一种酶促在线合成3-（吡啶-2-氨基）丙羟肟酸的方法与流程

本发明涉及一种在线合成3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸的方法。
背景技术：
：异羟肟酸是一类非常重要的有机配体，由于能与金属离子螯合形成强氢键而具有多种生物活性。它们能与基质金属蛋白酶、tnf-a转换酶、血管紧张素转换酶、脂氧合酶、lta4水解酶、尿素酶、肽脱甲酰化酶、组蛋白去乙酰化酶、前胶原c-蛋白酶等多种含金属的酶相互作用。通过与这些金属酶靶向作用，异羟肟酸类药物被用于治疗癌症、心血管疾病、艾滋病、阿尔茨海默症、疟疾、过敏性疾病、高血压、肺结核、青光眼、溃疡、金属中毒等多种疾病。研究发现，基于芳香胺的β-氨基异羟肟酸可作为脲酶抑制剂，用于治疗幽门螺杆菌感染。因此探索合成芳氨类β-氨基异羟肟酸的绿色合成技术具有重要的意义。β-氨基酸酯衍生物是合成芳氨类β-氨基异羟肟酸的重要中间体。同时是许多氨基酸及天然产物的基本结构单元。β-氨基酸酯在药物合成中应用广泛，可作为许多生物活性分子的合成基石，如抗生素、抗肿瘤药物、抗病毒药物、抗精神病药物、医药中间体等。同时，β-氨基酸酯被用于构建β-氨基酸酯聚合物，在生物医学中应用广泛，如作为抗癌药物、抗菌药物的药物载体，蛋白质输送和组织修复等，这在药物化学和材料科学中都具有重要意义。2004年，thomas等人以3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物为中间体合成了一系列吡啶二氮杂卓酮衍生物，并研究了其对多巴胺d4受体的选择性。因此探索合成β-氨基酸酯类化合物的绿色合成技术具有重要的意义。(a)h2,pd-c(5％),etoh,1500hpa；(b)acoh(96％),reflux,4h吡啶二氮杂卓酮衍生物的合成氨与α,β-不饱和酯类化合物的迈克尔加成是制备原子经济性高的β-氨基酸酯最简单、最有效的方法之一。目前，氨类化合物的迈克尔加成反应常用的催化剂主要有酸、碱和金属配体等。酸和碱催化迈克尔加成反应易产生副反应，而且不适用于对酸和碱敏感性的底物。过渡金属配体催化剂虽然具有催化活性高、用量少等优点，然而缺点也比较明显，一是制备比较困难；二是由于过渡金属大部分是贵金属，因此造价比较高；三是稳定性差，不易分离回收套用，不仅会污染产品，还会污染环境。芳香胺由于其弱亲核性和较大空间位阻使其不易发生迈克尔加成。在过去的研究中，三氟甲磺酸、叔丁醇钾、磁性纳米粒子、离子液体和铜、钴、铝、铁等金属的配合物作为催化剂，被用于催化芳香胺的迈克尔加成反应来合成β-氨基酸酯。这些反应催化剂制备工艺繁琐，生产成本昂贵，不易大量制备而适应于工业化生产。由此，探索芳氨类β-氨基酸酯的绿色合成方法在有机合成中成为一个热点研究的领域。酶催化反应由于其高效、绿色及专一性强成为绿色化学研究的一个重点。酶促反应因反应条件温和，选择性高及产物稳定性好而在工业生物合成、医疗保健和食品工业等领域得到了广泛的应用。但是酶促反应存在着溶剂对底物溶解以及溶剂极性对酶活抑制等的制约，反应时间往往很长(24h～96h)，对特定底物转化率不是很高，因而在传统酶促反应基础上发展一种基于微流控技术的酶促芳氨类β-氨基酸酯类化合物的合成新技术成为我们的研究目标。同常规化学反应器相比，微流控反应器具有混合效率高、传质传热快、参数控制精确、反应选择性高以及安全性好等特点而被广泛应用于有机合成反应。在连续流动微反应器中，许多反应可以实现微量反应的条件快速筛选，即使在苛刻的实验条件下也可以进行安全反应，大幅度节约了反应原料、提高了筛选效率，使之更加贴合绿色化学的概念。到目前为止，酶催化芳香胺迈克尔加成反应合成β-氨基酸酯的研究还相对较少。皱褶假丝酵母脂肪酶cal-b(lipasebfromcandidaantarctica)能有效的催化反应的进行，但该方法需要较长的反应时间(72h)，且对于特定底物反应的转化率不高。为了开发一种高效绿色的芳氨类β-氨基异羟肟酸合成的新技术。我们研究了微流控通道反应器中脂肪酶催化在线合成3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物的方法，并在微流控通道反应器中以3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物为原料进一步合成了3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸，旨在寻找一种高效环保的3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸的合成的新技术。技术实现要素：本发明旨在提供一种微流控通道反应器中在线合成3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸的新工艺方法，该方法具有反应时间短、产率高的优点。