四氢异喹啉类衍生物的盐、其制备方法及其医药应用与流程

1.本发明涉及(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的可药用的盐的形式、其制备方法、包含该可药用的盐的药物组合物以及其作为治疗剂特别是作为血管紧张素ⅱ2型受体拮抗剂的用途。


背景技术：

[0002]
神经性疼痛是由神经系统出现原发性损伤或功能障碍引起的慢性疼痛疾病，按病变的部位可分为外周神经性疼痛和中枢神经性疼痛。外伤、炎症、感染或压迫等原因均可引起神经性疼痛，例如糖尿病性神经痛(dnp)、带状疱疹后遗神经痛(phn)、原发性神经病、继发性神经病、周围神经病、由机械性神经损伤或生化神经损伤引起的神经病疾病等。目前临床上用于治疗神经性疼痛的药物主要有抗癫痫药物、抗抑郁药物和麻醉性镇痛药，如加巴喷丁、普瑞巴林、三环类抗抑郁药等。但这些药物没有针对性，治疗效果非常有限，而且有严重的副作用，包括认知改变、镇静作用、恶心以及耐受性和依赖性，远未满足临床用药需求。因此，需要研究神经性疼痛的发病机制、找到药物作用明确的靶点，开发新型的能有效治疗神经性疼痛且不良反应少的药物。
[0003]
血管紧张素ⅱ受体是以血管紧张素ⅱ作为配体的g蛋白偶联受体，它是肾素-血管紧张素系统的重要组成部分。血管紧张素ⅱ受体主要亚型包括1型受体(at1r)和2型受体(at2r)。at1r和at2r仅有约30％的氨基酸序列相同，但血管紧张素ⅱ作为其主要配体，与二者有相近的亲和力。
[0004]
at1r是被研究得最清楚的血管紧张素受体。at1r受体激活可引起平滑肌收缩、醛固酮和加压素分泌、肾小管重吸收钠增加、中枢和外周交感神经激活以及心肌肥厚等，因此，在受体水平上拮抗血管紧张素ⅱ成为寻找新型降压药物的研究热点，并由此诞生一系列沙坦类降压药物。
[0005]
at2r在各种胚胎组织中大量表达，在成年正常组织中分布较少，但是在组织损伤后，其表达升高。at2r与血压调控、神经生长、疼痛控制和心肌再生相关，靶向at2r的药物可以改善心血管功能、缓解神经性疼痛等。由澳大利亚spinifex公司开发的化合物olodanrigan(ema401)是一种高选择性at2r拮抗剂，目前处于临床二期，该候选药物对糖尿病性神经痛、带状疱疹后遗神经痛等神经性疼痛具有良好的治疗效果，同时spinifex公司也在开发at2r拮抗剂ema-400。olodanrigan和ema-400均通过wo 93/23378制备而得，结构如下：
[0006][0007]
目前已经公开了一系列的at2r拮抗剂专利申请，其中包括wo2016113668、wo2015003223和wo2013110135等，at2r拮抗剂的研究和应用已取得一定的进展，但是提高的空间仍然巨大，仍有必要继续研究和开发新的at2r拮抗剂。


