一种生物催化制备达芦那韦中间体的方法与流程

本发明属于生物催化方法及应用
技术领域：
，涉及一种生物催化制备达芦那韦中间体的方法，尤其涉及一种生物催化制备(2s,3s)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
背景技术：
：(2s,3s)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇做为制备达芦那韦的关键中间体，目前主要生产工艺有化学合成法和生物法两种，其中生物法可由相应的酮还原酶或微生物全细胞生物转化3s-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇获得。而化学法在甲醇中与二碳酸二叔丁酯反应，以l-苯丙氨酸为起始原料，得到n-boc-l-苯丙氨酸，在重氮化后通入氯化氢得到氯酮；采用高手性选择性的醛酮-醇铝化合物催化还原法，使用异丙醇铝/异丙醇对氯酮进行还原得到氯醇。该合成路线具有步骤短，收率高，成本低等优势，是化学法中较有优势的一条路线。专利文件jp4746548b2最早提出用生物法制备(2r，3s)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(结构i)，该专利利用一种新型的羰基還元酵素，不对称地还原(3s)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2r，3s)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。该专利同时在中国申请保护并在2011年取得授权(cn1993464b)。后续其他公司如美国codexis等在酶种类、反应条件、以及辅酶循环等条件进行优化提升，进一步提高生产效率，以期降低条件要求及成本(us8796002)。目前，(2r，3s)醇已可通过酮还原酶突变体实现产业化放大(不低于100g/l底物)，但尚无报道对(2s，3s)醇的工业化生产。技术实现要素：本发明的目的在于解决现有技术中(2s,3s)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(结构ii)酶催化制备过程中酶活低，催化反应效率低的技术问题。提供一种生物催化制备达芦那韦中间体的方法，技术方案如下：一种生物催化制备达芦那韦中间体的方法，其特征在于，通过酮还原酶突变体能将3s-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2s,3s)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，酮还原酶突变体源于starmerellamagnoliae的野生型酮还原酶，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与seqidno.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：i54e,s85a,k182v，所述酮还原酶突变体的序列为seqidno.4。优选的，所述酮还原酶突变体的酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-15倍。一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的编码序列为seqidno.4的酮还原酶重组的多肽。优选的，所述多核苷酸的序列为seqidno.3。一种重组质粒，其特征在于，包括表达载体连接序列为seqidno.3的多核苷。一种宿主细胞，其特征在于，其包含如权利要求5的重组质粒。优选的，所述细胞是一种大肠杆菌。优选的，所述重组质粒的密码子已经为在宿主细胞中表达而进行优化了的密码子。通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：酮还原酶突变体源于starmerellamagnoliae的野生型酮还原酶，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与seqidno.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：i54e,s85a,k182v，该酮还原酶突变体的序列为seqidno.4。本发明整个体系使用单酶催化，使用醇类用于辅酶循环，底物浓度高达110g/l，底物用量/nadp用量高达1100:1，辅酶循环次数高，有效的扩大了下游应用范围。对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产达芦那韦的关键中间体(2s,3s)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇无副产物产生，纯化方便；此外反应溶剂主要为水，三废排放低，绿色环保。附图说明图1为sma-2的表达质粒图谱；图2为sma，sma-2生物转化反应3小时的tlc图谱，从左至右第一列为sma，第三列为sma-2，上方条带为底物，下方条带为产物。具体实施方式为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。实施例1通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到拼接引物。合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o总体系50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.3，命名为sma-2，其对应的氨基酸序列为seqidno.4，表达质粒图谱如图1所示。实施例2对照蛋白cksm基因序列的合成根据seqidno.7所示序列，委托南京金斯瑞生物对该蛋白的编码序列进行全基因合成，并克隆至pet30a中，得到对照蛋白表达质粒nyk-cksm。其对应的氨基酸序列为seqidno.8。实施例3摇瓶表达测试挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行sds-page检测。实施例4分批补料发酵分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15l，工作体积为8l，所用到的培养基为酵母抽提物24g/l,蛋白胨12g/l,葡萄糖0.4％,2.31g/l磷酸二氢酶和12.54g/l磷酸氢二钾,ph7.0。初级接种菌种制备200ml培养物，od2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的ph值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当od600约为35.0(湿重约为60g/l)时，用0.2mmiptg诱导。实施例5生物转化反应在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入3ml甲苯，21ml异丙醇，21g3s-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mmmgcl2，0.1mpbph8.5使总体系约190ml，混匀后调节ph至8.5。