本发明的技术方案如下：一种酶促在线合成3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸(v)的方法，所述方法包括：(1)以甲醇为反应溶剂、2-氨基吡啶(i)和丙烯酸酯(ii)为原料、脂肪酶lipozymermim为催化剂；将原料2-氨基吡啶(i)和丙烯酸酯(ii)各自用溶剂甲醇溶解后，分别置于注射器中，将脂肪酶lipozymermim均匀填充在微流控通道反应器的反应通道中，在注射泵的推动下，注射器中的2-氨基吡啶(i)溶液和丙烯酸酯(ii)溶液连续通入反应通道中进行迈克尔加成反应，控制反应温度为30～55℃(优选35℃)，反应液在反应通道内连续流动的反应时间为10～50min(优选30min)，通过产物收集器在线收集流出反应通道的反应液，经后处理，得到产物3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物(iii)；通入反应通道内的反应液中，2-氨基吡啶(i)与丙烯酸酯(ii)的物质的量之比为1：0.5～8，特别优选1：4；所述2-氨基吡啶(i)和丙烯酸酯(ii)各自用溶剂甲醇溶解后，所得2-氨基吡啶(i)溶液的浓度推荐在0.5mmol/ml，丙烯酸酯(ii)溶液的浓度推荐在0.25～4mmol/ml；所述脂肪酶lipozymermim使用诺维信(novozymes)公司生产的商品，其是一种由微生物制备的、1,3位置专用、食品级脂肪酶(ec3.1.1.3)在颗粒硅胶上的制剂，它是从rhizomucormiehei得到的、用一种基因改性米曲霉(aspergillusoryzae)微生物经过深层发酵生产的；所述脂肪酶lipozymermim可通过物理法直接将颗粒状的催化剂均匀固定于反应通道内即可；在所述反应通道可容纳所填充催化剂的最大限度内，催化剂的加入量以反应介质的体积计为0.043g/ml；具体的，所述后处理的方法为：将反应液减压蒸馏除去溶剂，进行硅胶柱层析分离，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为石油醚：乙酸乙酯体积比＝1：2的混合液，tlc跟踪洗脱进程，收集含目标化合物的洗脱液，蒸除溶剂并干燥，得到产物3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物(iii)；(2)以甲醇为反应溶剂、步骤(1)所得3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物(iii)和盐酸羟胺(iv)为原料、甲醇钠为催化剂；将3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物(iii)溶于甲醇并置于注射器中，将盐酸羟胺(iv)和甲醇钠溶于甲醇并置于另一注射器中，在注射泵的推动下，两个注射器中的料液连续通入反应通道中进行羟胺缩合反应，控制反应温度为0℃，反应液在反应通道内连续流动的反应时间为10min，通过产物收集器在线收集流出反应通道的反应液，经后处理，得到产物3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸(v)；通入反应通道内的混合反应液中，3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物(iii)、盐酸羟胺(iv)、甲醇钠的物质的量之比为1：1：2；优选的，所述3-(吡啶-2-氨基)丙酸酯衍生物(iii)溶于甲醇后，所得溶液的浓度为0.1mmol/ml；所述盐酸羟胺(iv)和甲醇钠溶于甲醇后，所得溶液中盐酸羟胺(iv)的浓度为0.1mmol/ml，甲醇钠的浓度为0.2mmol/ml；所述后处理的方法具体例如：将反应液减压蒸馏除去溶剂，进行硅胶柱层析分离，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为甲醇：二氯甲烷体积比＝1：20的混合液，tlc跟踪洗脱进程，收集含目标化合物的洗脱液，蒸除溶剂并干燥，得到产物3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸(v)；式(ii)或(iii)中，r1＝ch3或c(ch3)3。本发明方法采用微流控通道反应器，所述微流控通道反应器包括：第一注射器、第二注射器、反应通道、产物收集器；所述第一注射器、第二注射器经y型或t型管道连接反应通道入口，所述产物收集器通过管道与反应通道出口连接；具体的，所述第一注射器、第二注射器安装于注射泵中，由注射泵同步推动；所述反应通道的内径为2.0mm，反应通道长为1.0m；反应通道的材质不限，推荐使用绿色、环保的材质，例如硅胶管；对于反应通道的形状最好为曲线形，可以保证反应液匀速稳定的通过；所述微流控通道反应器还可包括恒温箱，将所述反应通道置于恒温箱中，以此可以有效控制反应温度，所述恒温箱可以根据反应温度要求自行选择，比如水浴恒温箱等。