ACE抑制肽P1、其应用及其制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体地，涉及一种ace抑制肽p1。本发明还涉及了此ace抑制肽的应用及其制备方法。
背景技术：
：人体的血压调节主要是受到血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem，ras)和激肽系统(kallikreinkininsystem，kks)控制，而血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme，ace)在这两个系统中起着关键作用。ace是一种羧基二肽酶，广泛分布于哺乳动物的组织中，主要以膜结合胞外酶的形式存在于血管上皮细胞。在ras系统中，ace能够使没有生理活性的血管紧张素ⅰ(angiotensinⅰ，angⅰ)转化为具有升压活性的血管紧张素ⅱ(angiotensinⅱ，angⅱ)。在kks系统中，ace可将血管舒缓激肽降解为失活片段，导致血管收缩，引起血压升高。目前高血压的药物治疗主要是对ace进行抑制,相关研究表明一些从动物、植物以及乳制品中分离得到的天然生物活性肽具有抑制ace活性、降低血压的作用。相比传统降压药物这些天然活性肽具有特异性高、毒副作用小、疗效好、可用药剂量更大等优点。对酶解制备ace抑制肽的研究，有以牛奶、乳酪、大豆、蔬菜、小麦等食物性蛋白为原料，经蛋白酶酶解产生能较好抑制ace活性的抑制肽制备方法。eijietal(angiotensinconvertingenzymeinhibitoryactivityoftheshortchainpeptidesderivedfromvariousfoodpro-teins[j].nipponshkuhinkagakukogakukaishi,1996,43(7):839-840.)水解了12种食物蛋白后发现，从鱼、虾和蟹等水产动物蛋白中酶解制得的ace抑制肽，其降压活性优于其他食物性蛋白。ace抑制肽在母体蛋白中没有活性，但能通过酶水解方法从母体蛋白中释放出。由于ace抑制肽氨基酸组成和结构差别很大，没有固定或统一氨基酸组成，且食物中蛋白酶解产物成分相当复杂，这样就大大增加对其分离提取难度。ace抑制肽活性检测方法主要有体内检测和体外实验二种。体外检测一般使用ic50表示ace抑制剂抑制活性，抑制物ic50越小，其活性越高。孙美玲等在文章《海参水煮液中ace抑制肽的分离纯化》(《大连工业大学学报》2019年1月)中采用大孔树吸附的方法对海参水煮液酶解物多肽进行分离，并应用p18反相硅胶柱和lh-20葡聚糖凝胶柱对活性最高的组分进行ace抑制肽分离纯化,得到2种多肽单体,ace抑制活性的ic50分别为0.74和1.77mg/ml。公开号为cn108129561a的专利中公开了一种ace抑制肽，将大黄鱼肌动蛋白进行虚拟酶切，得到一定量的肽序列，筛选其中未被报道的三肽序列进行毒性、水溶性和admet性质的预测，并利用discoverystudio软件进行分子对接，最终筛选得到三肽his-glu-arg(her)。利用rp-hplc法进行三肽her体外ace抑制活性的鉴定。结果显示her具有良好ace抑制活性，ic50值为1.82±0.06mm。河鲀为硬骨鱼纲鲀科鱼类的统称，随着河鲀鱼加工利用市场的开放及发展，大量河鲀鱼加工利用后的副产物(如鱼皮、鱼头、鱼内脏等)则作为废弃物丢弃或者加工成动物饲料，不仅将会给将会给环境带来巨大的压力，给社会带来负面效应也是对鱼皮资源极大的浪费。因此，充分利用河鲀鱼其中的营养成分，开发高附加值的各类产品，将会对整个河鲀鱼市场带来新的良性发展。有研究表明鱼皮的蛋白质较于肌肉高，鱼皮中的胶原含量最高可占其蛋白质总量的80％多，且鱼皮的蛋白质除了主要为纤维状的胶原外，还含有少量白蛋白、粘性蛋白、球蛋白、粘蛋白。目前尚未见从河鲀中提取ace抑制肽的相关报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从河鲀鱼皮中提取得到的ace抑制肽p1，与ace酶的结合能力强、活性高，可以应用于辅助降血压药物或功能食品中。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明公开了ace抑制肽p1，其氨基酸序列为：fnlrmq。进一步地，其分子量为807.97da，ic50为0.47μm。本发明公开了上述ace抑制肽p1在辅助降血压药物或辅助降血压功能食品中的应用。本发明还公开了ace抑制肽p1的制备方法，包括如下步骤：s1.取河鲀鱼皮，加入蛋白酶进行酶解，酶解温度控制为50℃～60℃，酶底比为2％～4％，ph为11～12，酶解时间为5h～7h。s2.