特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体的，本发明涉及基于一种特有靶标引物在同时快速检测草莓尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌中应用的
技术领域：
。
背景技术：
：草莓(fragariaananassaduch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物，果肉鲜美多汁，堪称“水果皇后”。近年来，草莓种植面积逐年增大，品种不断更新，频繁地调种、引种以及连作，其中草莓枯萎病和炭疽病为两种最常见也是目前最主要的病害。草莓枯萎病是由尖孢镰刀菌从根部侵染引起的系统性病害，从苗期到收获期都会发生。草莓感染草莓枯萎病后，地上部分表现为心叶变黄绿、卷曲呈船形、两边不对称，叶片无光泽，叶柄及根部维管束变褐色或黑褐色，地下根系黑褐色，不长新根。该病可导致草莓结果减少、果实无法正常膨大、品质降低，甚至全株枯死。草莓炭疽病主要为害草莓的匍匐茎与叶片，严重时病菌侵入短缩茎，致使整株凋萎枯死；叶片、托叶、花及果实也可感染。以上两种病害症状一旦发现，对农业生产造成巨大危害，并且病害流行速度快，造成的经济损失非常严重，国外对草莓炭疽病目前被普遍认可的是由胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、尖孢炭疽菌(c.acutatum)、草莓炭疽菌(c.fragariae)以及其它炭疽菌病引起了草莓炭疽病。鉴于草莓病害为害的严重性，因此，明确每种病害的病原菌种类对于控制病害的发生尤为重要。目前没有杀菌剂可以安全、有效而又经济地控制这两种病害。因此，亟需一种能够在发病初期或者土壤中进行早期快速检测鉴别的技术，以便及时采用有针对性的有效防治措施来控制病害的发生和传播。传统的病原菌检测技术、免疫学检测技术已经很难明确地鉴定病原菌且耗时长、灵敏度低，而目前大多数分子生物学检测技术费时、费力、准确性低，且不能在病害潜伏期和初期作出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通pcr的新的核酸扩增技术。国内外对此技术在草莓病毒病的检测中的应用，对草莓炭疽菌限于单个菌种的检测，缺少对炭疽属的lamp检测，且多为单一lamp检测，目前还没有利用lamp检测同时检测草莓尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的报道。技术实现要素：目前，针对大部分真菌rdna-its序列相似性较高，仅以its区作为靶序列，不能有效地进行检测的技术现状，且现有技术中未见有文献记载和披露利用lamp技术同时快速鉴定出草莓感染的尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的技术现状。本发明旨在于提供特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，通过设计尖孢镰刀菌的特异性its序列的lamp引物、cyp序列的lamp引物、igs序列的lamp引物等技术手段，最终选择igs序列设计鉴定草莓尖孢镰刀菌的lamp引物，同时利用炭疽菌属菌种its后半部分与其它属同源性极低的特性，设计its序列的lamp特异引物，快速准确的将草莓中尖孢镰刀菌和炭疽菌分辨检测，具有广泛的应用推广价值。为了达到以上技术目的，本发明采用的技术方案：本发明具体提供特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，特有靶标引物由草莓尖孢镰刀菌igs基因和草莓炭疽菌its基因的lamp引物序列组成。草莓尖孢镰刀菌igs基因的lamp检测由5条特异引物fip、bip、f3、b3和loop组成；草莓炭疽菌its基因lamp分子检测的6条特异性引物fip、bip、f3、b3、loopf、loopb组成。进一步，本发明提供一种同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的lamp检测试剂盒，所述检测试剂盒包括1.0μl的bstdna聚合酶(8u)，2.5μl的10×bstreactionbuffer，4μl的0.8mol/l甜菜碱，3.5μl的1.4mmol/ldntps，4μl的8mmol/lmgso4，尖孢镰刀菌lamp引物20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物loop0.5μl；炭疽菌lamp引物10μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，20μmol/l的fip和bip引物各1μl，10μmol/l环引物loop各1μl，1μldna模板(10ng/μl)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。