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明在微流控通道反应器中在线合成3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸(v)，该法不仅大大地缩短了反应时间，而且具有高的转化率；同时首次利用经济的脂肪酶lipozymermim催化氨基吡啶与丙烯酸酯的迈克尔加成反应，降低了反应成本，具有经济高效的优势。附图说明图1为本发明实施例采用的微流控通道反应器的结构示意图。图中，1-第一注射器，2-第二注射器，3-反应通道，4-产物收集器，5-水浴恒温箱。具体实施方式下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：本发明实施例使用的微流控通道反应器的结构参考图1，包括一个注射泵(未显示)、两个注射器1和2、反应通道3、水浴恒温箱(5，仅显示其平面示意图)和产物收集器4；两个注射器1和2安装于注射泵中，通过一个y型接口与反应通道3入口连接，所述反应通道3置于水浴恒温箱5中，通过水浴恒温箱5控制反应温度，所述的反应通道3的内径2.0mm，管长1.0m，所述反应通道3出口通过一接口与产物收集器4连接。实施例1：3-(吡啶-2-氨基)丙酸甲酯的合成装置参考图1：将2-氨基吡啶(5.0mmol)溶解在10mlmeoh中，丙烯酸甲酯(20.0mmol)溶解在10mlmeoh中，然后分别装于10ml注射器中备用。0.87g脂肪酶lipozymermim均匀填充在反应通道中，在phd2000注射泵推动下，两路反应液分别以10.4μl·min-1的流速通过“y”接头进入反应通道中进行反应，通过水浴恒温箱控制反应器温度在45℃，反应液在反应通道内连续流动反应30min，反应结果通过薄层色谱tlc跟踪检测。通过产物收集器在线收集反应液，减压蒸馏除去溶剂，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为石油醚:乙酸乙酯＝1:2，柱高35cm，柱直径4.5cm，样品用少量洗脱试剂溶解后湿法上柱，洗脱液收集流速2ml·min-1，同时tlc跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，得到白色固体，获得3-(吡啶-2-氨基)丙酸甲酯，hplc检测3-(吡啶-2-氨基)丙酸甲酯转化率54％。核磁表征结果如下：1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ8.04(ddd,j＝5.1,1.9,0.9hz,1h),7.34(ddd,j＝8.4,7.1,1.9hz,1h),6.51(ddd,j＝7.1,5.1,1.0hz,1h),6.35(dt,j＝8.4,1.0hz,1h),5.04(t,j＝6.3hz,1h),3.64(s,3h),3.60(q,j＝6.3hz,2h),2.61(t,j＝6.3hz,2h)；13cnmr(126mhz,cdcl3)δ172.85,158.12,147.85,137.11,112.76,107.50,51.52,37.19,33.87.实施例2-6改变微流控微通道反应器中的溶剂，控制温度45℃，其他同实施例1，结果如表1所示：表1溶剂对反应的影响实施例溶剂转化率[％]2叔戊醇n.d.3乙腈n.d.4甲苯355二氯甲烷n.d.6乙醇261甲醇50表1的结果表明，当2-氨基吡啶和丙烯酸甲酯底物物质的量之比为1:4，流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应温度均为45℃，反应器以meoh为有机溶剂时反应的转化率最优，所以本发明中微流控微通道反应器中最佳溶剂为甲醇。实施例7-11改变微流控通道反应器的温度，其他同实施例1，反应结果如表2所示：表2：温度对反应的影响实施例温度[℃]转化率[％]73042835549405314550105041115535表2的结果表明，当流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应器以meoh为有机溶剂，2-氨基吡啶和丙烯酸甲酯物质的量之比均为1:4，当反应温度处于35℃时，反应的转化率最佳，温度或太高或太低都将影响酶的活性。所以本发明中微流控微通道反应器中最佳温度为35℃。实施例12-16以2-氨基吡啶的用量为基准，改变微流控微通道反应器中2-氨基吡啶和丙烯酸甲酯的物质的量之比，控制温度35℃，其他同实施例8，结果如表3所示：表32-氨基吡啶和丙烯酸甲酯底物物质的量之比对反应的影响表3的结果表明，当流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应温度均为35℃，反应器以meoh为有机溶剂，随着反应物丙烯酸甲酯增加，反应的转化率也随着增加，当底物比2-氨基吡啶和丙烯酸甲酯为1:4时，反应的转化率最优，所以本发明中微流控微通道反应器中最佳底物物质的量之比为1:4。