技术实现要素：

[0008]
本发明提供了一种(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(1m)可药用的盐、其制备方法、及包含该可药用的盐的药物组合物以及其作为治疗剂特别是作为血管紧张素ⅱ2型受体拮抗剂的用途。其中所述的可药用的盐为(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸与有机碱或无机碱形成的碱金属盐、钙盐或镁盐。
[0009]
该成盐形式具有优异的治疗原发性神经病、继发性神经病、周围神经病、由机械性神经损伤或生化神经损伤引起的神经病、带状疱疹后遗神经痛、糖尿病性神经痛或相关神经性疾病的活性，溶解度明显改善，在动物体内具有良好的药代动力学性质，毒性低，适用于制备治疗神经性疾病的制剂。
[0010][0011]
本发明所述的碱金属盐选自钠盐、钾盐或锂盐；优选为钠盐。
[0012]
本发明式(1m)化合物的典型的可药用的盐包括，但不限于：
[0013]
1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸碱加成盐采用如下方法：
[0029]
将(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸在与水混溶的有机溶剂中与金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐或碱金属醇盐进行反应，其中：
[0030]
所述的金属氢氧化物选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化镁，优选为氢氧化钠；
[0031]
所述碱金属碳酸盐选自碳酸钠或碳酸钾；
[0032]
所述碱金属碳酸氢盐选自碳酸氢钠或碳酸氢钾；
[0033]
所述碱金属醇盐选自甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、甲醇钾、乙醇钾或叔丁醇钾，优选为甲醇钠或乙醇钠。
具体实施方式
[0034]
以下实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围和精神实质。
[0035]
实施例
[0036]
实施例给出了式(1m)所表示的代表性化合物的制备及相关结构鉴定数据。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。1h nmr图谱是用bruker仪器(400mhz)测定而得，化学位移用ppm表示。使用四甲基硅烷内标准(0.00ppm)。1h nmr的表示方法：s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝变宽的，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为hz。
[0037]
质谱是用lc/ms仪测定得到，离子化方式可为esi或apci。
[0038]
薄层层析硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，薄层色谱法(tlc)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
[0039]
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
[0040]
在下列实施例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度，除非另有指明，各种起始原料和试剂来自市售或者是根据已知的方法合成，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用，除非另有指明，市售厂家包括但不限于aldrich chemical company，abcr gmbh&co.kg，acros organics，广赞化工科技有限公司和景颜化工科技有限公司等处购买。
[0041]
cdcl3：氘代氯仿。
[0042]
dmso-d6：氘代二甲基亚砜。
[0043]
实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。
[0044]
对化合物进行纯化，采用硅胶柱层析洗脱剂体系和薄层色谱法，其中洗脱剂体系选自：a：石油醚和乙酸乙酯体系；b：二氯甲烷和甲醇体系；c：二氯甲烷和乙酸乙酯；其中溶剂的体积比根据化合物的极性不同而不同，也可以加入少量的酸性或碱性试剂进行调节，如醋酸或三乙胺等。
[0045]
实施例1
[0046]
(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸钠
[0047][0048]
第一步
[0049]
(z)-3-(2-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙烯酸甲酯
[0050]
将(
±
)-boc-a-膦酰基甘氨酸三甲酯1b(9.8g,33mmol)和四甲基胍(4.0g,34.4mmol)溶于100ml四氢呋喃中，将反应液降至0℃，加入2-(苄氧基)-3-甲氧基苯甲醛1a(7.0g,28.7mmol)的四氢呋喃溶液(5ml)，室温下反应过夜。反应结束后，减压浓缩，加入乙酸乙酯(40ml)溶解残留物，依次以10％柠檬酸溶液(30ml)和饱和食盐水(30ml)洗涤，以无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到的残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到(z)-3-(2-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙烯酸甲酯1c(9.5g,白色固体)，产率：80％ms m/z(esi)：314.0[m-100]
[0051]
第二步
[0052]
(s)-3-(2-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸甲酯
[0053]
将(z)-3-(2-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙烯酸甲酯1c(5.0g,12.0mmol)和(r)-n-二苯基膦-n-甲基-(s)-2-(二苯基膦)二茂铁基乙胺(90mg,0.06mmol)和二(1,5-环辛二烯)四氟硼酸铑(i)(100mg,0.024mmol)溶于50ml甲醇中，置换
6.86(m,3h),5.19(dd,j＝6.4,2.4hz,1h),5.05(d,j＝10.8hz,1h),4.95(d,j＝11.2hz,1h),4.90(d,j＝15.6hz,1h),4.76(d,j＝15.2hz,1h),3.89(s,3h),3.66-3.61(m,4h),2.94(dd,j＝16.4,6.4hz,1h).
[0070]
第六步
[0071]
