本发明涉及一种含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物及其制备方法，属于药物化学领域。
背景技术：
近年来，人们在临床治疗中大量使用、滥用抗菌药物，再加上细菌较强的适应能力，产生了越来越严重的细菌耐药性问题，甚至出现了对绝大多数抗生素均不敏感的“超级细菌”，迫切需要开发更加有效的新型抗菌药物，尤其是那些具有新型靶点与作用机制的抗菌药物，以应对当前日益严重的细菌耐药性问题。研究发现一些硫脲嘧啶类化合物可以通过抑制细菌体内的seca蛋白达到抑菌作用，1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶是非常重要的一种含氮稠杂环药效团，具有多种生物活性。将不同药效基团进行拼接有利于发现抗菌作用更好的新型药物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物，该化合物对多种菌类具有良好的抑制作用，在新药开发中具有广阔的应用前景。
为了解决上述问题，本发明采取如下技术方案：
一种含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物，其结构如通式ⅰ所示：
ⅰ；
其中，r1表示苯环上的一个或位于不同位置的两个或三个卤素原子，r2表示苯环上的h原子、一个或位于不同位置的两个卤素原子、或者苯基。
优选的，所述卤素原子为氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子。
进一步优选的，所述r1为4-cl时，所述r2为h、2-cl、4-cl、2,4-cl2或4-ph；所述r1为3,4-cl2时，所述r2为h、2-cl、4-cl、2,4-cl2或4-ph；所述r1为3,4,5-cl3时，r2为h、2-cl、4-cl、2,4-cl2或4-ph。
本发明的另一个目的是提供上述化合物的制备方法，采取如下方案：
a、将3-氨基-1,2,4-三氮唑1和4-氯乙酰乙酸乙酯2溶于冰醋酸中，加热回流反应，然后将反应混合物冷却，产生黄色固体沉淀并分离干燥，得到中间体3；
b、将中间体3和pocl3混合并回流反应，然后去除多余的pocl3，然后加入冰水并用氯仿萃取，收集有机相并干燥，去除有机溶剂得到中间体4；
c、将中间体4和被所述r1取代的苯胺溶解在异丙胺中，加热反应并产生沉淀，然后除去溶剂，干燥得到中间体5；
d、合成中间体6：将被所述r2取代的苯甲醛、氰基乙酸乙酯和硫脲及无水乙醇加入反应器，再加入哌啶做催化剂，加热回流反应后产生沉淀，反应结束后冷却，分离得到中间体6的粗品，将该粗品溶解于naoh溶液中，用乙酸乙酯洗涤并分离水溶液，向水溶液中加酸调节水溶液ph为2左右，出现沉淀，分离沉淀并干燥后得到中间体6；
e、将中间体6、中间体5和k2co3加入反应器，并加入乙腈，加热回流，出现沉淀，反应完成后除去溶剂，用氢氧化钠溶液洗涤沉淀，过滤得到含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物ⅰ的粗品并纯化；
以上各步所涉结构如下：
进一步的，上述制备方法可优化为：
a、中间体3的合成：将20mmol的3-氨基-1,2,4-三氮唑1和25mmol的4-氯乙酰乙酸乙酯2溶于15ml冰醋酸中，加热回流反应8小时，反应结束后，将反应混合物冷却至0℃以下，产生大量黄色固体沉淀，减压过滤，少量冰醋酸洗涤，45℃下真空干燥后得到中间体3；
b、中间体4的合成：将10mmol的中间体3和14mlpocl3加入100ml圆底烧瓶中，然后将混合物回流反应5小时，反应结束后，经减压蒸馏除掉多余pocl3，然后在烧瓶中加入40毫升冰水，再用30ml×3氯仿分三次萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥4小时，然后过滤除去硫酸钠，旋蒸除去有机溶剂得到中间体4；
c、中间体5的合成：将3mmol的化合物4和3.3mmol被所述r1取代的苯胺溶解在25ml异丙胺中，油浴加热至50℃下反应5小时，产生大量沉淀，反应结束后经过滤除去溶剂，并用少量异丙醇洗涤沉淀，45℃下真空干燥得到中间体5，直接用于下一反应；
d、中间体6的合成：取100ml干燥的圆底烧瓶，加入10mmol的被所述r2取代的苯甲醛、10mmol的氰基乙酸乙酯和10mmol的硫脲及无水乙醇50ml，再加入20mmol的哌啶做催化剂，油浴加热回流反应10小时，产生大量沉淀，反应结束后冷却至室温，经减压过滤得到中间体6的粗品，将该粗品溶解于20ml0.5mol/lnaoh中，用10ml×3乙酸乙酯分三次洗涤并分离水溶液，然后向水溶液中缓慢添加1mol/lhcl调节水溶液ph为2左右，出现大量沉淀，减压过滤，105℃干燥后得到中间体6；
e、将1.1mmol的中间体6、1mmol的中间体5和3mmol的k2co3加入100ml干燥的圆底烧瓶，并加入30ml乙腈，油浴加热回流反应10小时，出现大量沉淀，反应完成后经减压蒸馏除去溶剂，用0.2mol/l氢氧化钠洗涤沉淀，减压过滤得到含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物ⅰ的粗品，使用淋洗剂v乙酸乙酯/v甲醇=8:1~15:1进行柱层析纯化得到含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物ⅰ的纯品。
本发明的第三个目的是提供上述化合物在抑制解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中的应用。
