GABRD基因在筛选抗海洛因复吸药物中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学的
技术领域：
，尤其涉及一种gabrd基因以及该基因作为药物靶标在筛选抗海洛因复吸药物中的应用。
背景技术：
：海洛因成瘾是一种慢性复发性脑疾病，有着巨大的社会危害。滥用影响脑部诸多神经系统，尤其是与奖赏、动机、学习记忆和自控等行为有关的神经环路，导致强烈、不可控的药物渴求和与之相关的强迫性觅药行为。参与生物体多种生理功能，其功能失调可能与精神分裂症、抑郁症、癫痫、痴呆及其他记忆障碍等神经精神疾病有关。目前越来越多的研究表明，gaba能系统在药物成瘾和复吸过程中有重要作用，其不仅可以调节多巴胺系统还可以调节谷氨酸能系统功能。已发现γ-氨基丁酸a型δ亚基受体(gabrd)参与可卡因及酒精成瘾，但是，在目前的国内外尚未见到该基因在海洛因成瘾和复吸中的相关研究报道。技术实现要素：本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种gabrd基因作为药物靶标在筛选抗海洛因复吸药物中的应用。本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状提供一种gabrd基因过表达病毒载体的构建在筛选抗海洛因复吸药物中的应用。本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术的现状提供一种gabrd基因干扰腺相关病毒载体的构建在筛选抗海洛因复吸药物中的应用。本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：该gabrd基因作为药物靶标在筛选抗海洛因复吸药物中的应用。为解决第二个技术问题，所采用的技术方案为：该gabrd基因过表达病毒载体，其特征在于：以gv467载体为基础进行构建，并整合有gabrd过表达基因，得到gabrd基因过表达病毒载体。进一步地，所述gabrd过表达基因如seqidno.1。进一步地，所述gabrd过表达基因的上下游引物序列分别为：gabrd-p1：ggaggtagtggaatggatcccgccaccatggacgttctgggctggctgc；gabrd-p2：tcaccatggtggcgggatccatggtatacgccgcccagtag。为解决第三个技术问题，所采用的技术方案为：该gabrd基因干扰腺相关病毒载体，其特征在于：以avv病毒颗粒为基础进行构建，并整合有gabrd干扰基因，得到gabrd基因干扰腺相关病毒载体。进一步地，所述gabrd干扰基因如seqidno.2。进一步地，所述gabrd干扰腺相关病毒载体的构建所需的双链小干扰rna如seqidno.3。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明为治疗海洛因成瘾的抗复吸，减少毒品心理渴求提供了一种有效治疗的靶点，gabrd基因在海洛因复吸模型中有显著降低海洛因复吸行为的作用，并且以gabrd基因为靶标，在nac脑区过表达该基因后能显著降低海洛因诱导的复吸行为恢复，相应地敲减该基因后则能显著增加线索诱导的或海洛因引燃的复吸行为，这些结果均揭示了gabrd基因是一个主要的治疗药物靶点，有望抑制海洛因停药后的复吸。附图说明图1为本发明的gabrd基因在三组中mrna表达情况；图2a为本发明的gabrd蛋白在三组中蛋白表达情况；图2b为本发明的gabrd蛋白在三组中蛋白的wb检测结果图；图3a为本发明的gabrd过表达对线索诱导的复吸行为的影响；图3b为本发明的gabrd过表达对海洛因引燃的复吸行为的影响；图4a为本发明的nac脑区注射过表达gabrd病毒载体后nac脑区的gabrd蛋白表达情况；图4b为本发明的nac脑区注射过表达gabrd病毒载体后nac脑区的gabrd蛋白gabrd过表达的wb检测结果；图5a为本发明的nac脑区敲减gabrd能显著增强线索诱导的复吸行为的恢复的结果图；图5b为本发明的nac脑区敲减gabrd能显著增强海洛因引燃的复吸行为的恢复的结果图；图6a为本发明的nac脑区注射敲减gabrd病毒载体后nac脑区的gabrd蛋白表达水平的结果图；图6b为本发明的nac脑区注射敲减gabrd病毒载体后nac脑区的gabrd蛋白表达水平的wb检测结果；图7为本发明的实施例2中的载体图谱图；图8为本发明的实施例2中gv467载体的电泳结果图；图9为本发明的实施例2中gabrd目的基因片段的电泳结果图；图10为本发明的实施例2中菌落pcr鉴定的电泳结果图(电泳图说明：1#：阴性对照(ddh2o)；2#：阴性对照(空载自连对照组)；3#：阳性对照(gapdh)；4#：marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；5-12#：1-8号转化子)；图11-a为本发明的实施例3中基因腺病毒感染293t细胞的荧光照片；图11-b为本发明的实施例3中的基因腺病毒感染293t细胞于普通光源下的细胞图片；图11-c为本发明的实施例3中获得稳定转染的293t细胞株的荧光照片；图11-d为本发明的实施例3中获得稳定转染的293t细胞株于普通光源下的细胞图片；图12为本发明的实施例4中rna干扰腺相关病毒载体的构建体构建的流程图；图13为本发明的实施例5中shrna腺相关病毒克隆构建的载体图；图14为本发明的实施例4中gabrd过表达病毒滴度检测的扩增曲线图；图15为本发明的实施例4中gabrd过表达病毒滴度检测时按照标准品浓度的对数值和ct平均值得到标准曲线图；图16为本发明的实施例5中质粒作为标准品设立标准曲线得到的扩增曲线图。