一种乳腺癌干细胞特异性透膜肽及其在制备干扰hTERT基因的组合物中的用途的制作方法

本发明涉及生物领域，具体的涉及一种乳腺癌干细胞特异性透膜肽及其在制备干扰组合物中的用途。
背景技术：
：近年来，各种跨学科研究报道了各类透膜肽作为递送工具递送核酸、蛋白、脂质体和纳米颗粒等进入细胞。透膜肽的主要特点是低毒性，递送效率呈剂量依赖性，对要递送的生物分子或纳米颗粒尺寸、类型没有限制。透膜肽的氨基酸数量通常在40个以下，通过各种途径进入细胞(主要是内吞途径)，并且能够与核酸、蛋白和小分子等通过共价或非共价方式结合，介导其进入细胞。透膜肽通常序列中含有大量阳离子赖氨酸和精氨酸(少数为不带电荷或带负电)，在生理条件带有大量正电荷，可以和核酸通过静电相互作用结合形成多肽/核酸纳米复合物，从而介导核酸进入细胞。科学家们已经利用tat多肽递送反义核酸来抑制肿瘤细胞p_糖蛋白的表达。大部分细胞透膜肽自身的透膜机制多为非能量依赖的直接转导，而在转运分子量较大的dna等生物大分子时则大多采用内吞机制。例如，tat是通过非能量依赖的方式直接透膜，而tat/dna复合物转染hepg2和cho1细胞系时是经过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞。一般来说，阳离子透膜肽与细胞膜外带负电荷的糖胺聚糖基质如肝素等结合，小部分直接转导进入细胞，绝大部分插入到细胞膜经各种蛋白(如小窝蛋白、网格蛋白)介导的内吞或大包吞作用进入细胞。透膜肽/核酸复合物的尺寸对细胞透膜机制有较大影响，部分较小尺寸的复合物可以直接转导进入细胞，而随着复合物尺寸的增大，小窝蛋白、网格蛋白介导的内吞作用和大包吞作用呈逐渐增多趋势。rna干扰（rnai）是一个过程，其中激活由21-23个核苷酸（nt）组成的小干扰rna（sirna）调节的细胞内途径会导致特定的靶向mrna降解（在1、2中进行了综述）。为了在人细胞中引起rnai介导的基因沉默，将双链sirna转染到细胞中。进入细胞后，sirna双链体会经历5'磷酸化，解链，并与rna诱导的沉默复合物（risc）结合。活化的risc（risc*）和与目标mrna互补的解链反义链与mrna靶标。然后发生mrna靶标的单位点特异性切割，其位置参照sirna反义链的5'端确定。一旦发生切割，靶标mrna降解，risc循环用于另一种切割反应。由于rnai在沉默特定靶向基因方面的有效性，因此被广泛用于各种实验室应用和未来的临床治疗中。由于rnai在生物学和医学中的广泛潜在应用，因此重要的是了解rnai的机制并开发将sirna成功递送至靶细胞的新方法。最近已经探索了许多递送sirna的方法。一种方法是将编码sirna序列的dna或rna模板传递到可转录以表达sirna的细胞中。这些基于dna和rna的sirna表达方法依赖于质粒或病毒载体进行递送，并且需要转染，稳定的载体整合以及选择以维持第8、9、10、11、12、13、14、15代的表达，其他成功的方法都集中在直接将sirna传递到细胞中，而细胞摄取sirna的保真度是使用这种方法导致rnai的关键。目前，最常用的sirna递送方法是lipofectamine转染。然而，这种方法的使用仅限于特定的细胞类型，并且这种方法可能对细胞和动物有毒。htert基因位于人类5号染色体短臂上(5p15.33)，由16个外显子和15个内含子组成j，包含330bp的htert核心启动子以及37bp的外显子位于翻译起始位点(atg)上游。htert启动子富含gc序列，缺乏tata和caat盒，但包含许多转录因子的结合位点，这表明htert基因表达的调控是在多细胞间不同因子不同层次的调控。有研究表明，将成功转染了带有htert的慢病毒载体的脐带血树突状细胞(dc)与hepg2细胞共培养24h后，发现带有htert基因dc细胞的抗原递呈作用和抑瘤作用比对照组显著提高。可见，这种转入htert基因的dc细胞疫苗将有可能成为一种新的肿瘤免疫治疗手段。此前已有针对htert的sirna，但是设计的sirna在抑制效率以及转染效率上都有改进的空间。技术实现要素：本发明提供了特异性针对htert基因的sirna。其中，所述htert的基因序列是nm_198253。