一种利用污泥基质发酵制备γ-聚谷氨酸的调控方法与流程

本发明涉及有机固体废弃物处理与资源化技术领域，尤其是一种利用污泥基质发酵制备γ-聚谷氨酸的调控方法。

背景技术：

在一个普通二次污水处理厂中，污泥处理所产生的费用约为总投资的30-40%，预测我国2020年污泥总产量高达7000万吨(以80%含水计)。面对如此高的污泥产量，污泥消化后填埋或焚烧便成为了国内目前的常用处置方法。填埋法较为经济所以之前一直为主要手段，但是其占地大、会有地下水二次污染风险等潜在危险性。因此污泥资源化利用或高效处理方法已经成为我国乃至全世界都十分关注的研究热点。

γ-聚谷氨酸(γ-pga)是可由微生物利用谷氨酸发酵产生的一种胞外聚合物，是一种水溶性、可生物降解的新型高分子材料，在环保、化工等领域具有广阔应用前景。目前发酵技术采用的均是纳豆、磷酸氢二钾等物质合成的发酵培养基，从而导致发酵培养基成本过高。另外，传统提纯方法也一直存在很多问题，如传统提纯过程中产生的无机盐去除难度大，超滤渗透提纯价格高昂等。这些导致γ-聚谷氨酸的价格缺乏市场竞争力。

污泥作为一种高蛋白含量的有机废弃物（蛋白质约占有机物含量的60-80%），其中含有的氨基酸以丙氨酸（ala）和谷氨酸（glu）为主，可达到氨基酸总量的20-30%；这就为污泥作为廉价基料发酵生产聚谷氨酸提供了可能。但是污泥成分复杂，如何保证微生物能够利用污泥中的蛋白-谷氨酸进行次生代谢生成γ-pga，并能够改变传统提纯方法调节酸碱度而带来的大量无机盐、保证工艺的可行性及经济效益就成了问题的关键所在。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状，而提供了制备成本低，操作简便，产品质量稳定一种利用污泥基质发酵制备γ-聚谷氨酸的调控方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种利用污泥基质发酵制备γ-聚谷氨酸的调控方法，包括以下步骤：

1）污泥蛋白-谷氨酸提取：

a.预处理：将含固率为10%-15%的污泥放入到高压反应釜中进行预处理，获得污泥泥浆；

b.重力压滤处理：通过压滤机对步骤a获得的污泥泥浆进行重力压滤，获得含水率为40%-60%的干化污泥和上清液，上清液留用，干化污泥进行无害化处理后资源化回收利用；

2）次生代谢合成γ-聚谷氨酸：

c.激活驯化菌种：利用杆菌数标准的芽孢杆菌种子培养基活化培养发酵菌种，再用加了发酵原料的发酵培养基驯化培养发酵菌种，使菌种扩增繁殖到最大值，得到激活驯化后的芽孢杆菌；

d.次生代谢发酵：用步骤c所得激活驯化后的芽孢杆菌接种到步骤b的上清液中，适当通风保证充分供氧，调节发酵条件，获得含有γ-聚谷氨酸的发酵产物；

3）γ-聚谷氨酸纯品的制备：

e.酸化、离心、过滤：将步骤d所得的发酵产物，酸化调节ph使菌体、多糖沉淀，离心后过滤收集上清液；

f.极性互斥析出沉淀：将步骤e所得的上清液，调回ph并利用极性互斥的有机溶剂使γ-聚谷氨酸析出，离心收取沉淀；

g.纯化除杂：将步骤f所得沉淀，用去离子水溶解，获得γ-聚谷氨酸溶液，在4℃下透析6h-24h，用截留分子量为8-12kda的透析袋除去小分子有机物质及无机盐杂质，得到透析液；

h．干燥：将步骤h所得的透析液进行真空冷冻干燥24-72h，获得γ-聚谷氨酸纯品。

为优化上述技术方案，采取的措施还包括：

上述的步骤a中预处理条件为：温度为110℃-220℃，压强为0.1mpa-0.3mpa，时间为15min-5h。

上述的步骤c中菌体扩增繁殖的c/n设定为100:0.5-5，温度控制在25℃-32℃，ph为6.8-7.2，培养时间为24h-72h。

上述的步骤c中所用的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及它们可产γ-聚谷氨酸驯化菌中的其中一种。