本发明的有益效果在于，采用药效基团的拼接理念，设计并合成了一类含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物，该化合物结构新颖，并具有良好的抑菌作用。所采用的制备方法步骤简洁，所用原料容易获得，易于规模化生产。通过抑菌试验可知，本含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物对解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中具有较为理想的抑制应用，从而具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面通过以下及生物学评价对本发明作进一步说明，但下述实施例不应理解为对本发明的限制。
所用仪器设备如表1所示：
表1仪器设备
实施例1：含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物的合成
合成采用如下步骤：
a、中间体3的合成：将20mmol的3-氨基-1,2,4-三氮唑1和25mmol的4-氯乙酰乙酸乙酯2溶于15ml冰醋酸中，加热回流反应8小时，反应结束后，将反应混合物冷却至0℃以下，产生大量黄色固体沉淀，减压过滤，少量冰醋酸洗涤，45℃下真空干燥后得到中间体3；
b、中间体4的合成：将10mmol的中间体3和14mlpocl3加入100ml圆底烧瓶中，然后将混合物回流反应5小时，反应结束后，经减压蒸馏除掉多余pocl3，然后在烧瓶中加入40毫升冰水，再用30ml×3氯仿分三次萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥4小时，然后过滤除去硫酸钠，旋蒸除去有机溶剂得到中间体4；
c、中间体5的合成：将3mmol的化合物4和3.3mmol被r1取代的苯胺溶解在25ml异丙胺中，油浴加热至50℃下反应5小时，产生大量沉淀，反应结束后经过滤除去溶剂，并用少量异丙醇洗涤沉淀，45℃下真空干燥得到中间体5，直接用于下一反应；
d、中间体6的合成：取100ml干燥的圆底烧瓶，加入10mmol的被r2取代的苯甲醛、10mmol的氰基乙酸乙酯和10mmol的硫脲及无水乙醇50ml，再加入20mmol的哌啶做催化剂，油浴加热回流反应10小时，产生大量沉淀，反应结束后冷却至室温，经减压过滤得到中间体6的粗品，将该粗品溶解于20ml0.5mol/lnaoh中，用10ml×3乙酸乙酯分三次洗涤并分离水溶液，然后向水溶液中缓慢添加1mol/lhcl调节水溶液ph为2左右，出现大量沉淀，减压过滤，105℃干燥后得到中间体6；
e、将1.1mmol的中间体6、1mmol的中间体5和3mmol的k2co3加入100ml干燥的圆底烧瓶，并加入30ml乙腈，油浴加热回流反应10小时，出现大量沉淀，反应完成后经减压蒸馏除去溶剂，用0.2mol/l氢氧化钠洗涤沉淀，减压过滤得到含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物ⅰ的粗品，使用淋洗剂v乙酸乙酯/v甲醇=8:1~15:1进行柱层析纯化得到含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物ⅰ的纯品。
上述各步骤中涉及到的化学结构如下：
其中，r1表示苯环上的一个或位于不同位置的两个或三个卤素原子，r2表示苯环上的h原子、一个或位于不同位置的两个卤素原子、或者苯基。
优选的，所述卤素原子为氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子。
再进一步的，所述r1为4-cl时，所述r2为h（记为化合物ⅰa）、2-cl（记为化合物ⅰb）、4-cl（记为化合物ⅰc）、2,4-cl2（记为化合物ⅰd）或4-ph（记为化合物ⅰe）；所述r1为3,4-cl2时，所述r2为h（记为化合物ⅰf）、2-cl（记为化合物ⅰg）、4-cl（记为化合物ⅰh）、2,4-cl2（记为化合物ⅰi）或4-ph（记为化合物ⅰj）；所述r1为3,4,5-cl3时，r2为h（记为化合物ⅰk）、2-cl（记为化合物ⅰl）、4-cl（记为化合物ⅰm）、2,4-cl2（记为化合物ⅰn）或4-ph（记为化合物ⅰo）。
实施例2某些含硫脲嘧啶的1,2,4-三氮唑并[1,5-a]嘧啶类化合物的结构表征
2-((7-((4-氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-4-苯基-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰa）
淡黄色固体，产率73.1%,m.p.224.2-225.3oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:8.248(s,1h,arh),7.693~7.704(d,j=6.6hz,2h,arh),7.402~7.434(m,3h,arh),7.292~7.306(d,j=8.4hz,2h,arh),7.156~7.170(d,j=8.4hz,2h,arh),6.398(s,1h,arh),4.166(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.29,170.32,166.86,156.31,153.43,147.15,137.65,129.58,128.99,128.01,127.97,124.55,120.07,88.92,88.43,36.26;ms(esi)m/z:486.5([m+h]+).anal.calcdforc23h15cln8os:c,56.73;h,3.10;n,23.01.found:c,56.80;h,3.16;n,23.04.