针对htert基因的sirna，其正义链分别如下所示：sihtert-1:5’-agtttggaagaaccccacat-3’(seqidn0:1)sihtert-2:5’-aagagggccgagcgtctca-3’(seqidn0:2)根据本发明的另一种实施方式，所述正义链的3′末端可以连接1至3个核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补形成所述双链结构后，在所述双链结构的至少一个末端形成由所述1至3个核苷酸构成的3′突出端。其中，优选所述3′突出端为由连续的两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dtdt或连续的两个尿嘧啶核苷酸uu构成。根据本发明的另一种实施方式，所述正义链和所述反义链链中分别包含至少一个被修饰的核苷酸基团。其中，所述被修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团或碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团。优选所述被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2′-羟基被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。更重要的，本发明涉及一种特异性针对乳腺癌干细胞的透膜肽。更具体的，本发明提供一种筛选透膜肽的方法，将乳腺癌干细胞加入含0.1％bsa的dmem培养基孵育，加入随机十二肽噬菌体展示文库的原液，放入37℃摇床，温和振摇孵育，继续在细胞培养箱中孵育。37℃孵育1h后终止噬菌体的内化。弃去未结合的噬菌体上清，洗涤细胞。用胰酶混合液消化干细胞，置于培养箱中保温至镜下观察细胞圆缩脱离皿壁。离心，去上清，再加入轻柔重悬细胞，离心，反复洗涤细胞3次。将沉淀的细胞置于液氮和37℃恒温水浴中反复冻融5次，并充分震荡。冻融物中加入2ml含1％tritonx-100的pbs(含有pmsf和cocktail)，室温下作用2h以裂解细胞。4℃下5000r/min离心10min。离心后的上清即为筛选的分离液。取重复上述筛选方法5次，筛选得到的噬菌体回收率逐步提高，内化进入干细胞的噬菌体数目得到提高，目标噬菌体得到明显的富集。将筛选得到的噬菌体克隆扩增液20μl，96℃金属浴加热10min，取上清1μl作为dna模板。根据十二肽插入序列的上下游共有序列设计引物，进行pcr反应。对经电泳鉴定为有插入片段的噬菌体克隆，取其pcr产物进行测序。根据编码链中噬菌体pⅲ基因的阅读框架推导出与pⅲ蛋白融合的外源十二肽的氨基酸序列。根据测序结果，有1条序列出现了3重复，该高峰度出现的十二肽序列即为具有干细胞透性特性的rxct-1多肽，其序列为seqidno：3所示。此外，本发明还提供一种取透膜肽与sirna偶联的方法，具体的为sirna用pbs稀释;将多肽样品配成溶液，按照多肽/sirna电荷比n/p为10的量取多肽溶液，用pbs稀释;然后将多肽溶液逐滴加如到sirna溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育3omin让阳离子多肽与dna充分结合形成纳米复合物;最后用无血清的dmem培养液稀释到500ul用于细胞转染。另一方面，本发明提供一种抑制乳腺癌干细胞内htert基因表达的方法，该方法包括向乳腺癌干细胞内导入如上所述的sirna偶联物，从而使所述sirna能够序列特异性地诱导所述htert基因表达的抑制。另一方面，本发明提供如上所述的sirna偶联物在制备治疗和/或预防乳腺癌的药物中的用途。有益效果本发明筛选得到了特异性的乳腺癌干细胞的透膜肽，能够特异性的针对乳腺癌干细胞来提供相应的基因递送能力，同时本发明还设计了特异性的sirna能够序列特异性地介导htert基因表达的抑制，可以有效地抑制内源性htert基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生长。附图说明图1示出tm-2多肽对细胞活力的影响，上面的线是rxct-1多肽，下面的线tat多肽。图2示出蛋白表达水平的检测结果，从左至右依次代表空白对照，rxct-1多肽+seqidno：1sirna，rxct-1多肽+seqidno：2sirna，tat多肽+seqidno：1sirna，tat多肽+seqidno：2sirna。