对酶解产物进行初步过滤，去除残渣得到澄清的多肽酶解液。s3.选择聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为若干超滤组分，冻干不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉。s4.称取适量的不同分子量的多肽冻干粉，分别配制成多肽溶液，测定其对ace抑制率的大小，筛选得到对ace抑制活性最强的多肽冻干粉。s5.将筛选得到的多肽冻干粉采用lc-ms/ms进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得若干多肽序列。s6.通过软件将多肽序列与ace蛋白进行分子对接，在对接之前通过能量最小化将多肽的2d结构转换为3d结构，筛选得到与ace蛋白的结合能力强的多肽序列。s7.将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到ace抑制肽p1。其中，步骤s1中酶解温度为55℃，酶底比为2％，ph为12，酶解时间为6h。优选地，步骤s3中选择截留量为1kda和5kda的聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为mw<1kda，1kda<mw<5kda和mw>5kda的三个超滤组分，冻干以上三个不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉。优选地，步骤s5中质谱测定条件为：色谱柱为pepmaprplcc18，阳离子模式，扫描范围：m/z300–1500da，发射极喷雾电压2kv。本发明具有如下有益效果：本发明方法制备得到的ace抑制肽p1与ace酶的亲和力好，活性较高，ic50值为0.47μm，可应用于开发辅助降血压的治疗药物或功能食品中。且由于本发明ace抑制肽p1是从河鲀鱼皮中提取得到，相比传统降压药物具有特异性高、毒副作用小的优点。附图说明图1为不同酶解温度对ace抑制率的影响。图2为不同酶解时间对ace抑制率的影响。图3为不同酶底比对ace抑制率的影响。图4为不同ph对ace抑制率的影响。图5为不同分子量大小的多肽组分对ace抑制率的影响。图6为不同分子量大小的多肽组分的ic50值。图7为本发明多肽fnlrmq的液相色谱图。图8为本发明多肽fnlrmq的质谱图。图9为fnlrmq与ace的结合模式示意图。图10为图9的局部放大示意图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的描述。本发明公开了一种ace抑制肽p1，其氨基酸序列为：fnlrmq。ace抑制肽p1的制备方法，包括如下步骤：s1.取河鲀鱼皮，加入蛋白酶进行酶解，酶解温度控制为50℃～60℃，酶底比为2％～4％，ph为11～12，酶解时间为5h～7h。优选为：酶解温度为55℃，酶底比为2％，ph为12，酶解时间为6h。本发明以ace抑制率为考核指标，根据选用的蛋白酶在不同的酶解时间、酶解温度、ph和酶添加量的条件下进行试验，考察各因素对ace抑制率的影响。具体实验结果如下详述。(1)不同酶解温度对ace抑制率活性的影响如图1所示，随着酶解温度的提高，胶原酶解产物对ace抑制活性呈现先增加后下降的趋势，当温度达到65℃时，胶原酶解产物对ace抑制活性急剧下降，可能是由于温度过高使得蛋白酶失活，造成酶活力的下降，导致水解效果下降，从而降低了其对dpph的清除率。因此，确定55℃为酶解反应最佳温度。(2)不同酶解时间对ace抑制率活性的影响如图2所示，随着酶解时间的增加，胶原酶解产物对ace抑制活性的影响也是呈现先增加后降低的趋势，酶解时间过长有活性的肽段可能会被持续酶解，从而使得抑制活性下降。因此，最适宜的酶解时间为6h。(3)不同酶底比对ace抑制率活性的影响如图3可知，随着酶浓度的增加，胶原酶解产物对ace抑制率呈现为先快速增加而后缓慢增加，在酶底比为4％时达到最高，但其抑制率比2％和3％增加不明显。随着进一步增加酶量，ace抑制率反而下降，当酶被底物饱和的时候，反应达到平衡。综合考虑经济成本及酶解效果，酶底比为2％较佳。(4)不同ph对ace抑制率活性的影响如图4所示，随着ph的升高，胶原酶解产物对ace抑制活性的影响也是呈现先增加后降低的趋势，这表明ph过高或过低均会抑制蛋白酶的活性，从而使得酶解效率下降，表现为ace抑制率下降。因此，选择ph＝12为适宜的ph。s2.对酶解产物进行初步过滤，去除残渣得到澄清的多肽酶解液。初步过滤可以采用八层纱布进行过滤。s3.选择截留量为1kda和5kda的聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为mw<1kda，1kda<mw<5kda和mw>5kda的三个超滤组分，冻干以上三个不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉。s4.称取适量的不同分子量的多肽冻干粉，分别配制成1mg/ml的多肽溶液，测定其对ace抑制率的大小，筛选得到对ace抑制活性最强的多肽冻干粉。ace抑制率的测试方法为：将100μl样品多肽溶液与50μl的50mu/ml的ace(ace溶于5000μl含有0.3mol/l氯化钠的0.1mol/l硼酸盐缓冲液，ph8.3)，37℃水浴10min。然后加入150μl5mmhhl(用含0.3mol/l氯化钠，ph值8.3的0.1mol/l硼酸盐缓冲液配制)，37℃水浴30min，结束加入200μl1.0mol/lhcl终止反应，蒸馏水作为空白样品。在此过程中，ace酶解hhl释放出马尿酸，马尿酸的浓度可通过高效液相色谱uv检测器228nm处进行检测。其中ace抑制率公式为：其中，ack为空白样品马尿酸的峰面积，as为酶解产物的马尿酸的峰面积。由图5、图6的结果可知，mw<1kda的抑制率最佳，1kda<mw<5kda的次之，mw>5kda对ace的抑制率最弱。s5.将筛选得到的mw<1kda的组分多肽冻干粉采用lc-ms/ms进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得若干多肽序列。质谱测定条件为：色谱柱为pepmaprplcc18，阳离子模式，扫描范围：m/z300–1500da，发射极喷雾电压2kv。质谱检测的结果采用peaksstudio软件分析，获得多肽序列82条。s6.通过moe软件将多肽序列与ace蛋白进行分子对接，在对接之前通过能量最小化将多肽的2d结构转换为3d结构，筛选得到与ace蛋白的结合能力强的多肽序列。蛋白质ace的3d结构可从rcsb蛋白质数据库(pdbid：1o8a)下载。分子对接的结果如下表1所示，对接分值的数值越小(绝对值越大)表明多肽与ace酶的结合能力越强，也最越有可能抑制ace酶的活性。表1不同多肽序列与ace酶的分子亲和力大小s7.将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到ace抑制肽p1。将表1的多肽序列固相合成，筛选得到活性较高的多肽序列，即上表中的14，氨基酸序列号为fnlrmq，即得到本发明ace抑制肽p1。对ace抑制肽p1进行液相和质谱的测定，如图7、图8所示，分子量为807.97da，ic50值为0.47μm。ace抑制肽p1可溶解于超纯水、pbs和dmso，如表2所示。表2.ace抑制肽p1的溶解性测试溶剂溶解性多肽浓度超纯水可溶≦10mg/ml1xdpbs*(ph7.1±0.1)可溶≦10mg/mldmso可溶≦10mg/ml将本发明的多肽通过moe软件与ace蛋白进行分子对接模拟实验，可得本发明ace抑制肽p1与ace的结合方式如图9、图10所示。ace中h353的咪唑基的氮原子与p1中的m5的硫醚基的硫原子形成一个氢键。ace中d453的羧基氧原子与p1中f1骨架的氮原子形成一个氢键。ace中k454氨基的氮原子与p1中n2酰胺基的氧原子形成一个氢键。ace中y523的酚羟基的氧原子与p1中q6的酰胺基的氧原子形成一个氢键。ace中e162的羧基氧原子与p1中r4的胍基氮原子形成盐桥。ace中d377的羧基氧原子与p1中r4的胍基氮原子形成盐桥。ace中e376的羧基氧原子与p1中r4的胍基氮原子形成盐桥。ace中的zn2+与p1中q6的酰胺基的氧原子形成离子接触。对接模拟研究表明ace中的zn2+，e162，h353，e376，d377，d453，k454和y523参与与f1，n2，r4，m5和q6的结合，p1的残余物通过离子接触，盐桥结合和氢键相互作用。如下表3所示。表3.ace抑制肽p1与ace活性接触列表链a残基链b残基相互作用类型acehis353p1m5氢键相互作用aceasp453p1f1氢键相互作用acelys454p1n2氢键相互作用acetyr523p1q6氢键相互作用acezn2+p1q6离子键aceglu162p1r4盐桥aceglu376p1r4盐桥aceasp377p1r4盐桥综上，通过本发明方法制备得到的ace抑制肽p1与ace酶的相互作用强，活性高，可以应用于辅助降血压药物或辅助降血压功能食品中。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）<120>ace抑制肽p1、其应用及其制备方法<160>1<170>patentinversion3.5<210>p1<211>6<212>prt<213>河鲀<400>p1pheasnleuargmetgln15当前第1页12