实施例17-20改变微流控通道反应器的反应时间，其他同实施例8，反应结果如表4所示：表4反应时间对反应的影响实施例时间[min]转化率[％]1710818203783054194051205046表4的结果表明，当反应器以meoh为有机溶剂，反应物2-氨基吡啶和丙烯酸甲酯物质的量之比均为1:4，反应温度均为35℃，当反应时间为30min的时候，反应转化率为54％。所以本发明中微流控微通道反应器中最佳反应时间30min。对比例1-4改变微流控微通道反应器中的催化剂，分别改为猪胰脂肪酶ppl(对比例1)、脂肪酶novozym435(对比例2)、枯草杆菌碱性蛋白酶(对比例3)、脂肪酶tmim(对比例4)，其他同实施例8，结果如表5所示。表5：不同酶对反应转化率及选择性的影响对比例酶源转化率[％]1ppln.d2novozym435n.d3枯草杆菌碱性蛋白酶n.d4lipozymetmim33实施例8lipozymermim54表5的结果表明，对于微流控通道反应器中酶促2-氨基吡啶迈克尔加成反应而言，不同的酶对反应有着十分明显的影响。利用脂肪酶tmim催化该反应，2-氨基吡啶的转化率为33％。而利用novozym435催化反应，2-氨基吡啶的转化率为0％。从表5的结果看，对于微流控通道反应器中酶促2-氨基吡啶迈克尔加成反应而言，最有效的催化剂为脂肪酶lipozymermim，2-氨基吡啶的转化率为54％。对比例5改变微流控通道反应器中丙烯酸酯的种类，将丙烯酸酯的种类改为丙烯酸丁酯(对比例5)，其他同实施例8，反应结果如表6所示：表6：不同丙烯酸酯对反应转化率的影响结果表明，不同丙烯酸酯的结构对2-氨基吡啶的迈克尔加成反应转化率有重要影响，在丙烯酸丁酯中，2-氨基吡啶的转化率仅有5％，而在丙烯酸甲酯中，2-氨基吡啶的转化率达到54％。实施例21：3-(吡啶-2-氨基)丙酸叔丁酯的合成装置参考图1：将2-氨基吡啶(5.0mmol)溶解在10mlmeoh中，丙烯酸叔丁酯(20.0mmol)溶解在10mlmeoh中，然后分别装于10ml注射器中备用。0.87g脂肪酶lipozymermim均匀填充在反应通道中，在phd2000注射泵推动下，两路反应液分别以10.4μl·min-1的流速通过“y”接头进入反应通道中进行反应，通过水浴恒温箱控制反应器温度在45℃，反应液在反应通道内连续流动反应30min，反应结果通过薄层色谱tlc跟踪检测。通过产物收集器在线收集反应液，减压蒸馏除去溶剂，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为石油醚:乙酸乙酯＝1:2，柱高35cm，柱直径4.5cm，样品用少量洗脱试剂溶解后湿法上柱，洗脱液收集流速2ml·min-1，同时tlc跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，得到白色固体，获得3-(吡啶-2-氨基)丙酸叔丁酯，hplc检测3-(吡啶-2-氨基)丙酸叔丁酯转化率40％。核磁表征结果如下：1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ8.04(ddd,j＝5.1,1.9,0.9hz,1h),7.34(ddd,j＝8.4,7.1,1.9hz,1h),6.51(ddd,j＝7.1,5.1,1.0hz,1h),6.35(dt,j＝8.4,1.0hz,1h),5.04(t,j＝6.3hz,1h),,3.60(q,j＝6.3hz,2h),2.61(t,j＝6.3hz,2h),1.42(s,9h)；13cnmr(126mhz,cdcl3)δ172.85,158.12,147.85,137.11,112.76,107.50,82.1,37.19,33.87,28.7.实施例22-26改变微流控微通道反应器中的溶剂，控制温度45℃，其他同实施例21，结果如表7所示：表7溶剂对反应的影响实施例溶剂转化率[％]22叔戊醇523乙腈n.d.24甲苯1225二氯甲烷n.d26乙醇n.d21甲醇36表7的结果表明，当2-氨基吡啶和丙烯酸叔丁酯底物物质的量之比为1:4，流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应温度均为45℃，反应器以meoh为有机溶剂时反应的转化率最优，所以本发明中微流控微通道反应器中最佳溶剂为甲醇。实施例27-31改变微流控通道反应器的温度，其他同实施例21，反应结果如表8所示：表8温度对反应的影响表8的结果表明，当流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应器以meoh为有机溶剂，35℃时，2-氨基吡啶的转化率最高，温度太高或太低都将影响酶的活性。