具体的，本发明提供一种同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的lamp检测试剂盒的应用，具体的应用技术方案包括如下步骤：(1)引物设计与合成根据genbank中已知的草莓尖孢镰刀菌igs基因，炭疽菌属its基因后半部分区域作为靶序列，与镰刀菌属its区域非重复序列，采用在线的primerexplorerver.5引物设计软件设计两组特异lamp引物：特异性检测草莓尖孢镰刀菌igs基因的lamp引物序列为：fip:gcaacctggcgaggacgaaacactgtcgaaacgagatgcgbip:aattcgagtttcgtcgccgacagccggagagagatttgcctaf3:gcggaatgggaagtcgattcb3:tcacgaccaccagacaagtloop:gttttctgtgggtgtatggtaggta特异性检测炭疽菌its基因的lamp引物序列为：fip:ctacgcaaaggaggctccgggggccctacagctgatgtbip:ttacgtctcgcactgggatccgtccgaggtcaacctttggaaf3:tcaagctctgcttggtgttgb3:gttcagcgggtattcctaccloopf:gccactacctttgagggccloopb:gagggactcttgccgtaaaa(2)dna模板获取：取待检病样的茎基部，用水冲洗干净，取病样组织、含有病原菌土壤或者将发病组织分离到的病原菌菌丝2mg放入灭菌离心管中，加入dna样品处理液50μl，80℃反应5min，得到含有病原菌dna的待检病样品悬浮液，采用快速提取法提取dna。(3)配制单一lamp反应体系：lamp反应体系各组分含量为，总体系25μl，包括1.0μl的bstdna聚合酶(8u)，2.5μl的10×bstreactionbuffer，4μl的0.8mol/l甜菜碱，3.5μl的1.4mmol/ldntps，4μl的8mmol/lmgso4，20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物loop0.5μl，1μldna模板(10ng/μl),加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。(4)配制双重lamp反应体系：lamp反应体系各组分含量为，总体系25μl，包括1.0μl的bstdna聚合酶(8u)，2.5μl的10×bstreactionbuffer，4μl的0.8mol/l甜菜碱，3.5μl的1.4mmol/ldntps，4μl的8mmol/lmgso4，尖孢镰刀菌lamp引物20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物loop0.5μl；炭疽菌lamp引物10μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，20μmol/l的fip和bip引物各1μl，10μmol/l环引物loop各1μl，1μldna模板(10ng/μl)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。(5)反应条件优化：以待检病样品悬浮液为模板，将上述反应体系进行lamp等温扩增反应，反应温度65℃，采用优化的lamp体系扩增45min。反应结束后加入sybr荧光染料，通过肉眼观察环介导等温扩增的反应产物，如反应产物为荧光绿色的浑浊液体，即确认病样中含有尖孢镰刀菌或者炭疽菌，如反应产物为橙色透明液体，则表明病样不含有尖孢镰刀菌或者炭疽菌。(6)扩增产物的检测：将显色反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，观察到梯状条带即为阳性结果，无条带即为阴性结果。通过实施以上技术方案，本发明获得以下技术效果：(1)快速、简便：本发明直接鉴定草莓组织中的尖孢镰刀菌和炭疽菌，鉴定周期为1h内，非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强，dna快速检测试剂盒价格低廉，方法简单，只用一种试剂，反应时间5min即得所需dna，平均提取单个样品dna大约需要花费2元左右，适合向基层推广。(2)准确性高、灵敏度高：本发明根据尖孢镰刀菌特异基因序列igs和炭疽菌属its基因序列设计特异的lamp引物，检测结果准确可靠；普通pcr扩增该产物只能使用dna原液稀释至10×10-2ng/μl，稀释后液体均不能扩增出条带，本发明使用的模板dna含量低于10ng/ul，微量分光光度计等检测核酸浓度的仪器均不能测得其浓度，利用本方法提取的dna稀释至10×10-5ng/μl进行lamp技术扩增，其产物跑电泳也可以看到清晰的梯状条带的，灵敏度提高了1000倍。