具体实施方式实施例1乳腺癌干细胞的分离及鉴定取乳腺癌组织，将组织标本剪成约2mm×2mm×2mm大小，用iii型胶原酶在rpmi1640培养基中于37℃下孵育4h，吸出细胞悬液，将细胞悬液用300目筛网过滤，过滤液收集于50ml离心管中，用rpmi/20%fbs冲洗1次后，用pbs冲洗2次。细胞在倒置显微镜下初步计数后调整细胞浓度为5000个/ml，铺到24孔板中用1640培养基进行贴壁培养，另一部分细胞调整细胞浓度至1×104/ml，用加生长因子的dmem/f12（加双抗）进行乳腺球悬浮培养。将贴壁培养的乳腺癌原代肿瘤细胞置于含有胰岛素(40u/200ml)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100u/ml)和10%小牛血清的rpmi1640培养基中，在37℃含5%co2的环境中培养。细胞初始浓度为1×104/cm2，每2~3d换1次培养液。如细胞达到融合，用0.25%胰蛋白酶-edta消化，再用pbs使细胞重悬，按1∶2接种至其它24孔板中。球悬浮培养的原代细胞用添加了生长因子的dmem/f12进行培养，每3d换1次培养液，10~14d可长成球囊。将乳腺球悬浮培养的细胞收集离心，用0.25%胰蛋白酶-edta消化成单细胞悬液。用胰酶消化贴壁生长的原代肿瘤细胞成单细胞悬液，pbs洗2次后进行流式细胞仪检测，以cd44+/cd24-/low为标志对细胞进行筛选分别，收集得到的干细胞即为乳腺癌干细胞，收集比例达到61.03%。实施例2细胞膜穿透噬菌体短肽的筛选将实施例1制备得到的乳腺癌干细胞进行传代培养后，弃去10cm皿中的培养液，用dmem培养基冲洗贴壁的干细胞3次，加入含0.1％bsa的dmem培养基于37℃下孵育1h。加入随机十二肽噬菌体展示文库的原液10μl（滴度为3×1013pfu/ml），放入37℃摇床，70r/min，温和振摇孵育15min，继续在细胞培养箱中孵育1.5h。37℃孵育1h后立即将培养板于冰上放置5min，终止噬菌体的内化。弃去未结合的噬菌体上清，用5ml含0.1％bsa的dmem培养基于室温下洗涤细胞6次。用2mlpbs和1.5ml0．25％胰酶混合液消化干细胞，置于培养箱中保温至镜下观察细胞圆缩脱离皿壁。4℃、1000r/min离心2min，去上清，再加入3mlpbs轻柔重悬细胞，离心，反复洗涤细胞3次。将沉淀的细胞置于液氮和37℃恒温水浴中反复冻融5次，并充分震荡。冻融物中加入2ml含1％tritonx-100的pbs(含有pmsf和cocktail)，室温下作用2h以裂解细胞。4℃下5000r/min离心10min。离心后的上清即为筛选的分离液。取重复上述筛选方法4次，筛选得到的噬菌体回收率逐步提高，内化进入干细胞的噬菌体数目提高了500倍左右，目标噬菌体得到明显的富集。将筛选得到的噬菌体克隆扩增液20μl，96℃金属浴加热10min，取上清1μl作为dna模板。根据十二肽插入序列的上下游共有序列设计引物，进行pcr反应。对经电泳鉴定为有插入片段的噬菌体克隆，取其pcr产物进行测序。根据编码链中噬菌体pⅲ基因的阅读框架推导出与pⅲ蛋白融合的外源十二肽的氨基酸序列。根据测序结果，有1条序列出现了3重复，该高峰度出现的十二肽序列即为具有干细胞透性特性的rxct-1多肽，其序列为seqidno：3所示。实施例3rxct-1多肽对细胞活力的影响(1)取对数生长期培养的实施例1分离的乳腺癌干细胞，以1×104个细胞/孔的接种密度接种于96孔板常规培养，每孔100μl，每种细胞设3个复孔，37℃培养；(2)至对数生长期，培养液换成无血清的rpmi-1640培养液，继续培养1h；(3)分别换成rxct-1多肽浓度梯度为10μm、20μm、30μm、40μm及50μm无血清的rpmi-1640培养液，继续培养24h；(4)孵育时间结束后，按每孔100μl加入pbs洗涤，2min×3次；(5)每孔加入80μl含血清的正常培养液及20μlmtt(母液浓度5mg/ml，即0.5％mtt)溶液，于37℃继续培养4h，终止培养后吸去培养液。以200μl/孔加入二甲基亚砜，振荡10min至结晶物充分溶解后用全波长酶标仪上检测波长为570nm的吸光值a，每组取3个复孔的平均值。