具体实施方式以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。实施例1建立稳定的大鼠海洛因自身给药模型经典的大鼠海洛因自身给药模型可以很好地模拟临床上吸毒患者的海洛因吸食行为，大鼠经过训练可以产生对海洛因的自我给药，同时训练过程中不断上升的对海洛因的行为反应率和给药量可以反映吸毒患者从初始目标导向性用药到强迫性习惯化用药的行为发展过程。我们采用如下方法来建立大鼠的自身给药模型：首先，sd大鼠进行颈静脉插管手术，在右颈静脉插入一段pe管，并经背部穿出体外，手术后抗菌和恢复一周以上。随后，大鼠分别在32个自身给药操作笼内进行训练，每次训练前连通大鼠背部的pe管与操作笼内的海洛因注射系统；操作笼内设左右两个鼻触器，其中一个为有效鼻触器，大鼠触鼻一下有效鼻触器将获得一针海洛因注射，同时操作笼内的笼灯亮起(作为一种伴药的线索)，计算机记录；另外一个为无效鼻触器，大鼠触鼻一下无效鼻触器没有任何海洛因注射和灯光，仅计算机记录。两次海洛因注射之间有20秒的不应期，期间触鼻有效鼻触器将不会有海洛因注射和灯光，但记录触碰次数，每天的海洛因注射针数限制为50针(防止过量注射死亡)。操作笼采用大型服务器的计算机同时控制，自身给药训练软件为自主编写的obsmv5.0，训练程序为固定比率的fr1，即大鼠触鼻一次有效鼻触器获得一针海洛因注射。大鼠经过14天，每天4小时的训练后，有效触鼻反应率和注射量均明显上升，大鼠有效鼻触数稳定在40次以上，且最后3天有效鼻触数上下浮动不超过10％，则表明成功建立稳定的海洛因自身给药模型，已符合后续实验的要求。实施例2过表达载体的构建本发明通过目的基因过表达和基因敲除两个技术手段，来研究gabrd基因在对海洛因成瘾大鼠复吸行为的影响。目的基因过表达是研究基因功能常用的手段之一，将目的基因通过转染(包括电转染、脂质体转染等)、显微注射或病毒感染等方法将外源基因导入细胞内，从而建立目的基因过表达的稳定细胞系，可广泛应用于生物学研究，而rnai技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。构建gabrd基因过表达病毒质粒，转染293t细胞，建立稳定转染细胞系。首先采用pcr技术扩增目的基因，并将扩增产物插入载体gv467质粒上，并对阳性克隆进行基因测序鉴定。重组质粒包装293t细胞，转染24小时后，用荧光显微镜观察标签gfp绿色荧光蛋白的表达，并用westblotting法测定目的蛋白的表达.结果。成功构建了过表达质粒，获得稳定转染的293t细胞株。其中过表达载体构建过程如下：利用限制性内切酶消化获得线性化载体。pcr扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别不线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆进行pcr鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒，用于后续实验。1.目的基因及工具载体信息1.1目的基因：symbol：gabrdaccession：nm-017289organism：ratcdslength：1638bp1.2工具载体:载体名称：gv467元件顺序：cmv-betaglobin-mcs-egfp-3flag-sv40polya克隆位点：bamhi/bamhi对照编号：con299载体图谱如图7所示。2.载体酶切根据如下列表，配制50μl酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃1反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。gv467载体电泳结果图：(bamhi/bamhi酶切示意，购自上海吉凯基因化学技术有限公司)，电泳结构图如图8所示；1#(泳道1):10kbmarker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)2#(泳道2):载体酶切产物3#(泳道3):未酶切载体。3.gabrd目的基因片段的获取3.1扩增引物(pcr产物大小：1393bp)3.2pcr扩增目的基因片段配制如下反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于pcr仪中进行反应。