(3)检测模板范围广：本发明利用三种模板，即发病植株组织、分离培养物菌丝、含有病原菌土壤分别提取dna进行lamp扩增试验，均获得了良好效果。利用不同含有病原菌模板进行扩增，显色反应均显示阳性结果，拓宽了模板的检测范围，不同科研单位可根据条件选择不同模板扩增，基于基层单位的实验条件有限，可以不经过室内病原菌的分离纯化即可有效快速地从土壤和病株中提取的dna进行lamp检测鉴定，这对于草莓病原菌实时监测和前期预警具有重要作用。(4)本发明利用igs基因设计的lamp引物具有特异性，能够特异性识别草莓尖孢镰刀菌，而不能识别其它镰刀菌种，且同时检测两个靶标菌属，其中一个具体到真菌菌种，另一个可以检测至真菌属，能够快速确定待测样品是否存在病原菌侵染，进而根据需要确定病原菌类型，减少了时间消耗和成本。(5)利用本发明提供的特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，实现了首次快速地特异性检测草莓尖孢镰刀菌在草莓植株体内是否存在，对于含有草莓尖孢镰刀菌菌株能够可视化产生荧光绿色，对于属内其它镰刀菌则显示橘黄色。附图说明图1显示为igs引物在利用lamp技术快速检测草莓尖刀镰孢菌的特异性对比图，图中，从左至右依次为草莓尖刀镰孢菌(阳性)、马铃薯链格孢菌、草莓腐皮镰刀菌、禾谷镰刀菌、恶疫霉菌、鹰嘴豆枯萎镰刀菌，马铃薯腐皮镰刀菌。图2显示为its引物在利用lamp技术快速检测草莓炭疽菌的特异性对比图，图中，从左至右依次为草莓茶树炭疽菌(阳性)、胶孢炭疽菌(阳性)、马铃薯链格孢菌、马铃薯腐皮镰刀菌、禾谷镰刀菌、恶疫霉、草莓尖孢镰刀菌，阴性对照。图3显示为its引物和igs引物对不同菌株样品的双重lamp检测对比图，图中，a：以炭疽菌dna为模板的双重lamp检测；b：以镰刀菌dna为模板的双重lamp检测。图4显示为特有靶标基因在利用lamp技术与pcr技术检测草莓尖刀镰孢菌和炭疽菌中的灵敏度对比图，图中，a：利用lamp技术快速检测草莓尖刀镰孢菌的灵敏度测试结果：从右至左依次10倍稀释，浓度为10ng/μl～10×10-6ng/μl；b：利用普通pcr技术检测草莓尖刀镰孢菌的灵敏度测试结果：从右至左依次10倍稀释，浓度为10ng/μl～10×10-6ng/μl。具体实施方式下面举实施例结合附图1至附图4具体展开说明本发明，但是本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有材料、实际和仪器的测定方法都为本领域熟知的但不限制本发明的实施例，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可以适用于本发明以下实施方式的实施。实施例1：草莓尖孢镰刀菌igs基因和草莓炭疽菌its基因的lamp引物序列特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，特有靶标引物由草莓尖孢镰刀菌igs基因和草莓炭疽菌its基因的lamp引物序列组成。草莓尖孢镰刀菌igs基因的lamp检测由5条特异引物fip、bip、f3、b3和loop组成，具体如seqidno.1-5所示；草莓炭疽菌its基因lamp分子检测的6条特异性引物fip、bip、f3、b3、loopf、loopb组成，具体如seqidno.6-11所示。实施例2：同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的lamp检测试剂盒同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的lamp检测试剂盒，所述检测试剂盒包括1.0μl的bstdna聚合酶(8u)，2.5μl的10×bstreactionbuffer，4μl的0.8mol/l甜菜碱，3.5μl的1.4mmol/ldntps，4μl的8mmol/lmgso4，尖孢镰刀菌lamp引物20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物loop0.5μl；炭疽菌lamp引物10μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，20μmol/l的fip和bip引物各1μl，10μmol/l环引物loop各1μl，1μldna模板(10ng/μl)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。