一种含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶及其制备方法与流程

本发明属于医疗技术领域，尤其涉及一种含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶及其制备方法。

背景技术：

脓毒症是导致全球范围内成人和儿童死亡的主要原因之一，其发病率和病死率在新生儿和儿童中最高，并且在过去几十年没有显著下降。儿童脓毒症的发病率从每年每千名儿童的0.56到2.1不等。关于脓毒症处理的指南，几乎都强调了在使用抗生素之前采集血液进行血液培养的重要性。但是，超过40％的住院患者采血培养前应用了抗生素，约20％患者在入院时已经使用口服抗生素。血液培养对感染性疾病的诊断、治疗和预后有重要的临床意义。但是，我国儿科诊疗水平差异较大，且存在不同程度的抗生素不合理应用，获得血培养标本之前的抗生素应用，会降低标本中细菌的载量，抑制细菌的生长，最终影响血培养阳性检出率和ttp(timetopositivity，ttp，阳性报菌时间)。

为了有效提高血培养的检出阳性率，缩短阳性报菌时间，目前常采用含有树脂或活性炭颗粒的培养瓶来清除血标本中的抗菌素残留，但是也存在相应的局限性。如活性炭颗粒的存在可能是应用革兰氏染色、直接质谱分析、分子方法和直接抗生素敏感测试的主要限制因素；专利的营养素与树脂的添加比例，配套的自动化系统，对于以手动血培养瓶为主的中低收入国家，仍然无法采用；有研究显示，美罗培南及少数头孢菌素的峰值血药浓度可能会超过树脂培养瓶的中和能力。由于特殊的生理特点和多数抗生素的毒副作用，儿童的抗菌治疗以β-内酰胺类抗菌药物(头孢菌素类和青霉素类)为首选。因此，需要制备一种添加可以分解头孢菌素类和青霉素类抗生素的的细菌培养瓶，以实现提高血培养阳性检出率，缩短阳性报菌时间的目的，为广大儿童脓毒症患者的诊治提供帮助。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶及其制备方法，以提高血培养阳性检出率，缩短阳性报菌时间。

本发明提供了一种含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶，所述细菌培养瓶添加有可分解头孢菌素类和青霉素类抗生素的β-内酰胺酶制剂，用于处理血标本中残留的β-内酰胺类抗菌素。

本发明还提供了上述细菌培养瓶的制备方法，包括：

根据患儿服用β-内酰胺类抗菌素的种类和剂量，按照对应药品说明书中的抗菌素峰血药浓度，根据β-内酰胺酶制剂说明书的配比要求，配制相应剂量的β-内酰胺酶，将β-内酰胺酶与临床血培养标本同时注入临床采用的细菌培养瓶或手工制备的细菌培养瓶，得到含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶。

进一步地，该制备方法还包括：

将含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶在全自动或人工细菌培养箱中进行培养。

借由上述方案，通过含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶及其制备方法，提高了血培养阳性检出率，缩短了阳性报菌时间。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本实施例提供了本发明提供了一种含有β-内酰胺酶的细菌培养瓶，该细菌培养瓶添加有可分解头孢菌素类和青霉素类抗生素的β-内酰胺酶制剂，用于处理血标本中残留的β-内酰胺类抗菌素。

本实施还提供了上述细菌培养瓶的制备方法，包括：

根据患儿服用β-内酰胺类抗菌素的种类和剂量，按照对应药品说明书中的抗菌素峰血药浓度，根据β-内酰胺酶制剂说明书的配比要求，配制相应剂量的β-内酰胺酶，与临床血培养标本同时注入临床普遍采用的普通细菌培养瓶或手工制备的细菌培养瓶，在全自动或人工细菌培养箱中进行培养。