反应体系：反应条件：3.3gabrd目的基因的pcr扩增结果(pcr产物的纯化)，如图9所示；从图9的电泳图说明如下：marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1的条带只有一条，说明提取的效果很好，没有开环和线性dna的结果。4.pcr产物与载体进行交换于冰水浴中配制如下反应体系。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。反应体系：#说明：a)阳性对照加入的纯化的pcr产物为gapdh基因(带有同样的交换臂)5.转化将10μl交换反应产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min；42℃热激90s，冰水浴孵育2min；加入500μllb培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。6.菌落pcr鉴定6.1鉴定引物6.2pcr鉴定配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μl鉴定体系中，吹打混匀，置于pcr仪中进行反应。鉴定反应体系：pcr反应条件：6.3鉴定结果阳性转化子pcr产物大小：886bp，电泳结果图见图10，提取质粒只有一条带，说明提取的效果很好，没有开环和线性dna的结果。7.测序将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的lb液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果的目的基因序列进行比对分析，比对结果如下：cgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgggattcgaacatcgattgaattcggtaccggaattcggaactggaggtggaggtagtggaatggatcccgccaccatggacgttctgggctggctgctgctgccgctccttctgctgtgcacgcagccgcaccatggcgccagagcaatgaatgacattggggactacgtgggctccaacctggagatatcctggctccccaacctggatggactaatggagggctacgcccgaaacttccgaccaggcattggaggtcctccagtgaatgtggcgcttgccctagaggtggccagcattgaccacatctcagaagcaaatatggaatacaccatgacagtgttcctgcaccagagctggcgagacagcaggctgtcctacaaccataccaacgagaccctgggcctggatagccgcttcgtggacaagctgtggctccctgacaccttcattgtgaatgccaagtctgcctggttccatgatgtgaccgtggaaaacaagcttatccgcctacagcccgacggtgtgattttatacagcatccgcatcacctccacagtggcctgtgacatggaccttgccaagtaccccatggacgagcaggagtgcatgctggacctggagagctatggctactcttctgaggacattgtctattattggtcagaaaaccaggagcagatccacgggctggacaggctgcaactggcccagttcactatcaccagttaccgcttcaccacggagctgatgaacttcaaatcagctggccagttccctcgactcagcttacacttccagcttcggaggaaccggggtgtctacatcatccagtcttacatgccctctgtcctcctggttgccatgtcctgggtctccttctggattagccaagcagcagtgcctgccagagtatctctaggcatcaccactgtgctgacaatgaccacactcatggttagtgcccgctcctccctcccgcgggcttctgctatcaaggctctggatgtgtatttctggatctgctatgtcttcgtgtttgctgccctggtggagtatgcatttgcccacttcaatgctgactacaggaagaaacggaaagccaaggtcaaggtcacgaagccaagggcagagatggacgtgaggaacgccattgtcctcttctccctctctgctgctggggtcagccaggagttggctatctcccgccgtcaaggccgggtccctgggaacctcatgggttcctataggtctgtagaagtggaggcaaagaaggagggggggtcccgcccaggaggcccaggaggcatccgttccagactcaaacccatcgatgcagacaccatcgacatctatgcccgcgctgtgttcccggcagcctttgcagcagtcaacatcatctactgggcggcgtataccatggatcccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaag比对结果说明：测序结果与目标序列完全一致。