实施例3：同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的lamp检测试剂盒的应用具体的，本发明提供一种同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的lamp检测试剂盒的应用，具体的应用技术方案包括如下步骤：(1)引物设计与合成根据genbank中已知的草莓尖孢镰刀菌igs基因，炭疽菌属its基因后半部分区域作为靶序列，与镰刀菌属its区域非重复序列，采用在线的primerexplorerver.5引物设计软件设计两组特异lamp引物：特异性检测草莓尖孢镰刀菌igs基因的lamp引物序列为：fip:gcaacctggcgaggacgaaacactgtcgaaacgagatgcgbip:aattcgagtttcgtcgccgacagccggagagagatttgcctaf3:gcggaatgggaagtcgattcb3:tcacgaccaccagacaagtloop:gttttctgtgggtgtatggtaggta特异性检测炭疽菌its基因的lamp引物序列为：fip:ctacgcaaaggaggctccgggggccctacagctgatgtbip:ttacgtctcgcactgggatccgtccgaggtcaacctttggaaf3:tcaagctctgcttggtgttgb3:gttcagcgggtattcctaccloopf:gccactacctttgagggccloopb:gagggactcttgccgtaaaa(2)dna模板获取：取待检病样的茎基部，用水冲洗干净，取病样组织、含有病原菌土壤或者将发病组织分离到的病原菌菌丝2mg放入灭菌离心管中，加入dna样品处理液50μl，80℃反应5min，得到含有病原菌dna的待检病样品悬浮液，采用快速提取法提取dna。(3)配制单一lamp反应体系：lamp反应体系各组分含量为，总体系25μl，包括1.0μl的bstdna聚合酶(8u)，2.5μl的10×bstreactionbuffer，4μl的0.8mol/l甜菜碱，3.5μl的1.4mmol/ldntps，4μl的8mmol/lmgso4，20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物各0.5μl，1μldna模板(10ng/μl),加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。(4)配制双重lamp反应体系：lamp反应体系各组分含量为，总体系25μl，包括1.0μl的bstdna聚合酶(8u)，2.5μl的10×bstreactionbuffer，4μl的0.8mol/l甜菜碱，3.5μl的1.4mmol/ldntps，4μl的8mmol/lmgso4，尖孢镰刀菌lamp引物20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物loop0.5μl；炭疽菌lamp引物10μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，20μmol/l的fip和bip引物各1μl，10μmol/l环引物loop各1μl，1μldna模板(10ng/μl)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。(5)反应条件优化：以待检病样品悬浮液为模板，将上述反应体系进行lamp等温扩增反应，反应温度65℃，采用优化的lamp体系扩增45min。反应结束后加入sybr荧光染料，通过肉眼观察环介导等温扩增的反应产物，如反应产物为荧光绿色的浑浊液体，即确认病样中含有尖孢镰刀菌或者炭疽菌，如反应产物为橙色透明液体，则表明病样不含有尖孢镰刀菌或者炭疽菌。(6)扩增产物的检测：将显色反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，观察到梯状条带即为阳性结果，无条带即为阴性结果。实施例4：igs引物在利用lamp技术检测草莓尖刀镰孢菌中的特异性试验应用已知尖孢镰刀菌侵染引起的草莓植株病样组织，马铃薯病样组织中分离出的经鉴定致病菌、草莓腐皮镰刀菌以及其它病原菌菌菌株为材料，见表1，以草莓尖孢镰刀菌基因组dna为阳性。将尖孢镰刀菌平板培养菌丝放入装有50μl的dna快速提取液离心管中，80℃反应5min，获得待检病样品的悬浮液原液。将原液按照10倍系列稀释，稀释至10-6μmol/l。配制环介导等温扩增(lamp)反应混合物，包括1μl的不同浓度的待检病样品悬浮液原液和稀释液、bstdna聚合酶(8u)，10×bstreactionbuffer，0.8mol/l甜菜碱，1.4mmol/ldntps，8mmol/lmgso4，20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物loop0.5μl，以及去离子水补充至25μl；将pcr管放入pcr仪或者恒温水浴锅中，设置反应参数：65℃反应45min；扩增反应完后在反应管中加入1000×的sybrgreeni核酸染料2μl，混匀，静置1min。观察pcr管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判定，并拍照。