本发明通过制备了一种添加可以分解头孢菌素类和青霉素类抗生素的β-内酰胺酶制剂的细菌培养瓶，能够处理血标本中的残留的β-内酰胺类抗菌素，达到缩短阳性报菌时间和提高阳性检出率的效果，体外模拟实验已经验证，在细菌阳性检出率和阳性报菌时间方面，添加了β-内酰胺酶的培养瓶几乎达到了与添加了树脂或木炭颗粒的培养瓶相接近的细菌培养效能。

下面通过具体实例对本发明作进一步说明：

1材料与方法

1.1标本来源

选用有代表性的临床常见的病原菌种，并得到标准菌株：革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌atcc29213(天津市临床检验中心)，革兰氏阴性菌：大肠埃希菌atcc25922(天津市临床检验中心)。健康人群的无菌新鲜血液，且两周内未应用抗菌药物。

1.2仪器与试剂全自动细菌培养仪：美国bd微生物监测系统(bactec^tm9240全自动血液培养系统)；法国梅里埃微生物监测系统(bact/alert3d全自动细菌及分支杆菌培养监测系统)。血培养瓶：含树脂儿童培养瓶(bdbactec^tmpedsplus^tm/fculturevials，以下简称bd-f瓶)，美国bd公司产品；标准需氧微生物培养瓶(bdbactec^tmfx，以下简称bd-s瓶)，美国bd公司产品；标准需氧微生物培养瓶(以下简称bt-s瓶)，法国生物梅里埃公司产品；需氧和兼性厌氧微生物培养瓶(含活性炭中和抗生素)、(以下简称bt-c瓶)，法国生物梅里埃公司产品，分析中使用的每一种培养瓶都来自同一批次，均为有效期内产品。选择临床常用抗菌素：注射用青霉素钠(80万u/支，哈药集团制药总厂)，批号：18020608-1；注射用头孢呋辛钠(75万u/6ml/支，丽珠集团丽珠制药厂)，批号：j180201。β-内酰胺酶：青霉素酶(600万u/2ml/支，中国食品药品检定研究院)，批号130441-201907；头孢菌素酶(200万u/支，上海源叶生物科技有限公司)，批号：j02m9f54980。

1.3方法

按照所选金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌，试验各分为6组，即bd-s瓶、bd-f瓶、bt-s瓶、bt-c瓶、bd普通瓶+青霉素酶或头孢菌素酶组(以下简称bd-se瓶)、梅里埃普通瓶组+青霉素酶或头孢菌素酶组(以下简称bt-se瓶)，其中最后两组，为对照标本添加的青霉素钠或头孢呋辛钠，在两种普通培养瓶中分别加入10μl上述浓度的青霉素酶或头孢菌素酶，以达到试剂说明要求。每组重复10份。

将传代后的实验菌株(金黄色葡萄球菌及大肠杆菌)配制成1.5×10⁴cfu/ml浓度备用，并用同1菌种的同1稀释菌液完成全部实验。试验前，将菌株在37℃的血琼脂培养基上隔夜传代两次，用肉汤稀释法测定其最小抑菌浓度(mic)。按照药剂说明书，分别制备抗菌素制剂，青霉素钠1000mg/l,头孢呋辛钠2500mg/l备用；β-内酰胺酶制剂，青霉素酶7500mg/l,头孢菌素酶5000mg/l备用。

在培养瓶中加入1ml无菌新鲜血液，再加入10μl上述浓度菌悬液，使血中菌浓度达到1.5×10²cfu/ml；在含抗菌素组的培养瓶中分别加入10μl和20μl上述浓度抗菌素，使抗菌素浓度分别达到药品说明书中的中点(c1/2)和峰血药浓度(cmax)。将模拟标本培养瓶制备完成后，立即同时放入各自培养仪内，设定检测时间为120小时。阳性标本记录检测时间，涂片革兰氏染色，所有阳性标本，均为高纯度菌株，没有出现污染和假阳性结果。

1.4统计学分析：

定性资料采用构成比(％)表示，采用卡方检验评价各血液培养系统对微生物的恢复能力；定量资料采用表示，将组内对应标本ttp进行配对t检验，采用析因设计的方差分析评价因素的主效应及交互作用，进一步的多重比较采用lsdt检验。p值<0.05为差异有统计学意义。所有统计分析均采用spss23.0软件完成。

2结果

2.1金黄色葡萄球菌-青霉素钠组与大肠埃希菌-头孢呋辛钠组阳性检出结果：

采用cmh卡方检验，按照培养瓶种类进行分层后，不同抗菌素血药浓度的阳性检出率之间存在统计学差异(金黄色葡萄球菌-青霉素钠组χ²＝24.9745，p<0.0001，大肠埃希菌-头孢呋辛钠组χ²＝23.8759，p<0.0001)，可以认为，随着抗菌素血药浓度的增加，阳性检出率逐渐降低；按照抗菌素血药浓度进行分层后，不同培养瓶的阳性检出率之间存在统计学差异(金黄色葡萄球菌-青霉素钠组χ²＝21.4390，p＝0.0007，大肠埃希菌-头孢呋辛钠组χ²＝29.5535，p<0.0001)。采用组内对应阳性检出率进行配对卡方检验，显示所有培养瓶对于不含抗菌素的标本的检出阳性率一致。bactec^tm9120系统内，仅当峰血药浓度的抗菌素时，bd-f瓶及bd-se瓶检出阳性率均优于bd-s瓶(p<0.05)，对于中点和峰血药浓度的抗菌素，bd-f瓶与bd-se瓶的检出阳性率一致；bact/alert3d系统内，仅当峰血药浓度的头孢呋辛钠时，bt-c瓶及bt-se瓶检出阳性率均优于bt-s瓶(p<0.05)，无论是中点还是峰血药浓度的抗菌素，bt-c瓶的检出阳性率多高于bt-se瓶，但两组间无统计学差异(p>0.05)。结果详见表1。

表1不同细菌在各培养瓶中的阳性检出结果

2.2金黄色葡萄球菌-青霉素钠组与大肠埃希菌-头孢呋辛钠组阳性检出时间结果：

对于阳性报菌时间，析因设计的方差分析结果显示：金黄色葡萄球菌-青霉素钠组中，不同的培养瓶(f＝2307.012，p<0.001)、不同的抗菌素血药浓度(f＝8544.732，p<0.001)，ttp存在统计学差异；大肠埃希菌-头孢呋辛钠组中，不同的培养瓶(f＝2144.820，p<0.001)、不同的抗菌素血药浓度(f＝5190.953，p<0.001)，ttp存在统计学差异。通过将组内对应标本ttp进行配对t检验，显示对不含有抗菌素的标本，不同培养瓶间ttp无统计学差异(p>0.05)。bactec^tm9120系统内，无论是中点还是峰血药浓度的抗菌素，bd-f瓶及bd-se瓶均优于bd-s瓶(p<0.001)，在中点血药浓度的青霉素钠，bd-se瓶优于bd-f瓶(p<0.05)，峰血药浓度的青霉素钠，bd-f瓶优于bd-se瓶(p<0.05)，中点和峰血药浓度的头孢呋辛钠，bd-f瓶及bd-se瓶间无统计学差异(p>0.05)；bact/alert3d系统内，显示无论是中点还是峰血药浓度的抗菌素，bt-c瓶及bt-se瓶均优于bt-s瓶(p<0.001)，中点和峰血药浓度的青霉素钠，bt-c瓶均优于bt-se瓶(p<0.001)，中点和峰血药浓度的头孢呋辛钠，bt-c瓶与bt-se瓶无统计学差异(p>0.05)。结果详见表2。