测定od490。重复3次，计算细胞存活率。细胞生存率的计算如下：细胞生存率＝(实验孔od值－对照孔od值－空白孔od值)/(对照od值－空白孔od值)×100％。以本领域常用的11个氨基酸短肽tat多肽（c18-cllhhllhhllhhcgrkkrrqrrr-nh2）按照上述相同方法处理作为对照。本实验采用mtt法测定不同浓度rxct-1多肽处理24h后对细胞活力的影响情况。干细胞经不同浓度rxct-1多肽处理后mtt分析数据显示，浓度高于50mm的rxct-1多肽长时间处理细胞后细胞依然保持在95％以上，对细胞的活力影响甚微(图1)。这提示rxct-1多肽在50mm范围内并不影响细胞活力，而对照tat多肽在50mm时细胞的存活率为85%，该多肽不利于研究sirna真正对干细胞基因的实际抑制情况。实施例4透膜肽透膜效率鉴定（1）sirna的设计根据htert的基因序列，申请人设计了1条sirna序列，其正义链是sihtert-2:5’-aagagggccgagcgtctca-3’(seqidn0:2)，sirna序列由上海生工合成。（2）sirna与rxct-1多肽偶联质粒dna用yoyo-1荧光标记物标记，每µgseqidn0:2的sirna加2.5µlyoyo-1（10µm），37°c空气浴中孵育30min，使yoyo-1荧光标签能够完全嵌入到dna碱基对中。取1ugsirna,用pbs稀释到25ul;将多肽样品分别配成1mg/ml溶液，按照多肽/sirna电荷比n/p为12的量取多肽溶液，用pbs稀释到25ul;然后将多肽溶液逐滴加如到sirna溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育3omin让多肽与dna充分结合形成纳米复合物;最后用无血清的dmem培养液稀释到500ul用于细胞转染。以短肽tat多肽同样条件进行偶联作为阳性对照。取实施例1的干细胞，给sirna/肽复合物前24h，在nest15mm玻璃培养皿中接种3×104个细胞，在37°c，5%co2培养箱中培养。24h后吸出培养液，加入1ml无血清并含有yoyo-1荧光标记的多肽/sirna复合物的dmem培养液，在37°c培养箱中孵育5h，4h后吸出培养液，依次用4°c预冷的pbs洗3次，4%的甲醛/pbs溶液固定10min，pbs再洗3次，用2.0µg/ml的dapi/pbs溶液染细胞核15min，最后用pbs洗3次（以上过程中清洗细胞要缓慢贴壁滴加溶液，尽量避免细胞脱落）。在carlzeisslsm510激光共聚焦显微镜下观察、拍照，60倍油镜下观察，激发波长分别为543nm。结果显示，本发明的透膜肽比tat透膜肽具有更高的荧光细胞数目，具有更好的透膜效率，透膜效率达到98.7%细胞数以上。实施例5透膜肽特异性鉴定将人胰腺癌cfpac-1细胞、人原髓细胞白血病细胞,al7p/hl-60r细胞、人永生化表皮细胞hacat细胞、hek293f细胞按照实施例4的操作方式导入所述的sirna和rxct-1多肽偶联物，经过鉴定，几种细胞均显示非常弱的荧光活性和数目，透膜最强的hacat细胞也只有7.5%的透膜效率，说明本发明提供的透膜肽具有较好的特异性。实施例6sirna抑制效果测定（1）sirna的设计根据htert的基因序列，申请人研究设计了2条sirna序列，其正义链分别是：sihtert-1:5’-agtttggaagaaccccacat-3’(seqidn0:1)sihtert-2:5’-aagagggccgagcgtctca-3’(seqidn0:2)，2条sirna序列由上海生工合成。（2）sirna与rxct-1多肽偶联取1ugsirna,用pbs稀释到25ul;将多肽样品分别配成1mg/ml溶液，按照多肽/sirna电荷比n/p为12的量取多肽溶液，用pbs稀释到25ul;然后将多肽溶液逐滴加如到sirna溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育3omin让阳离子多肽与dna充分结合形成纳米复合物;最后用无血清的dmem培养液稀释到500ul用于细胞转染。以短肽tat多肽同样条件进行偶联作为阳性对照。