8.测序正确的摇菌提质粒(即质粒抽提)将步骤7中测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的lb液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下：①.收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；②弃上清，加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；③加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶k，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；④加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；⑤10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5mlep管；⑥12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；⑦加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；⑧在超净台中将回收柱转移至新的1.5mlep管中，静置10-20min，自然晾干；⑨往回收柱中加入95μlnuclease-freewater，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。实施例3质粒转染细胞实验一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞即293t细胞，质粒转染前一天将293t细胞分入24-well培养板培养，转染当天按实验设计组别加入质粒进行目的细胞的转染实验。转染24h后荧光显微镜下观察gfp表达情况，荧光率达80％以上，转染48h后待细胞长满培养板收集细胞检测。二、实验步骤：①.准备目的细胞(1)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；(2)完全解冻后，1300rpm，离心3min，75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；(3)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml完全培养基的6-cmdish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％co2培养箱；(4)更换一次培养液后再继续培养；(5)生长90％汇合的细胞进行传代培养。胰酶消化后完全培养基制成细胞悬液分至两个新的6-cmdish中，补足完全培养基至4ml，继续培养。②目的细胞质粒转染(1)对数生长期的细胞制成细胞悬液，计数，接种接种于24-well培养板中(细胞数约为2×104，具体根据细胞形态大小而定)，37℃、5％co2培养箱培养至细胞融合度达到约80％；(2)根据细胞转染预实验和invitrogenlipofectamine2000转染试剂使用说明书设计，加入适宜量的质粒和转染试剂；(3)4-6h后观察细胞状态，更换为新鲜的完全培养基，转染24-48h后观察质粒上荧光标记基因的表达情况，荧光率大于80％，拍完荧光后补加500μl正常培养基，待长满后收集细胞用于rna提取或蛋白质检测；用荧光显微镜观察标签gfp绿色荧光蛋白的表达：见下图所示成功构建了过表达质粒，获得稳定转染的293t细胞株；如果目的基因携带gfp荧光标签，可以在感染病毒后96h开始在显微镜下观察荧光表达(具体见图11-a、11-b、11-c、11-d)，图11-a为目的基因腺病毒感染293t细胞的荧光照片；图11-b为目的基因腺病毒感染293t细胞于普通光源下的细胞图片；图11-c为获得稳定转染的293t细胞株的荧光照片；图11-d为获得稳定转染的293t细胞株于普通光源下的细胞图片，从图中11-c和11-d可以看出能获得稳定转染的293t细胞株。实施例4gabrd过表达病毒滴度检测本申请实验中，用质粒作为标准品设立标准曲线，待测样品与标准曲线比较后，得到待测样品的滴度。4.1扩增曲线，参考图14；4.11实验步骤1)每一个样品准备4份90μl水，装在ep管中。取10ul样品加入到第一份水中，混匀并命名为-1，然后从中取出10μl加入到第二份水中，命名为-2，依次类推。最后得到8个稀释度的样品，取后5份作为模板进入定量pcr；2)每个样品取10ul加入到40μl水中，混匀并命名为-2，准备4份90μl水，装在ep管中，然后从中取出10μl加入到90μl水中，命名为-3，依次类推。不同在于4个稀释度，取后3个进入定量pcr；3)测算所需要的反应孔数，每个反应中2xsybrgreenmix为10μl，上下游引物各0.5μl，rox参比染料0.2μl，加水补充到15μl。