上述的步骤d中发生次生代谢的条件设定c/n为100:5-40，温度为32℃-40℃，ph为5.5-8.5，转速设定为80r/min-220r/min，发酵时间为48h-96h。

上述的步骤e中采用酸液调节ph到1.5-3.5，离心转速为3000rpm-18000rpm，时间为5min-40min，分离收集上清液。

上述的酸液为磷酸、草酸或者硫酸。

上述的步骤f先用碱性溶液调节ph为3.5-6.5，再使用2-6倍浓缩液体积的极性互斥的有机溶剂使γ-聚谷氨酸沉淀析出；采用8000rpm-15000rpm转速离心5min-40min，分离收集沉淀。

上述的碱性溶液为碳酸氢铵、氢氧化钠或者氧化钙，所述的极性互斥的有机溶剂为乙醇、丙酮、乙二醇中的一种或几种的混合。

上述的极性互斥的有机溶剂采用乙醇、丙酮、乙二醇中的两种进行混合时，混合比例为1：0.1-20；采用乙醇、丙酮、乙二醇进行混合时，混合比例为1：1-15：6-30。

与现有技术相比，本发明的一种利用污泥基质发酵制备γ-聚谷氨酸的调控方法，具有以下优点：

(1)本发明用约42-50kg污泥（以85%含水计）可生产1kg高度纯品（>95%）γ-聚谷氨酸。同时，污泥作为有机废弃物，产量巨大，其处理处置一直是国内外的难题；这为本发明提供了巨量、免费的发酵基料，可以解决现行技术中发酵基料价格高昂的问题。

(2)本发明改变了传统的酸碱调节药剂，改善了现行技术因提纯过程中无机盐杂质带入过多的问题，减少了透析次数，使操作简便也减少了总体费用。

(3)本发明采用极性互斥的有机溶剂使γ-聚谷氨酸析出，可通过减压蒸馏回收再利用，每次提纯1-3kg上清液只需损耗1-2l极性互斥的有机溶剂。

(4)本发明每千克纯品γ-聚谷氨酸制备的成本费用约60-100元，极大地减少了γ-聚谷氨酸的生产费用，且成品可达到农业级γ-聚谷氨酸的标准；市场上的聚谷氨酸价格一般都在150元/kg以上。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

如图1所示，一种利用污泥基质发酵制备γ-聚谷氨酸的调控方法，包括以下步骤：

1）污泥蛋白-谷氨酸提取：

a.预处理：将含固率为10%-15%的污泥放入到高压反应釜中进行预处理，获得污泥泥浆；预处理条件为：温度为110℃-220℃，压强为0.1mpa-0.3mpa，时间为15min-5h。

b.重力压滤处理：通过压滤机对步骤a获得的污泥泥浆进行重力压滤，获得含水率为40%-60%的干化污泥和上清液，上清液留用，干化污泥进行无害化处理（好氧发酵等）后资源化回收利用；干化污泥进行资源化回收后可以作为土壤改良剂使用。

2）次生代谢合成γ-聚谷氨酸：

c.激活驯化菌种：利用杆菌数标准的芽孢杆菌种子培养基活化培养发酵菌种，再用加了发酵原料的发酵培养基驯化培养发酵菌种，使菌种扩增繁殖到最大值，得到激活驯化后的芽孢杆菌；菌体扩增繁殖的c/n设定为100:0.5-5，温度控制在25℃-32℃，ph为6.8-7.2，培养时间为24h-72h；所用的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及它们可产γ-聚谷氨酸驯化菌中的其中一种。

d.次生代谢发酵：用步骤c所得激活驯化后的芽孢杆菌接种到步骤b的上清液中，适当通风保证充分供氧，调节发酵条件，获得含有γ-聚谷氨酸的发酵产物；发生次生代谢的条件设定c/n为100:5-40，温度为32℃-40℃，ph为5.5-8.5，转速设定为80r/min-220r/min，发酵时间为48h-96h。