表1：试验中所用菌株名称及来源菌株来源或菌株编号宿主结果尖孢镰刀菌当地分离草莓+禾谷镰刀菌gdm3.507未知-鹰嘴豆枯萎镰刀菌cgmcc3.17699未知-腐皮镰刀菌当地分离草莓-腐皮镰刀菌当地分离马铃薯-链格孢菌当地分离马铃薯-恶疫霉菌当地分离草莓-lamp反应结束后，根据反应液颜色变化进行判定，拍照结果如图1所示，igs引物在利用lamp技术快速检测草莓尖刀镰孢菌的特异性对比图，图1中，从左至右依次为草莓尖刀镰孢菌(阳性)、马铃薯链格孢菌、草莓腐皮镰刀菌、禾谷镰刀菌、恶疫霉菌、鹰嘴豆枯萎镰刀菌，马铃薯腐皮镰刀菌。应用本发明方法，针对不同样品菌株提取dna为模板，利用igs引物分别进行单一引物lamp扩增，65℃，反应45min可成功使尖孢镰刀菌lamp反应液颜色呈荧光绿色，而其它反应液呈橘黄色，凝胶电泳结果与显色反应一致，说明该检测方法适合草莓尖孢镰刀菌特异扩增。实施例5：its引物在利用lamp技术检测草莓炭疽菌中的特异性试验本实施例应用已知茶树炭疽菌侵染引起的草莓植株病样组织，马铃薯病样组织中分离出的经鉴定致病菌，以及病原菌菌株为材料，见表2，以茶树炭疽菌和胶孢炭疽基因组dna为阳性。按照实施例3、4(单一lamp反应体系和反应条件)的步骤进行。表2：试验中所用菌株名称及来源菌株来源或菌株编号宿主结果茶树炭疽菌当地分离草莓+胶孢炭疽当地分离草莓+禾谷镰刀菌gdm3.507未知-尖孢镰刀菌当地分离草莓-腐皮镰刀菌当地分离马铃薯-链格孢菌当地分离马铃薯-恶疫霉菌当地分离草莓-lamp反应结束后，根据反应液颜色变化进行判定，并拍照结果如图2its引物在利用lamp技术快速检测草莓炭疽菌的特异性对比图所示，图2中，从左至右依次为草莓茶树炭疽菌(阳性)、胶孢炭疽菌(阳性)、马铃薯链格孢菌、马铃薯腐皮镰刀菌、禾谷镰刀菌、恶疫霉、草莓尖孢镰刀菌，阴性对照，应用本发明方法，对不同样品菌株提取dna为模板，利用its引物分别进行单一引物lamp扩增，65℃，反应45min可成功使胶孢炭疽与阳性对照lamp反应液颜色呈荧光绿色，而其它反应液和阴性对照呈橘黄色，说明该检测方法适合炭疽菌属特异扩增。实施例6：利用两种靶标基因its引物和igs引物对不同菌株样品的双重lamp检测试验(1)试验设计本实施例以已知茶树炭疽菌和尖孢镰刀菌侵染引起的草莓植株病样组织为材料，分别以尖孢镰刀菌和茶树炭疽菌基因组dna为阳性；模板dna获得同实例3、4(dna模板获取)；配制lamp反应混合物，分别在含有尖孢镰刀菌和茶树炭疽菌基因组dna的反应管中均加入its引物和igs引物，引物成分和浓度不同，lamp扩增尖孢镰刀菌igs引物：20μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，40μmol/l的fip和bip引物各1μl，40μmol/l环引物loop0.5μl；lamp扩增炭疽菌its引物：10μmol/l的f3及b3引物各0.25μl，20μmol/l的fip和bip引物各1μl，10μmol/l环引物loop各1μl，其它成分和步骤同实例3、4(双重lamp反应体系和反应条件)。(2)结果分析lamp反应结束后，根据反应液颜色变化进行判定，并拍照结果如图3所示，图3中3a,3b，its引物和igs引物对不同菌株样品的双重lamp检测对比图，图3中，a：以炭疽菌dna为模板的双重lamp检测；b：以镰刀菌dna为模板的双重lamp检测，应用本发明方法，对已知含有尖孢镰刀菌的dna加入两种引物进行双重lamp扩增，若反应液呈荧光绿色，则说明反应体系中igs引物与模板结合；对已知含有炭疽菌的dna加入两种引物进行双重lamp扩增，若反应液呈荧光绿色，则说明its引物与模板结合，该检测方法适合同时检测炭疽菌属和尖孢镰刀菌病样组织。对于未知病原菌，加入以上两种lamp引物，若反应液呈荧光绿色，说明含有尖孢镰刀菌或者炭疽菌其中之一，要验证具体是何种病原菌感染，可进一步分别做单一lamp鉴定。双重lamp检测方法缩短了鉴定时间，同时也可以排除草莓是否感染了两大病害，为基层工作者提供切实可行的检测手段。实施例7：本发明lamp技术与pcr技术检测草莓尖刀镰孢菌的灵敏度对比试验(1)试验设计本实施例在实施例3、4(lamp检测试剂盒和igs引物在利用lamp技术检测草莓尖刀镰孢菌中的特异性试验)的基础上，对特有基因igs引物在利用lamp技术检测草莓尖刀镰孢菌的灵敏度与pcr技术进行对比。本实施例选择已知尖孢镰刀菌侵染引起的草莓植株病样组织为材料；模板dna获得同实例3、4(dna模板的获取)；同实施例3、4(单一lamp反应体系)配制(lamp)反应混合物，按照常规方法配制pcr反应混合物，具体包括1μl的不同浓度的待检病样品悬浮液原液和稀释液，10×pcrbuffer，0.2mmol/ldntps，1.2mmol/lmgcl2，taqpolymerase，its上下游引物(10μmol/l)各1μl，补充去离子水至25μl；将pcr管放入pcr仪，设置反应参数：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸10min。