（3）复合物转染实施例1的干细胞，给药前24h，在nest15mm玻璃培养皿中接种3×104个细胞，在37°c，5%co2培养箱中培养。24h后吸出培养液，加入1ml无血清并含有yoyo-1荧光标记的多肽/sirna复合物的dmem培养液，在37°c培养箱中孵育5h，4h后吸出培养液，用pbs洗3次后，用rpmi-1640培养液，继续培养36h后收获细胞进行检测。（4）rt-pcr和pcr产物定量分析法检测mrna按trizol总rna提抽试剂盒提取总rna。取总rna2.5ug，加入50u1逆转录反应体系，用superscripttmii逆转录置试剂盒，按说明书操作进行逆转录。pcr扩增:pcr反应体系按常规(试剂购自invitrogen公司)。htert引物1:5’-ccgtctccctgaggagatc-3'；htert引物2:5’-tccggtagaaaaagagcctgtt-3'；β-actin引物l:5’-gcatcgtgatggactccg-3';β-actin引物2:5’-tcggaaggtggacagcga-3'，以上序列均由上海生工生物工程公司合成。循环条件:95℃变性10秒，60℃退火20秒，共40个循环，72℃延伸1分钟，最后延伸10分钟。另以β-actin的扩增产物为内参对照。细胞经sirna处理36h后检测，结果如图2显示，以空白对照的表达量为1，sihtert-1与sihtert-2都能够下调mrna的表达，但是采用rxct-1多肽偶联的sihtert-1具有更显著的下调效果，能够在转染36小时后即可显著的抑制靶基因的表达。这说明在本发明的透膜肽存在的情形下，能够加速干扰的效果，比不加透膜肽抑制效果更家显著，具有预料不到的技术效果。收集36h的各组细胞，制备细胞裂解液，用htert多抗进行westernblot检测，检测htert蛋白水平的表达。结果显示，采用rxct-1多肽介导的seqidno：1的sirna在36h后即具有比不加rxct-1具有更好的抑制效果，蛋白表达量降低了(96.7±4.8)％，采用rxct-1多肽介导的seqidno：2的sirna在36h后同样比不加rxct-1多肽更快以及更好的抑制效果，但是蛋白表达量降低达到了(86.76±6.3)％，明显的，seqidno：1比seqidno：2具有更好的效果。实施例7sirna对肿瘤干细胞的抑制将实施例6中所述透膜肽-sirna偶联物(终浓度为100nmol)转染的乳腺癌干细胞，在转染后96h检测。检测时每孔中加入5mg／mlmtt20μl，继续培养4h，到达检测点时弃去培养液，再加入二甲基亚砜(dmso)200μl，震荡10min，置自动酶标仪492nm波长测定各孔吸光度(a)值，计算细胞的抑制率。细胞生长抑制率(％)=[(对照组a492nm-实验组a492nm)／对照组a492nm]×100％。以pbs作为空白对照。表1sirna对肿瘤干细胞的抑制效率表组别抑制效率（100%）空白对照(0.7±0.4)％tm-2多肽+seqidno：1(98.5±3.2)％tm-2多肽+seqidno：2(89.4±2.3)％tat多肽+seqidno：1(90.3±1.1)％tat多肽+seqidno：2(80.5±2.6)％结果如表1所示，本发明的tm-2多肽+seqidno：1偶联物能够较好的对乳腺癌干细胞的抑制作用，具有比其他透膜肽或者其他干扰rna都较好的效果。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。序列表<110>北京瀚梅生物科技有限公司<120>一种乳腺癌干细胞特异性透膜肽及其在制备干扰htert基因的组合物中的用途<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>1agtttggaagaaccccacat20<210>2<211>19<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>2aagagggccgagcgtctca19<210>3<211>12<212>prt<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>3argargproleuthrserasphisalapheserarg1510当前第1页12