最后加入21mgnadp，10ml粗酶液sma-2，30℃水浴反应。实施例6生物转化反应在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入3ml甲苯，21ml异丙醇，21g3s-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mmmgcl2，0.1mpbph8.5使总体系约190ml，混匀后调节ph至8.5。最后加入21mgnadp，10ml粗酶液sma，30℃水浴反应。实施例7薄层色谱分析将上述实施例中的3小时反应转化体系进行tlc检测，结果如图2所示。可见sma-2的底物剩余均明显少于对照sma；由此可判断sma-2在催化3s-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的反应速度上明显优于突变前的野生型蛋sma。实施例8酶活检测取6个5ml离心管，分别标号1-6，分别加入3mm的nadph溶液0ul，40ul，80ul，100ul，120ul，160ul，然后每管补加0.1m，ph7.0的磷酸盐缓冲液补足3ml，混匀后在340nm下检测并记录吸光度的值；根据上述测得值，得到nadph的标准曲线y＝k*x，其中y为吸光度的值，x为nadph的浓度(mm)，曲线的r2>99.5％；用纯水按一定的倍数稀释酶液(参考稀释倍数：600-1000倍)，稀释的倍数使每分钟吸光值变化0.02-0.04之间为合适；取5ml离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿。在340nm处检测吸光度的变化，每隔1min记录一个值，每分钟的变化率基本相同，其中0min的吸光度为s0，3min的吸光度为s3；酶活计算公式：酶活(u/ml)＝[(s0-s3)*3ml*n]/[k×时间(t/min)×加酶量(ml)]其中n为酶液的稀释倍数。检测结果如下：可见，本发明提供的醇脱氢酶突变体，其醇脱氢酶活性比野生型醇脱氢酶的活性至少增强2-15倍。与野生型醇脱氢酶相比，使底物(例如3s-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇)向产物(例如(2s,3s)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇)转化速率大幅增加。且进一步的增加了单位体积的底物浓度，利于工业放大时提高生产效率。以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。序列表<110>南京朗恩生物科技有限公司<120>一种生物催化制备达芦那韦中间体的方法<130>2020<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>741<212>dna<213>人工序列()<400>1atgacctcttcttcttctccgtctctgaacgctctggttaccggtggttctcgtggtatc60ggtgaagctatctctatgcagctggctgctgaaggttactctgttaccatcgcttctcgt120ggtctggaacagctggaagctgttaaagctaaactgccggaagttaaacagggtcagacc180caccacgtttggcagctggacctgtctgacgttgaagctgctggttctttcaaaggtgct240ccgctgccggctgcttcttacgacgttttcgtttctaacgctggtatctctcagttctct300ccgatcgctgaacacgctgacgctgactggcagaacatgctgaccgttaacctgaccgct360ccgatcgctctgaccaaagctgttgttaaagctatctctgacaaaccgcgtcagaccccg420gctcacatcatcttcatctctaccggtctgtctaaacgtggtgctccgatggttggtgtt480tactctgcttctaaagctggtatcgacggtttcatgcgttctctggctcgtgaactgggt540ccggttggtatcaacgttaactgcgtttctccgggtgttacccgtacctctatggctgaa600ggtatcgacccgtctatgttcgacctgccgatcaacggttggatcgaagttgacgctatc660gctgacgctgttacctacctggttaaatctaaaaacgttaccggtaccaccgtttctgtt720gacaacggttactgcgcttaa741<210>2<211>246<212>prt<213>人工序列()<400>2metthrserserserserproserleuasnalaleuvalthrglygly151015serargglyileglyglualailesermetglnleualaalaglugly202530tyrservalthrilealaserargglyleugluglnleuglualaval354045lysalalysleuprogluvallysglnglyglnthrhishisvaltrp505560glnleuaspleuseraspvalglualaalaglyserphelysglyala65707580proleuproalaalasertyraspvalphevalserasnalaglyile859095serglnpheserproilealagluhisalaaspalaasptrpglnasn100105110metleuthrvalasnleuthralaproilealaleuthrlysalaval115120125vallysalaileserasplysproargglnthrproalahisileile130135140pheileserthrglyleuserlysargglyalaprometvalglyval145150155160tyrseralaserlysalaglyileaspglyphemetargserleuala165170175arggluleuglyprovalglyileasnvalasncysvalserprogly180185190valthrargthrsermetalagluglyileaspprosermetpheasp195200205leuproileasnglytrpilegluvalaspalailealaaspalaval210215220thrtyrleuvallysserlysasnvalthrglythrthrvalserval225230235240aspasnglytyrcysala245<210>3<211>741<212>dna<213>人工序列()<400>3atgacctcttcttcttctccgtctctgaacgctctggttaccggtggttctcgtggtatc60ggtgaagctatctctatgcagctggctgctgaaggttactctgttaccatcgcttctcgt120ggtctggaacagctggaagctgttaaagctaaactgccggaagttaaacagggtcagacc180caccacgtttggcagctggacctgtctgacgttgaagctgctggttctttcaaaggtgct240ccgctgccggcttcttcttacgacgttttcgtttctaacgctggtatctctcagttctct300ccgatcgctgaacacgctgacgctgactggcagaacatgctgaccgttaacctgaccgct360ccgatcgctctgaccaaagctgttgttaaagctatctctgacaaaccgcgtcagaccccg420gctcacatcatcttcatctctaccggtctgtctaaacgtggtgctccgatggttggtgtt480tactctgcttctaaagctggtatcgacggtttcatgcgttctctggctcgtgaactgggt540ccggttggtatcaacgttaactgcgtttctccgggtgttacccgtacctctatggctgaa600ggtatcgacccgtctatgttcgacctgccgatcaacggttggatcgaagttgacgctatc660gctgacgctgttacctacctggttaaatctaaaaacgttaccggtaccaccgtttctgtt720gacaacggttactgcgcttaa741<210>4<211>246<212>prt<213>人工序列()<400>4metthrserserserserproserleuasnalaleuvalthrglygly151015serargglyileglyglualailesermetglnleualaalaglugly202530tyrservalthrilealaserargglyleugluglnleuglualaval354045lysalalysleuprogluvallysglnglyglnthrhishisvaltrp505560glnleuaspleuseraspvalglualaalaglyserphelysglyala65707580proleuproalasersertyraspvalphevalserasnalaglyile859095serglnpheserproilealagluhisalaaspalaasptrpglnasn100105110metleuthrvalasnleuthralaproilealaleuthrlysalaval115120125vallysalaileserasplysproargglnthrproalahisileile130135140pheileserthrglyleuserlysargglyalaprometvalglyval145150155160tyrseralaserlysalaglyileaspglyphemetargserleuala165170175arggluleuglyprovalglyileasnvalasncysvalserprogly180185190valthrargthrsermetalagluglyileaspprosermetpheasp195200205leuproileasnglytrpilegluvalaspalailealaaspalaval210215220thrtyrleuvallysserlysasnvalthrglythrthrvalserval225230235240aspasnglytyrcysala245<210>5<211>741<212>dna<213>人工序列()<400>5atgacctcttcttcttctccgtctctgaacgctctggttaccggtggttctcgtggtatc60ggtgaagctatctctatgcagctggctgctgaaggttactctgttaccatcgcttctcgt120ggtctggaacagctggaagctgttaaagctaaactgccgatcgttaaacagggtcagacc180caccacgtttggcagctggacctgtctgacgttgaagctgctggttctttcaaaggtgct240ccgctgccggcttcttcttacgacgttttcgtttctaacgctggtatctctcagttctct300ccgatcgctgaacacgctgacgctgactggcagaacatgctgaccgttaacctgaccgct360ccgatcgctctgaccaaagctgttgttaaagctatctctgacaaaccgcgtcagaccccg420gctcacatcatcttcatctctaccggtctgtctaaacgtggtgctccgatggttggtgtt480tactctgcttctaaagctggtatcgacggtttcatgcgttctctggctcgtgaactgggt540ccggttggtatcaacgttaactgcgtttctccgggtgttacccgtacctctatggctgaa600ggtatcgacccgtctatgttcgacctgccgatcaacggttggatcgaagttgacgctatc660gctgacgctgttacctacctggttaaatctaaaaacgttaccggtaccaccgtttctgtt720gacaacggttactgcgcttaa741<210>6<211>246<212>prt<213>人工序列()<400>6metthrserserserserproserleuasnalaleuvalthrglygly151015serargglyileglyglualailesermetglnleualaalaglugly202530tyrservalthrilealaserargglyleugluglnleuglualaval354045lysalalysleuproilevallysglnglyglnthrhishisvaltrp505560glnleuaspleuseraspvalglualaalaglyserphelysglyala65707580proleuproalasersertyraspvalphevalserasnalaglyile859095serglnpheserproilealagluhisalaaspalaasptrpglnasn100105110metleuthrvalasnleuthralaproilealaleuthrlysalaval115120125vallysalaileserasplysproargglnthrproalahisileile130135140pheileserthrglyleuserlysargglyalaprometvalglyval145150155160ty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