每20个反应多准备一个反应体系，以避免试剂不足。4)将配好的反应体系加入到96孔反应板中，每孔15μl。每个样品加入5μl，设置复孔。5)pcr反应按照sybrgreen试剂盒说明进行；6)得到ct值数据后，按照标准品浓度的对数值和ct平均值得到标准曲线。其他样品的浓度可以根据标准曲线算出；7)待测样品浓度最终值由测定值除以稀释度并乘2得到，此处乘2是因为标准品是双链的，而aav病毒颗粒是单链的。8)将不同稀释度病毒测定得到的滴度加以平均，即为病毒的最终浓度。4.12q－pcr原始数据4.13标准曲线拷贝数standard-2standard-3standard-4standard-5standard-6copies/ml2.58e+112.58e+102.58e+092.58e+082.58e+074.14标准曲线，参考图15；4.15标准曲线将目的样品的ct值代入公式，得到待测样品滴度，并乘以稀释倍数得到原始样品滴度，将四个组的滴度数值加以平均，得到滴度均值，即为样品的最终滴度数据。实施例5rna干扰腺相关病毒载体的构建5.1材料准备所需材料为：2xsybrgreenmastermixture；q-zfcas9定量pcr引物；zfcas9质粒标准品；dnase/rnase-freewater；96孔定量pcr板；塑料封口贴膜；dnase/rnase-free枪头；ep管；通过合成含干扰序列的双链dnaoligo，通过其两端含酶切位点直接连入酶切后rna干扰腺相关病毒载体上；将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行pcr鉴定，pcr鉴定阳性菌落再进行测序鉴定，所鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因rna干扰腺相关病毒载体(流程见图12)。5.2shrna腺相关病毒克隆构建部分sirna设计：targetseqgc％ggacgtgaggaacgccattgt57.14％目的载体载体名称：cv272元件顺序：hsyn-egfp-mir30对照编号：con400对照插入序列：无载体图谱(见图13)5.3合成oligo信息表格序列转为文本对应序列如下：gabrd-rnai(74940-2)ctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagacgtgaggaacgccattgtctagtgaagccacagatgtagacaatggcgttcctcacgtcctgcctactgcctcgcaattg将上述序列拆分为两条链，酶切位点上游加上保护碱基，引物自身互补扩增后酶切连接，分成两条链分别为：gabrd-rnai(74940)-a：accgctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagacgtgaggaacgccattgtctagtgaagccacaggabrd-rnai(74940)-b：accgcaattgcgaggcagtaggcaggacgtgaggaacgccattgtctacatctgtggcttcactagacaat测序结果文件：gabrd-rnai(74940-2)：>psc74940-2-egfp-c-f_d05.ab1nnnnngnnagnggnactctcggcatggacgagctgtacaagtagcggccgcaagccttgttaagtgctcgcttcggcagcacatatactatgttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcttcaggttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagacgtgaggaacgccattgtctagtgaagccacagatgtagacaatggcgttcctcacgtcctgcctactgcctcgcaattcaaggggctactttaggagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttttttcaattggaagactaatgcgtttaaacacgcggcgacgcgaagctttaaaccggttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttgggggcattgccaccacctgtcagctcctttccggaactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctatgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttcgcgtcttcgcttcgccctcagacgagtcggatctccnttgggccgcctcccccgcgagctttaaattagctgaagggabrd-rnai质粒(74940-2):ctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagacgtgaggaacgccattgtctagtgaagccacagatgtagacaatggcgttcctcacgtcctgcctactgcctcgcaattg比对结果说明：测序结果与目标序列完全一致5.4病毒包装5.5过表达病毒滴度检测方法：real-timepcr(定量pcr法)具体方法参考实施例4中的gabrd过表达病毒滴度检测本申请中，用质粒作为标准品设立标准曲线，待测样品与标准曲线比较后，得到待测样品的滴度。