表2不同细菌在各培养瓶中的阳性检出时间

针对广大儿童抗菌素选择的相对单一性，本发明通过将与β-内酰胺类抗菌素峰血药浓度对应剂量的β-内酰胺酶，同时添加进入含有残存β-内酰胺类抗菌素的培养瓶，利用β-内酰胺酶能够快速分解β-内酰胺类抗菌素的特性，清除儿童血培养标本中的残留抗菌素。在已经完成的体外实验中，选择儿科常见病原菌和常用抗生素配对分组后，将菌液、抗生素(血药中点浓度和峰浓度)、新鲜无菌血，依次注入不同品牌的普通培养瓶、含β-内酰胺酶普通培养瓶、含活性炭培养瓶、含树脂培养瓶，立即放入全自动细菌培养仪进行培养，然后记录120小时内不同培养瓶的检出阳性率和阳性报菌时间。

实验结果显示，金黄色葡萄球菌-青霉素钠组和大肠埃希菌-头孢呋辛钠组中，当中点和峰血药浓度的两种抗菌素时，含树脂培养瓶、含活性炭培养瓶及含β-内酰胺酶普通培养瓶检出阳性率均优于普通培养瓶(p<0.05)，含β-内酰胺酶普通培养瓶与含树脂培养瓶、含活性炭培养瓶检出阳性率间无统计学差异(p>0.05)；含树脂培养瓶、含活性炭培养瓶及含β-内酰胺酶普通培养瓶阳性报菌时间均优于普通培养瓶(p<0.05)。当中点血药浓度的青霉素钠时，含β-内酰胺酶普通培养瓶阳性报菌时间优于含树脂培养瓶(p<0.05)，含活性炭培养瓶阳性报菌时间优于含β-内酰胺酶普通培养瓶(p<0.001)；峰血药浓度的青霉素钠时，含树脂培养瓶阳性报菌时间优于含β-内酰胺酶普通培养瓶(p<0.05)，含活性炭培养瓶阳性报菌时间优于含β-内酰胺酶普通培养瓶(p<0.001)；当中点和峰血药浓度的头孢呋辛钠时，含活性炭培养瓶及含树脂培养瓶的阳性报菌时间与含β-内酰胺酶普通培养瓶间无统计学差异(p>0.05)。

因此，得出结论：对于含有青霉素钠或头孢呋辛钠两种β-内酰胺类抗生素的模拟菌血症标本，添加了树脂、活性炭颗粒及β-内酰胺酶的三种培养瓶，相比普通培养瓶，均达到了缩短阳性报菌时间和提高阳性检出率的效果，含β-内酰胺酶培养瓶的检验效能与含树脂或活性炭颗粒的培养瓶相接近。

本发明具有如下技术效果：

1)儿童特殊的生理发育特点，使得抗菌素选择主要为β-内酰胺类抗菌素(主要包括青霉素类和头孢菌素类)，根据药品说明书可以获得明确的血药浓度数值，并可以获得相应的能够分解此类抗菌素的β-内酰胺酶的剂量(如需要固定剂量，可以参考常用β-内酰胺类抗菌素的血药浓度范围，确定适宜β-内酰胺酶的剂量)，通过向血培养标本中添加β-内酰胺酶，可以在数分钟内就分解残留的β-内酰胺类抗菌素，清除了细菌生长繁殖的不利因素，因此可以达到提高血培养阳性检出率，缩短阳性报菌时间的效果；

2)目前，国内外医疗机构主要采用添加树脂或活性炭的方法，来达到吸附或中和标本残留抗菌素的目的，而添加β-内酰胺酶到培养瓶中的方法在国内外均罕有开展，主要原因是成人的血培养标本中残留的抗菌素种类比较多，对于非β-内酰胺类抗菌素，此种方法可能无效，同时，儿童虽然适用上述方法，但是由于儿科的整体诊疗水平与成人有较大的差距，受重视程度也明显不足，社会、经济因素共同造成了这种现状。但是，相比添加树脂或活性炭来吸附或中和残留抗菌素的方法，添加β-内酰胺酶清除培养瓶中β-内酰胺类抗菌素的方法具有清除速度快、清除彻底的优点，至少可以达到与添加树脂或活性炭的培养瓶等同的细菌培养效能。通过体外对含抗菌药物模拟儿童菌血症标本检测能力的研究已经证实。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。