4-(2-氯苯基)-2-((7-((4-氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰb）
淡黄色固体，产率67.6%,m.p.227.3-229.6oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.918(s,1h,arh),7.484~7.497(d,j=7.8hz,1h,arh),7.405~7.429(m,1h,arh),7.351~7.376(t,j=7.8hz,1h,arh),7.269~7.282(d,j=7.8hz,1h,arh),7.202~7.216(d,j=8.4hz,1h,arh),6.894~6.908(d,j=8.4hz,2h,arh),5.874(s,1h,arh),3.964(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.82,169.28,166.83,157.38,152.03,137.32,131.00,130.15,130.00,129.30,128.66,126.93,123.95,118.92,99.81,91.44,87.64,36.45;ms(esi)m/z:519.1([m-h]+).anal.calcdforc23h14cl2n8os:c,52.98;h,2.71;n,21.49.found:c,53.06;h,2.80;n,21.55.
4-(4-氯苯基)-2-((7-((4-氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰc）
淡黄色固体，产率75.3%,m.p.227.3-229.6oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.959(s,1h,arh),7.732~7.746(d,j=8.4hz,2h,arh),7.463~7.477(d,j=8.4hz,2h,arh),7.182~7.196(d,j=8.4hz,2h,arh),6.910~6.923(d,j=7.8hz,2h,arh),5.960(s,1h,arh),4.020(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.89,170.18,165.42,157.28,152.18,148.93,136.48,134.33,129.85,128.65,128.07,124.01,119.98,88.65,87.65,36.49;ms(esi)m/z:519.1([m-h]+).anal.calcdforc23h14cl2n8os:c,52.98;h,2.71;n,21.49.found:c,53.07;h,2.79;n,21.52.
2-(((7-((4-氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-4-(2,4-二氯苯基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰd）
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3-([1,1'-联苯]-4-基)-2-((7-((4-氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰe）
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2-(((7-((3,4-二氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-4-苯基-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰf）
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3-(2-氯苯基)-2-(((7-((3,4-二氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰg）
淡黄色固体，产率66.4%,m.p.229.8-233.0oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.882(s,1h,arh),7.469~7.481(d,j=7.2hz,1h,arh),7.389~7.418(m,1h,arh),7.319~7.343(m,2h,arh),7.255~7.265(d,j=7.2hz,1h,arh),6.999~7.003(d,j=2.4hz,1h,arh),6.828~6.847(dd,j=9.0hz,j=3.0hz,1h,arh),5.852(s,1h,arh),3.960(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.79,169.29,166.79,159.23,157.46,151.99,149.76,137.34,131.01,130.91,130.37,130.15,129.98,129.30,126.90,123.81,122.36,120.65,118.92,91.48,87.46,36.41;ms(esi)m/z:555.0([m-h]+).anal.calcdforc23h13cl3n8os:c,49.70;h,2.36;n,20.16.found:c,49.78;h,2.43;n,20.20.
3-(4-氯苯基)-2-(((7-((3,4-二氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰh）
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3-(2,4-二氯苯基)-2-(((7-((3,4-二氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰi）
淡黄色固体，产率65.9%,m.p.237.2-240.0oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.887(s,1h,arh),7.667~7.670(d,j=1.8hz,1h,arh),7.435~7.452(m,1h,arh),7.329~7.343(d,j=8.4hz,1h,arh),7.309~7.323(d,j=8.4hz,1h,arh),7.003~7.007(d,j=2.4hz,1h,arh),6.833~6.851(dd,j=8.4hz,j=2.4hz,1h,arh),5.847(s,1h,arh),3.964(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.96,169.06,165.79,157.47,151.98,149.75,139.25,136.25,133.96,132.23,131.34,130.90,130.38,128.88,127.24,123.78,122.38,118.78,91.46,87.44,36.43;ms(esi)m/z:589.0([m-h]+).anal.calcdforc23h13cl3n8os:c,46.80;h,2.05;n,18.98.found:c,46.87;h,2.11;n,20.03.
5-([1,1'-联苯]-4-基)-2-(((7-((3,4-二氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰj）
淡黄色固体，产率60.2%,m.p.243.1-245.8oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.909(s,1h,arh),7.820~7.833(d,j=7.8hz,2h,arh),7.696~7.723(t,j=7.8hz,4h,arh),7.470~7.495(t,j=7.2hz,2h,arh),7.385~7.397(d,j=7.2hz,1h,arh),7.288~7.302(d,j=8.4hz,1h,arh),7.033(m,1h,arh),6.846~6.860(d,j=8.4hz,1h,arh),5.954(s,1h,arh),4.040(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.81,170.87,167.68,166.17,157.41,153.43,152.02,141.24,139.47,136.73,130.87,130.28,128.95,128.65,127.74,126.73,123.96,122.36,87.40,36.46;ms(esi)m/z:594.8([m+h]+).anal.calcdforc29h18cl2n8os:c,58.30;h,3.04;n,18.75.found:c,58.38;h,3.10;n,18.80.
2-((7-((3,4,5-三氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-6-氧代-4-苯基-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰk）
淡黄色固体，产率64.7%,m.p.233.6-236.2oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:8.571(s,1h,arh),7.752~7.764(d,j=7.2hz,2h,arh),7.627(s,2h,arh),7.454~7.478(t,j=7.2hz,1h,arh),7.376~7.401(d,j=7.2hz,2h,arh),6.884(s,1h,arh),4.518(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:166.82,166.91,155.23,155.03,154.83,145.25,137.36,133.39,130.65,130.61,128.27,128.09,126.36,123.95,115.59,90.29,36.13;ms(esi)m/z:557.2([m+h]+).anal.calcdforc23h13cl3n8os:c,49.70;h,2.36;n,20.16.found:c,49.77;h,2.43;n,20.20.
5-(2-氯苯基)-6-氧代-2-(((7-((3,4,5-三氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰl）
淡黄色固体，产率62.1%,m.p.235.9-238.2oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.915(s,1h,arh),7.468~7.481(d,j=7.8hz,1h,arh),7.413~7.425(d,j=7.2hz,1h,arh),7.333~7.356(t,j=7.2hz,1h,arh),7.260~7.273(t,j=7.8hz,1h,arh),7.020(s,2h,arh),5.923(s,1h,arh),4.019(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.69,169.31,166.74,162.91,19.81,157.38,152.83,152.15,150.12,148.15,137.35,132.62,131.03,130.10,129.96,129.30,126.84,122.52,118.91,118.57,91.60,87.44,36.36;ms(esi)m/z:591.2([m+h]+).anal.calcdforc23h12cl4n8os:c,46.80;h,2.05;n,18.98.found:c,46.87;h,2.11;n,19.04.
5-(4-氯苯基)-6-氧代-2-(((7-((3,4,5-三氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰm）
淡黄色固体，产率65.6%,m.p.231.1-234.0oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:8.005(s,1h,arh),7.728~7.742(d,j=8.4hz,2h,arh),7.436~7.450(d,j=8.4hz,2h,arh),7.076(s,2h,arh),6.111(s,1h,arh),4.090(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.65,170.15,165.30,157.07,152.51,139.25,136.47,134.32,132.70,129.79,128.01,122.65,120.01,115.58,99.81,88.90,87.69,36.30;ms(esi)m/z:589.0([m-h]+).anal.calcdforc23h12cl4n8os:c,46.80;h,2.05;n,18.98.found:c,46.86;h,2.10;n,19.03.