5.51扩增曲线参考图16；5.52q－pcr原始数据5.53标准曲线拷贝数standard-3standard-4standard-5standard-6copies/ml2.58e+102.58e+092.58e+082.58e+075.54标准曲线参考图16；5.55滴度计算将目的样品的ct值代入公式y＝3.289*log(x)+38.71，得到待测样品滴度，并乘以稀释倍数得到原始样品滴度，将四个组的滴度数值加以平均，得到滴度均值，即为样品的最终滴度数据。(注:红色斜线部分为实验误差较大的数据，不参与平均滴度的计算。)5.56材料准备2xsybrgreenmastermixture；q-zfcas9定量pcr引物；zfcas9质粒标准品；dnase/rnase-freewater；96孔定量pcr板；塑料封口贴膜；dnase/rnase-free枪头；ep管5.57仪器准备定量pcr仪5.58实验步骤1)每一个样品准备4份90μl水，装在ep管中。取10ul样品加入到第一份水中，混匀并命名为-1，然后从中取出10μl加入到第二份水中，命名为-2，依次类推。最后得到8个稀释度的样品，取后5份作为模板进入定量pcr；2)每个样品取10ul加入到40μl水中，混匀并命名为-2，准备4份90μl水，装在ep管中，然后从中取出10μl加入到90μl水中，命名为-3，依次类推。不同在于4个稀释度，取后3个进入定量pcr；3)测算所需要的反应孔数，每个反应中2xsybrgreenmix为10μl，上下游引物各0.5μl，rox参比染料0.2μl，加水补充到15μl。每20个反应多准备一个反应体系，以避免试剂不足。4)将配好的反应体系加入到96孔反应板中，每孔15μl。每个样品加入5μl，设置复孔。5)pcr反应按照sybrgreen试剂盒说明进行；6)得到ct值数据后，按照标准品浓度的对数值和ct平均值得到标准曲线。其他样品的浓度可以根据标准曲线算出；7)待测样品浓度最终值由测定值除以稀释度并乘2得到，此处乘2是因为标准品是双链的，而aav病毒颗粒是单链的。8)将不同稀释度病毒测定得到的滴度加以平均，即为病毒的最终浓度。实施例6海洛因自身给药及消退后复吸大鼠的nac脑区中gabrd基因mrna和蛋白水平的变化首先建立稳定的大鼠海洛因自身给药模型，分别设立海洛因成瘾组(heroin)和海洛因自身给药后消退14天条件性线索诱导复吸组(reinstatement)，同时设立生理盐水自身给药对照组(control)。消退训练时，将大鼠放到训练笼中2小时，无线索及灯光等的提示，鼻触均无程序性后果即无海洛因注射。消退成功的标准是达到训练(药物维持)有效鼻触的10％以内。消退完成后进行复吸行为测试：复吸行为测试时，大鼠独立放置于自身给药训练笼中，所处的环境与海洛因训练过程一样，但触碰有效鼻触时记录次数，笼灯亮，注射泵空打，不进行海洛因注射，每次复吸行为测试时间为2h。复吸测试完成后，大鼠立即处死取nac脑组织，用rt-pcr和wb方法分别检测各组间nac脑区gabrd的mrna和蛋白表达水平，采用方差分析，随后多重比较采用snk检验分析，结果显示组间mrna表达存在显著差异(f(2,11)＝4.307，p＝0.042，见图1)，其中成瘾组分别与对照组和复吸组相比，nac脑区gabrd的mrna表达均显著升高(p＝0.016，p＝0.047)。见而海洛因复吸模型大鼠中gabrd的mrna表达水平较对照正常组大鼠仍有升高趋势，但无显著性差异。wb检测表明三组间gabrd的蛋白表达存在显著性差异(f(2,3)＝12.508，p＝0.035)，多重比较显示成瘾组分别与对照组及海洛因复吸组相比之间均显著升高(p＝0.028，p＝0.019，见图2a和2b)。实施例7nac脑区过表达gabrd基因对海洛因自身给药大鼠消退后复吸行为恢复的影响。首先，大鼠进行自身给药训练14天成功建立稳定的海洛因自身给药模型，然后，模型大鼠进行消退训练，按照实验要求进行随机分组，分设两个组：gabrd过表达组、阴性病毒对照组。于消退第二天在大鼠nac脑区分别微注射gabrd过表达和阴性病毒对照的avv病毒载体。