合成乳酰N-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及一种合成乳酰n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术：

母乳一直被视为婴幼儿最好的食物来源，除了为婴幼儿提供正常生长所需营养外，还具有众多牛乳不具有的健康促进效应。寡糖是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分，母乳中的寡糖总含量为5～15g/l。

乳酰n-新四糖(lacto-n-neotetraose)是母乳中含量较高的母乳寡糖之一，对于调节肠道菌群、增强免疫力、促进细胞合成有着重要作用。作为一种重要的营养物质，乳酰n-新四糖已被美国fda和eu批准作为添加剂添加到婴幼儿奶粉中。

目前，乳酰n-新四糖可以通过化学合成法和酶合成法生产，但化学合成法存在反应步骤复杂、原材料价格昂贵等问题，造成生产成本较高不利于工业的大规模合成，且化学合成中使用的部分有毒试剂，使产品不宜用于食品添加剂，酶合成法存在底物价格昂贵等缺点。而生物法可以利用廉价碳氮源和底物，实现乳酰n-新四糖的合成，且对环境不造成影响。因此，通过生物法制备乳酰n-新四糖受到了越来越多的关注。

此前，已有研究通过对微生物进行改造以合成乳酰n-新四糖，包括在大肠杆菌属和枯草芽孢杆菌属中构建代谢途径，但之前的研究多采用质粒引入关键基因，质粒表达不够稳定，存在容易在发酵过程中丢失，或发酵产量不稳定等问题。部分研究尝试在基因组上表达关键基因，但没有对代谢途径进行进一步地调控，造成碳源多流向其他分支途径，代谢过程中底物利用率低，产物产量难以提高等问题。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明构建了利用β-1,3-n-葡糖氨基酶lgta基因和β-1,4半乳糖转移酶lgtb基因在大肠杆菌中合成乳酰-n-新四糖的新途径，利用大肠杆菌自身代谢途径中的udp-半乳糖，udp-乙酰氨基葡萄糖作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖运输酶的作用下转入细胞，合成乳酰-n-新四糖。

本发明的第一个目的是提供一种合成乳酰n-新四糖的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主基因组上敲除β-半乳糖苷酶lacz基因、葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagb基因、udp-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecb基因、udp-葡萄糖脱氢酶ugd基因，并在基因组上过表达乳糖运输酶lacy基因、β-1,3-n-葡糖氨基酶lgta基因和β-1,4半乳糖转移酶lgtb基因。

进一步地，所述的β-1,3-n-葡糖氨基酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，所述的β-1,4半乳糖转移酶得氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述的β-半乳糖苷酶lacz基因的id为945006，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagb基因的id为945290，udp-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecb基因的id为944789，udp-葡萄糖脱氢酶ugd基因的id为946571，乳糖运输酶lacy基因的id为949083。

进一步地，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌mg1655。

进一步地，所述的重组大肠杆菌的β-1,3-n-葡糖氨基酶和β-1,4半乳糖转移酶的启动子是tac启动子。

本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

s1、构建包含β-1,3-n-葡糖氨基酶和β-1,4半乳糖转移酶的重组片段lgtab-tac；

s2、采用crispr/cas9系统进行基因编辑，依次敲除大肠杆菌mg1655中lacz、nagb、wecb、ugd基因，得到敲除lacz、nagb、wecb、ugd基因的重组菌；

s3、采用crispr/cas9系统进行基因编辑，在s2步骤得到的重组菌中过表达lacy基因，得到过表达lacy基因的重组菌；

s4、将重组片段lgtab-tac转入s3步骤得到的重组菌中，得到所述的重组大肠杆菌。

本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌在发酵生产乳酰-n-新四糖的应用。

进一步地，所述的应用具体包括如下步骤：将重组大肠杆菌的种子液以od值0.1-0.2的接种量接入发酵培养基中培养至od达到1.8～2.2时，在28～32℃下，以0.15～0.25mm的iptg进行诱导45～50h。

进一步地，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨10～14g/l，酵母提取物22～26g/l，甘油3～5g/l，磷酸氢二钾2.2～2.5g/l，三水磷酸氢二钾16.2～16.5g/l，乳糖4～6g/l。