所以本发明中微流控微通道反应器中最佳温度为35℃。实施例32-36以2-氨基吡啶的用量为基准，改变微流控微通道反应器中2-氨基吡啶和丙烯酸叔丁酯的物质的量之比，控制温度35℃，其他同实施例28，结果如表9所示：表92-氨基吡啶和丙烯酸叔丁酯物质的量之比对反应的影响实施例2-氨基吡啶和丙烯酸叔丁酯转化率[％]321:0.55331:119341:231281:440351:637361:835表9的结果表明，当流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应温度均为35℃，反应器以meoh为有机溶剂，随着反应物丙烯酸叔丁酯增加，反应的转化率也随着增加，当底物比2-氨基吡啶和丙烯酸叔丁酯为1:4时，反应的转化率最优，所以本发明中微流控微通道反应器中最佳底物物质的量之比为1:4。实施例37-40改变微流控通道反应器的反应时间，其他同实施例28，反应结果如表10所示：表10反应时间对反应的影响实施例时间[min]转化率[％]37106382024283040394039405036表10的结果表明，当反应器以meoh为有机溶剂，反应物3-2-氨基吡啶和丙烯酸叔丁酯物质的量之比均为1:4，反应温度均为35℃，当反应时间为30min的时候，反应转化率为40％。所以本发明中微流控微通道反应器中最佳反应时间30min。对比例6-9改变微流控微通道反应器中的催化剂，分别改为猪胰脂肪酶ppl(对比例6)、脂肪酶novozym435(对比例7)、枯草杆菌碱性蛋白酶(对比例8)、脂肪酶tmim(对比例9)，其他同实施例28，结果如表11所示。表11不同酶对反应转化率的影响对比例酶源转化率[％]6ppln.d7novozym435n.d8枯草杆菌碱性蛋白酶n.d9lipozymetmim25实施例28lipozymermim40表11的结果表明，对于微流控通道反应器中酶促2-氨基吡啶迈克尔加成反应而言，不同的酶对反应有着十分明显的影响。利用脂肪酶tmim催化该反应，2-氨基吡啶的转化率为25％。而利用novozym435催化反应，2-氨基吡啶的转化率为0％。从表11的结果看，对于微流控通道反应器中酶促2-氨基吡啶迈克尔加成反应而言，最有效的催化剂为脂肪酶lipozymermim，2-氨基吡啶的转化率为40％。对比例10改变微流控通道反应器中丙烯酸酯的种类，将丙烯酸酯的种类改为丙烯酸丁酯(对比例10)，其他同实施例28，反应结果如表12所示：表12不同丙烯酸酯对反应转化率的影响对比例丙烯酸酯转化率[％]10丙烯酸丁酯5实施例28丙烯酸叔丁酯40结果表明，不同丙烯酸酯的结构对2-氨基吡啶的迈克尔加成反应转化率有重要影响，在丙烯酸丁酯中，2-氨基吡啶的转化率仅有5％，在丙烯酸叔丁酯中，2-氨基吡啶的转化率达到40％。实施例41：3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸的合成装置参考图1：将3-(吡啶-2-氨基)丙酸甲酯(1.0mmol)溶解在10mlmeoh中，盐酸羟胺(1.0mmol)和甲醇钠(2.0mmol)溶解在10mlmeoh中，然后分别装于10ml注射器中备用。在phd2000注射泵推动下，两路反应液分别以157.0μl·min-1的流速通过“y”接头进入反应通道中进行反应，通过水浴恒温箱控制反应器温度在0℃，反应液在反应通道内连续流动反应10min，反应结果通过薄层色谱tlc跟踪检测。通过产物收集器在线收集反应液，减压蒸馏除去溶剂，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为甲醇:二氯甲烷＝1:20，柱高35cm，柱直径4.5cm，样品用少量洗脱试剂溶解后湿法上柱，洗脱液收集流速2ml·min-1，同时tlc跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，得到白色固体，获得3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸，hplc检测3-(吡啶-2-氨基)丙羟肟酸转化率74％。核磁表征结果如下：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ10.41(s,1h),8.73(s,1h),7.96(dd,j＝5.3,1.9hz,1h),7.34(ddd,j＝8.7,7.0,2.0hz,1h),6.46(d,j＝1.5hz,1h),6.45(d,j＝3.1hz,1h),6.43(s,1h),3.44(q,j＝6.7hz,2h),2.25(t,j＝7.0hz,2h)；13cnmr(126mhz,dmso)δ167.85,158.60,147.50,136.54,111.55,108.17,37.31,32.57.当前第1页12