具体微注射过程如下：大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后，头顶部备皮，将大鼠固定于脑立体定位仪上，75％酒精消毒，用手术刀做一约3cm的纵向切口，用镊子充分暴露颅骨，棉球止血后确定前囟位置，根据《大鼠脑立体定位图谱》确定注射坐标位置，前囟：+1.6mm，旁开：±1.5mm，深度：-(7.0mm～7.5mm)，用签字笔标记，在标记处垂直打孔，用微量进样器抽取已备好的慢病毒溶液，微量进样器连接与微量注射泵，安装于大脑脑立体定位仪上，按照已经确定的坐标进行注射，其中每边在深度7.5mm和7.0mm各注射一针，两边共4个注射点，每点注射量为1ul，注射速度为：0.5ul/min，每针注射完毕后留针3min，以保证病毒充分注射到该位点。全部注射完毕后缝合皮肤，大腿肌肉注射青霉素(15000u)抗感染至少3天。消退14天后分别进行线索诱导的复吸行为测试以及海洛因引燃的复吸行为测试。统计学分析结果显示，在nac脑区过表达gabrd能显著减少海洛因引燃的复吸行为的恢复(f(1,14)＝8.83,p＝0.01，图3b)，但nac脑区过表达gabrd对线索诱导的海洛因复吸没有影响(f(1,14)＝0.083,p＝0.77，图3a)。最后，大鼠行为测试后立即处死取nac脑区组织，组织用于后续wb测试，统计分析结果显示，nac脑区注射过表达gabrd病毒载体后nac脑区的gabrd蛋白表达水平较阴性对照组显著升高(p＝0.038)，见图4a和4b。实施例8nac脑区敲减gabrd基因对海洛因自身给药大鼠消退后复吸行为恢复的影响。首先，大鼠进行自身给药训练14天成功建立稳定的海洛因自身给药模型，然后，模型大鼠进行消退训练，按照实验要求进行随机分组，分设两个组：gabrd敲减组、阴性病毒对照组。于消退第二天在大鼠nac脑区分别微注射gabrd敲减和阴性病毒对照的avv病毒载体。具体微注射过程如下：大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后，头顶部备皮，将大鼠固定于脑立体定位仪上，75％酒精消毒，用手术刀做一约3cm的纵向切口，用镊子充分暴露颅骨，棉球止血后确定前囟位置，根据《大鼠脑立体定位图谱》确定注射坐标位置，前囟：+1.6mm，旁开：±1.5mm，深度：-(7.0mm～7.5mm)，用签字笔标记，在标记处垂直打孔，用微量进样器抽取已备好的慢病毒溶液，微量进样器连接与微量注射泵，安装于大脑脑立体定位仪上，按照已经确定的坐标进行注射，其中每边在深度7.5mm和7.0mm各注射一针，两边共4个注射点，每点注射量为1ul，注射速度为：0.5ul/min，每针注射完毕后留针3min，以保证病毒充分注射到该位点。全部注射完毕后缝合皮肤，大腿肌肉注射青霉素(15000u)抗感染至少3天。消退14天后分别进行线索诱导的复吸行为测试以及海洛因引燃的复吸行为测试。统计学分析结果显示，在nac脑区敲减gabrd能显著增强线索诱导的或海洛因引燃的复吸行为的恢复(f(1,16)＝4.86,p＝0.04；f(1,16)＝14.33,p＝0.002，图5a和5b)。最后，大鼠行为测试后立即处死取nac脑区组织，组织用于后续wb测试，统计分析结果显示，nac脑区注射敲减gabrd病毒载体后nac脑区的gabrd蛋白表达水平较阴性对照组显著降低(p＝0.031)，见图6a和6b。序列表<110>宁波市微循环与莨菪类药研究所<120>gabrd基因在筛选抗海洛因复吸药物中的应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1558<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgggattcgaacatcgatt60gaattcggtaccggaattcggaactggaggtggaggtagtggaatggatcccgccaccat120ggacgttctgggctggctgctgctgccgctccttctgctgtgcacgcagccgcaccatgg180cgccagagcaatgaatgacattggggactacgtgggctccaacctggagatatcctggct240ccccaacctggatggactaatggagggctacgcccgaaacttccgaccaggcattggagg300tcctccagtgaatgtggcgcttgccctagaggtggccagcattgaccacatctcagaagc360aaatatggaatacaccatgacagtgttcctgcaccagagctggcgagacagcaggctgtc420ctacaaccataccaacgagaccctgggcctggatagccgcttcgtggacaagctgtggct480ccctgacaccttcattgtgaatgccaagtctgcctggttccatgatgtgaccgtggaaaa540caagcttatccgcctacagcccgacggtgtgattttatacagcatccgcatcacctccac600agtggcctgtgacatggaccttgccaagtaccccatggacgagcaggagtgcatgctgga660cctggagagctatggctactcttctgaggacattgtctattattggtcagaaaaccagga720gcagatccacgggctggacaggctgcaactggcccagttcactatcaccagttaccgctt780caccacggagctgatgaacttcaaatcagctggccagttccctcgactcagcttacactt840ccagcttcggaggaaccggggtgtctacatcatccagtcttacatgccctctgtcctcct900ggttgccatgtcctgggtctccttctggattagccaagcagcagtgcctgccagagtatc960tctaggcatcaccactgtgctgacaatgaccacactcatggttagtgcccgctcctccct1020cccgcgggcttctgctatcaaggctctggatgtgtatttctggatctgctatgtcttcgt1080gtttgctgccctggtggagtatgcatttgcccacttcaatgctgactacaggaagaaacg1140gaaagccaaggtcaaggtcacgaagccaagggcagagatggacgtgaggaacgccattgt1200cctcttctccctctctgctgctggggtcagccaggagttggctatctcccgccgtcaagg1260ccgggtccctgggaacctcatgggttcctataggtctgtagaagtggaggcaaagaagga1320gggggggtcccgcccaggaggcccaggaggcatccgttccagactcaaacccatcgatgc1380agacaccatcgacatctatgcccgcgctgtgttcccggcagcctttgcagcagtcaacat1440catctactgggcggcgtataccatggatcccgccaccatggtgagcaagggcgaggagct1500gttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaag1558<210>2<211>1085<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2abnnnnngnnagnggnactctcggcatggacgagctgtacaagtagcggccgcaagcctt60gttaagtgctcgcttcggcagcacatatactatgttgaatgaggcttcagtactttacag120aatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcttcaggttaacccaac180agaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagacgtgaggaacgccattgt240ctagtgaagccacagatgtagacaatggcgttcctcacgtcctgcctactgcctcgcaat300tcaaggggctactttaggagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctc360tttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttttttcaatt420ggaagactaatgcgtttaaacacgcggcgacgcgaagctttaaaccggttatcgataatc480aacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctcctt540ttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatgg600ctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggc660ccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggtt720gggggcattgccaccacctgtcagctcctttccggaactttcgctttccccctccctatt780gccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttg840ggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcc900tatgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaat960ccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttcgcgtcttcgct1020tcgccctcagacgagtcggatctccnttgggccgcctcccccgcgagctttaaattagct1080gaagg1085<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggacgtgaggaacgccattgt21当前第1页12