为g碱基，3’端最后一个序列必须为a碱基，避免3’端的前4个序列里含有3个或以上g碱基，避免探针中间区域含有2个或以上的连续c碱基，设计好的引物与探针序列如下表1所示，其中fam、hex、rox为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1、bhq2为淬灭基团，荧光基团、四氢呋喃以及淬灭基团之间的碱基数可以为0、1或者2。表1.21基因各引物与探针序列实施例2恒温荧光定量pcr检测样本21基因水平处理石蜡包埋的乳腺癌标本，从中提取总mrna，取2μl进行凝胶电泳，结果如图1所示，1和2泳道均为样本mrna结果。然后用全式金一步法反转录试剂盒，将mrna反转成cdna。以cdna为模板，检测样本乳腺癌21基因表达水平，通过本发明中的特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测21基因表达水平。同时，以21个基因dna质粒为阳性对照模板，建立恒温多重荧光pcr检测21基因表达水平的反应体系，最终以ct值计算rs值作为结果判断的标准。上述恒温多重荧光pcr扩增反应体系分8管配制见下表：管号fam荧光信号hex荧光信号rox荧光信号1mki67aurkabirc52mmp11ctsvccnb13grb7erbb2mybl24esr1pgrbcl25scube2gstm1n/a6baglcd68n/a7gapdhactbn/a8rplagusbtfrc具体为：1号管配制体系:序号物料物料浓度用量(μl)1primerfreerehydrationbufferlx29.5221-mki67-f10μm2.1321-mki67-r10μm2.1421-mki67-p10μm0.6521-aurka-f10μm2.1621-aurka-r10μm2.1721-aurka-p10μm0.6821-birc5-f10μm2.1921-birc5-r10μm2.11021-b1rc5-p10μm0.611cdna模板—3.612总体积—47.52号管配制体系:序号物料物料浓度用量(μl)1primerfreerehydrationbufferlx29.5221-mmp11-f10μm2.1321-mmp11-r10μm2.1421-mmp11-p10μm0.6521-ctsv-f10μm2.1621-ctsv-r10μm2.1721-ctsv-p10μm0.6821-ccnb1-f10μm2.1921-ccnb1-r10μm2.11021-ccnb1-p10μm0.611cdna模板—3.612总体积—47.53号管配制体系:序号物料物料浓度用量(μl)1primerfreerehydrationbufferlx29.5221-grb7-f10μm2.1321-grb7-r10μm2.1421-grb7-p10μm0.6521-erbb2-f10μm2.1621-erbb2-r10μm2.1721-erbb2-p10μm0.6821-mybl2-f10μm2.1921-mybl2-r110μm2.11021-mybl2-p10μm0.611cdna模板—3.612总体积—47.54号管配制体系:序号物料物料浓度用量(μl)1primerfreerehydrationbufferlx29.5221-esr1-f10μm2.1321-esr1-r10μm2.1421-esr1-p10μm0.6521-pgr-f10μm2.1621-pgr-r10μm2.1721-pgr-p10μm0.6821-bcl2-f10μm2.1921-bcl2-r10μm2.11021-bcl2-p10μm0.611cdna模板—3.612总体积—47.55号管配制体系:序号物料物料浓度用量(μl)1primerfreerehydrationbufferlx29.5221-scube2-f10μm2.1321-scube2-r10μm2.1421-scube2-p10μm0.6521-gstm1-f110μm2.1621-gstm1-r10μm2.1721-gstm1-p10μm0.68无菌水4.89cdna模板—3.610总体积—47.56号管配制体系:序号物料物料浓度用量(μl)1primerfreerehydrationbufferlx29.5221-bag1-f10μm2.1321-bag1-r10μm2.1421-bag1-p10μm0.6521-cd68-f10μm2.1621-cd68-r10μm2.1721-cd68-p10μm0.68无菌水4.89cdna模板—3.610总体积—47.57号管配制体系:8号管配制体系:序号物料物料浓度用量(μl)1primerfreerehydrationbufferlx29.5221-rplpo-f10μm2.1321-rplpo-r10μm2.1421-rplpo-p10μm0.6521-gusb-f10μm2.1621-gusb-r10μm2.1721-gusb-p10μm0.6821-tfrc-f10μm2.1921-tfrc-r10μm2.11021-tfrc-p10μm0.611cdna模板—3.612总体积—47.5将上述各管同时以21基因dna质粒为模板代替cdna加入各相应管中作为阳性对照扩增。以上各成分加好后，涡旋震荡，再加入2.5μlmgac(280mm)，混匀后，短速离心后，放入abi7500荧光pcr扩增仪上进行扩增。以上试剂组分：primerfreerehydrationbuffer与280mmmgac均购自英国twistdx公司，primerfreerehydrationbuffer为恒温pcr扩增酶混合干粉用rehydrationbuffer溶解后得到的恒温荧光扩增酶混合液。所述恒温荧光pcr扩增的反应条件如图2所示：40℃预变性30sec，1个循环；40℃变性25sec，40℃退火35sec，40℃延伸10sec，30个循环，在退火时检测fam、hex和rox荧光信号。采用abi7500荧光pcr扩增仪检测fam、hex和rox荧光信号的ct值。一次可检测12份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光pcr扩增仪显示的每个基因的ct值如图3和图4所示，图3为阳性对照，图4为样本实验结果，ct值均≦35，证明21基因的表达为阳性，结果基本与市面上售卖的试剂盒的数据一致，故该试剂盒结果可信，而且比起其他试剂盒更加省时。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12