5-(2,4-二氯苯基)-6-氧代-2-(((7-((3,4,5-三氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰn）
淡黄色固体，产率62.1%,m.p.237.3-239.7oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.919(s,1h,arh),7.656~7.659(d,j=1.8hz,1h,arh),7.432~7.449(m,1h,arh),7.310~7.324(d,j=8.4hz,1h,arh),7.025(s,2h,arh),5.920(s,1h,arh),4.019(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:171.86,169.08,165.74,159.73,157.38,152.83,152.15,152.10,136.27,133.97,132.63,132.25,131.32,128.89,127.18,122.53,118.57,91.58,87.41,36.37;ms(esi)m/z:623.0([m-h]+).anal.calcdforc23h12cl4n8os:c,44.22;h,1.77;n,17.94.found:c,44.28;h,1.83;n,17.99.
4-([1,1'-联苯]-4-基)-6-氧代-2-(((7-((3,4,5-三氯苯基)氨基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)硫代)-1,6-二氢嘧啶-5-腈（ⅰo）
淡黄色固体，产率58.3%,m.p.243.2-246.1oc;1hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:7.929(s,1h,arh),7.813~7.827(d,j=8.4hz,2h,arh),7.679~7.813(m,4h,arh),7.468~7.493(t,j=7.8hz,2h,arh),7.731~7.739(t,j=7.2hz,1h,arh),7.058(s,1h,arh),7.017(s,1h,arh),6.026(s,1h,arh),4.078(s,2h,ch2);13cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:178.92,171.67,170.43,166.12,158.98,152.84,152.76,152.44,136.80,132.60,128.95,128.62,126.73,126.17,122.81,122.53,112.63,91.92,87.35,36.94;ms(esi)m/z:631.9([m+h]+).anal.calcdforc23h12cl4n8os:c,55.12;h,2.71;n,17.73.found:c,55.19;h,2.78;n,17.79.
实施例3抑菌活性研究
细菌抑菌率测定（平板菌落计数法，以诺氟沙星做对照）
药物平板的制备：
精确称取适量的供试药物，用少量dmso溶解后，加入na培养基中至终浓度50μg/ml混匀后倒平板，凝固后备用。
病原菌菌悬液的制备：
在超净工作台中，取病原菌斜面一支，加入10ml无菌水，用灭菌竹签轻轻刮取培养基表面的菌苔，打散，漩涡振荡器振荡均匀，制成菌悬液。
病原菌菌悬液的梯度稀释：
取菌悬液1ml加入到9ml无菌水中，震荡均匀制成10-1稀释液。再吸取1ml10-1稀释液加入到9ml无菌水中，震荡均匀制成10-2稀释液；以此类推，制备系列梯度菌悬液。
菌落计数：
各吸取10-6或10-7梯度菌悬液70μl，分别加入到药物平板和不加药的na培养基平板(对照)上，用灭菌三角刮涂布均匀，做好标识，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。24小时后，进行菌落计数。每组设置三次平行试验。
抑菌率=（对照组菌落数-药物平板菌落数）/对照组菌落数*100%
试验结果如表2所示。
表2化合物ⅰ的抑菌活性(抑制率/%,50µg/ml)
对上述化合物进行构效分析可知，采用“活性亚结构拼接”的药物设计策略将具有抗菌作用的硫脲嘧啶与稠杂环[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶两类药效团通过硫原子连接到一起，将两者整合到一个有机化合物分子ⅰ之中。该化合物ⅰ未见报道，是完全新颖的有机化合物分子。其中硫脲嘧啶可作用于细菌体内新型靶点seca（针对该靶点的抗菌药物未见上市报道），稠杂环[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶含有多个氮原子且具有刚性平面结构（环内存在大π键），可以和靶点蛋白产生较多的氢键作用，从而产生更强抗菌作用。从初步的体外抗菌实验效果来看，在上述的测试条件下新设计合成的化合物ⅰc、ⅰd以及ⅰg都表现出很强的抗菌作用，尤其是ⅰd对测试的三种菌株抑制率都达到100%，与对照品诺氟沙星抗菌效果相当，该化合物ⅰd表现出很大的潜力。