取5μlpcr反应产物，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增效果。(2)试验结果与分析lamp反应结束后，根据反应液颜色变化进行判定，并拍照结果如图4所示，图中4a，特有靶标基因在利用lamp技术与pcr技术检测草莓尖刀镰孢菌和炭疽菌中的灵敏度对比图，图4中，a：利用lamp技术快速检测草莓尖刀镰孢菌的灵敏度测试结果：从右至左依次10倍稀释，浓度分别为10ng/μl～10×10-6ng/μl，应用本发明方法，以1μl尖孢镰刀菌引起的草莓病样茎基部组织悬浮液为模板，可成功使各浓度lamp反应液10ng/μl(原液)～10×10-5ng/μl稀释液颜色呈荧光绿色，而10-6稀释液呈橘黄色，说明该检测方法可以检测浓度低至0.1pg级。pcr扩增反应结束后，根据电泳条带大小进行判定，并拍照结果如图4所示，图中4b，特有靶标基因在利用lamp技术与pcr技术检测草莓尖刀镰孢菌和炭疽菌中的灵敏度对比图b：利用普通pcr技术检测草莓尖刀镰孢菌的灵敏度测试结果：从右至左依次10倍稀释，浓度分别为10ng/μl～10×10-6ng/μl，应用pcr技术，以1μl尖孢镰刀菌引起的草莓病样茎基部组织悬浮液为模板，仅使原液10ng/μl，10×10-1ng/μl，10×10-2ng/μl浓度的pcr反应液扩增出大小合适的特异目的条带，10×10-3ng/μl和10×10-4ng/μl浓度扩增出非特异条带，10×10-5ng/μl和10×10-6ng/μl浓度均没有扩增出条带，说明该检测方法只可以检测浓度低至0.1ng级。综合上述分析可知，lamp技术与pcr技术在检测草莓尖刀镰孢菌的浓度相比，pcr技术检测浓度仅仅到0.1ng级，而本发明以igs为引物利用lamp技术检测浓度可以降低至0.1pg级，灵敏度提高了1000倍，表明本发明特有引物igs基因在利用lamp技术检测草莓尖刀镰孢菌中灵敏度显著提高。上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。序列表<110>新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所<120>特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>40<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>1gcaacctggcgaggacgaaacactgtcgaaacgagatgcg40<210>2<211>42<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>2aattcgagtttcgtcgccgacagccggagagagatttgccta42<210>3<211>20<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>3gcggaatgggaagtcgattc20<210>4<211>19<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>4tcacgaccaccagacaagt19<210>5<211>25<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>5gttttctgtgggtgtatggtaggta25<210>6<211>38<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>6ctacgcaaaggaggctccgggggccctacagctgatgt38<210>7<211>42<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>7ttacgtctcgcactgggatccgtccgaggtcaacctttggaa42<210>8<211>20<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>8tcaagctctgcttggtgttg20<210>9<211>20<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>9gttcagcgggtattcctacc20<210>10<211>19<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>10gccactacctttgagggcc19<210>11<211>20<212>dna<213>fragaria×ananassaduch.<400>11gagggactcttgccgtaaaa20当前第1页12