3）γ-聚谷氨酸纯品的制备：

e.酸化、离心、过滤：将步骤d所得的发酵产物，酸化调节ph使菌体、多糖沉淀，离心后过滤收集上清液；酸化调节采用酸液调节ph到1.5-3.5，离心转速为3000rpm-18000rpm，时间为5min-40min，分离收集上清液；酸液为磷酸、草酸或者硫酸。

f.极性互斥析出沉淀：将步骤e所得的上清液，调回ph并利用极性互斥的有机溶剂使γ-聚谷氨酸析出，离心收取沉淀；调回ph采用碱性溶液调节ph为3.5-6.5，再使用2-6倍浓缩液体积的极性互斥的有机溶剂使γ-聚谷氨酸沉淀析出；采用8000rpm-15000rpm转速离心5min-40min，分离收集沉淀；所述的碱性溶液为碳酸氢铵、氢氧化钠或者氧化钙，所述的极性互斥的有机溶剂为乙醇、丙酮、乙二醇中的一种或几种的混合，所述的极性互斥的有机溶剂采用乙醇、丙酮、乙二醇中的两种进行混合时，混合比例为1：0.1-20；采用乙醇、丙酮、乙二醇进行混合时，混合比例为1：1-15：6-30。

g.纯化除杂：将步骤f所得沉淀，用去离子水溶解，获得γ-聚谷氨酸溶液，在4℃下透析6h-24h，用截留分子量为8-12kda的透析袋除去小分子有机物质及无机盐杂质，得到透析液；

h．干燥：将步骤h所得的透析液进行真空冷冻干燥24-72h，获得γ-聚谷氨酸纯品。

下面通过具体的实施例进一步阐述本发明γ-聚谷氨酸的制备方法：

实施例：以枯草芽孢杆菌进行发酵，具体步骤如下：

1)污泥蛋白-谷氨酸提取：

a.预处理：将污泥（含固率为15%）放入的高压反应釜中进行预处理，温度为170℃，压强为0.2mpa，时间为4h，获得污泥泥浆；

b.重力压滤处理：通过压滤机对步骤a获得的污泥泥浆进行重力压滤，获得干化污泥（含水率为55%）和上清液，上清液留用，干化污泥进行好氧发酵等无害化处理后资源化回收利用；

2)次生代谢合成γ-聚谷氨酸：

c.激活驯化菌种：利用杆菌数标准的枯草芽孢杆菌的种子培养基活化培养发酵菌种，再用加了发酵原料的发酵培养基驯化培养枯草芽孢杆菌；菌体扩增繁殖的c/n设定为100:0.5，温度控制在30℃，ph为7.2，培养时间为42h；得到激活驯化后的枯草芽孢杆菌。

d.次生代谢发酵：用步骤c所得激活驯化后的枯草芽孢杆菌接种到步骤b的上清液中，适当通风保证充分供氧，调节发酵条件，设定c/n为100:5，温度为37℃，ph为7.5，转速设定为220r/min，发酵时间为48h，获得含有γ-聚谷氨酸（γ-pga）的发酵产物；

3)γ-聚谷氨酸纯品的制备：

e.酸化、离心、过滤：将步骤d所得的发酵产物，采用硫酸调节ph为1.5使菌体、多糖等沉淀，离心转速为18000rpm，时间为20min，分离收集上清液；

f.极性互斥析出沉淀：将步骤e所得的上清液，碳酸氢铵调节ph为6.0，再使用6倍浓缩液体积的乙醇使γ-pga沉淀析出；采用15000rpm转速离心40min，分离收集沉淀；

g.纯化除杂：将步骤f所得沉淀，用去离子水溶解，获得γ-pga溶液；在4℃下透析24h，用透析袋（截留分子量为10kda）除去小分子有机物质及无机盐等杂质；

h.干燥：将步骤h所得的透析液进行真空冷冻干燥24h，获得γ-pga纯品。

本发明的最佳实施例已阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。