本发明的有益效果：

本发明构建了利用β-1,3-n-葡糖氨基酶lgta基因和β-1,4半乳糖转移酶lgtb基因在大肠杆菌中合成乳酰-n-新四糖的新途径，利用大肠杆菌自身代谢途径中的udp-半乳糖，udp-乙酰氨基葡萄糖作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖运输酶的作用下转入细胞，合成乳酰-n-新四糖。本发明的重组大肠杆菌合成乳酰-n-新四糖的产量达到985mg/l，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产乳酰-n-新四糖奠定了基础。

附图说明

图1为本发明重组大肠杆菌合成乳酰-n-新四糖的代谢途径。

图2为本发明重组大肠杆菌合成的乳酰-n-新四糖的液质联用色谱图。

图3为本发明中m0ab、m04ab、m05ab的乳酰-n-新四糖产量比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

乳酰-n-新四糖利用液质联用色谱仪进行定性和定量检测。质谱离子方式：esi+，质量范围：20-2000m/z，检测器电压：1800volts，液相检测器：watersacquitypda，检测波长：200---400nm，分析柱：behc182.1x150mm1.7um，流动相：100％乙腈，柱温：45℃，流速：0.3ml/min，进样体积5μl。

实施例1：基因敲除同源臂片段的构建

根据e.colimg1655序列信息，设计如表1中所示引物,lacy基因的整合位点为flik，使用上述引物以e.colimg1655基因组为模板，pcr扩增出lacz、nagb、wecb、ugd、flik各基因的上下游同源臂片段，通过overlappingpcr分别融合各基因上下游同源臂，得到片段lacz12、nagb12、wecb12、ugd12、lacy12。

表1

实施例2：ptarget质粒的构建

分别在各待敲除基因上选取n20区(crispr/cas9系统中用于靶向待敲除基因的20bp的碱基序列)，设计引物，以ptarget为模板，通过pcr取代模板的n20区。将pcr产物转入e.colijm109中，提取质粒，得到4个质粒，ptarget-lacz、ptarget-nagb、ptarget-wecb、ptarget-ugd、ptarget-lacy。

实施例3：基因敲除与整合

出发菌株e.colimg1655记为m0，将pcas9质粒转化m0，得到表达cas9蛋白的宿主m0(pcas9)，随后将ptarget-lacz质粒和片段lacz12电转入m0(pcas9)，得到敲除lacz基因的m01(pcas9)，消除ptarget-lacz质粒，将ptarget-nagb质粒和片段nagb12电转入m01(cas9)，敲除nagb基因，按此方法依次敲除各待敲除基因，最后消除ptarget和pcas9质粒，得到lacz、nagb、wecb、ugd基因敲除的m04。

在敲除lacz、nagb、wecb、ugd基因的m04菌株的基础上，将pcas9质粒转化m04，得到表达cas9蛋白的宿主m04(pcas9)，再将ptarget-lacy质粒和带有lacy基因、tac启动子、上下同源臂的融合片段lacy12通过电转转入，使lacy基因整合至flik位点，最后消除ptarget和pcas9质粒，得到过表达lacy基因的m05。

实施例4：构建高效合成乳酰-n-新四糖的重组大肠杆菌

根据ncbi上公布的脑膜炎双球菌nesseriameningitides的β-1,3-n-葡糖氨基酶lgta基因和β-1,4半乳糖转移酶lgtb基因的氨基酸序列，如seqidno.1和seqidno.2所示。

将基因lgta、lgtb和tac启动子通过融合pcr进行连接，构建出重组片段lgtab-tac，将片段分别整合到菌株m0、m04和m05上，获得重组菌株m0ab、m04ab和m05ab。

实施例5：发酵合成乳酰-n-新四糖

将重组菌株m0ab、m04ab和m05ab的种子液以od值0.1-0.2的接种量接入发酵培养基中37℃，200rpm培养，发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油4g/l，磷酸氢二钾2.31g/l，三水磷酸氢二钾16.42g/l，乳糖5g/l。当od值达到2时，在30℃下，以0.2mm的iptg进行诱导48h。

发酵结束后，使用液质联用色谱仪对发酵液中的乳酰-n-新四糖进行定性和定量分析，乳酰-n-新四糖的液质联用色谱图如图2所示。乳酰-n-新四糖产量结果如图3所示，m0ab的乳酰-n-新四糖产量仅为23mg/l，经改造后的工程菌株，乳酰-n-新四糖产量得到提升，m04ab的产量为569mg/l，m05ab的产量达到985mg/l，比m04产量提高了73％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>江南大学

<120>合成乳酰n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

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