(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-5-羟基-6-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯
[0072]
将(s)-5-(苄氧基)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯1h(600mg,1.3mmol)和10％钯碳(300mg,50％w)溶于10ml甲醇中，插氢气球，置换氢气4次，室温下反应过夜。反应结束后，用硅藻土过滤反应液，依次以乙酸乙酯和甲醇(v:v＝1:1)的混合溶剂(100ml
×
3)、二氯甲烷(100ml
×
3)洗涤硅藻土，将滤液减压浓缩，得到粗品(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-5-羟基-6-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯1i(500mg)，产率：100％。ms m/z(esi)：372.9[m+1]
[0073]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.86(br,1h),7.50(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),7.35(dd,j＝8.6,5.4hz,1h),7.10-7.04(m,1h),6.88(d,j＝8.4hz,1h),6.74(d,j＝8.4hz,1h),5.25(dd,j＝6.4,2.4hz,1h),4.81(d,j＝15.2hz,1h),4.63(d,j＝15.6hz,1h),3.79(s,3h),3.59(s,3h),3.46(dd,j＝16.2,1.8hz,1h),3.04(dd,j＝16.8,6.4hz,1h).
[0074]
第七步
[0075]
(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯
[0076]
将2-(氯甲基)-5-甲氧基吡啶盐酸盐1j(113mg,0.72mmol)、碳酸钾(149mg,1.08mmol)和(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-5-羟基-6-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯1i(100mg,0.27mmol)依次溶于6mln,n-二甲基甲酰胺中，70℃下反应6小时。反应结束后，冷却至室温，加入100ml乙酸乙酯和50ml水，分液，收集有机相，水相以乙酸乙酯(50ml
×
2)萃取，合并有机相，以饱和盐水(50ml
×
2)洗涤，以无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到粗品(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯1k(133mg)，产率：100％。粗品可进一步通过柱层析(洗脱剂：b体系)进一步分离纯化用于表征。
[0077]
ms m/z(esi)：493.9[m+1]
[0078]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.30(d,j＝2.4hz,1h),7.59(d,j＝8.8hz,1h),7.32-7.29(m,2h),7.07(dd,j＝7.8,2.2hz,1h),6.96-6.86(m,3h),5.21(dd,j＝6.4,2.4hz,1h),5.12(d,j＝12.0hz,1h),5.05(d,j＝11.6hz,1h),4.91(d,j＝15.6hz,1h),4.77(d,j＝15.6hz,1h),3.89(s,3h),3.87(s,3h),3.67(dd,j＝16.4,2.4hz,1h),3.63(s,3h),3.02(dd,j＝16.4,6.4hz,1h).
[0079]
第八步
[0080]
(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
[0081]
将(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯1k(133mg,0.27mmol)溶于4ml四氢呋喃中，加入3ml氯化钙(481.74mg,4.34mmol)的异丙醇和水(v:v＝2:1)的混合溶液，再加入3ml氢氧化钠溶
液(56mg,1.4mmol)，室温下反应过夜。反应结束后，加入80ml乙酸乙酯和100ml水，以1m稀盐酸调节反应液酸碱度至ph＝5～6，分液，收集有机相，水相以乙酸乙酯(50ml
×
2)萃取，合并有机相，有机相以饱和盐水(50ml
×
2)洗涤，以无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到的残留物用制备柱分离纯化，得到(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸1m(15mg)，产率：12％。
[0082]
ms m/z(esi)：479.9[m+1]
[0083]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.30(d,j＝2.8hz,1h),7.58(d,j＝8.4hz,1h),7.52-7.48(m,2h),7.34(dd,j＝8.6,5.0hz,1h),7.09-7.01(m,3h),5.07(dd,j＝6.2,2.6hz,1h),5.00(d,j＝11.2hz,1h),4.93(d,j＝11.2hz,1h),4.79(d,j＝15.6hz,1h),4.66(d,j＝15.2hz,1h),3.87(s,3h),3.83(s,3h),3.51(dd,j＝16.0,2.4hz,1h),3.00(dd,j＝16.2,6.6hz,1h).
[0084]
第九步
[0085]
(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸钠
[0086]
将(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸1m(0.40g，0.84mmol)加入6ml乙酸乙酯中，冰水浴搅拌条件下加入naoh/乙醇溶液(0.05g/ml，0.668ml)，使ph至7～8。将溶液浓缩至干，得到(s)-2-(6-氟苯并[d]噁唑-2-基)-6-甲氧基-5-((5-甲氧基吡啶-2-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸钠1(0.42g)，产率100％。
[0087]
ms m/z(esi)：480.2[m+1]
[0088]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.26(s,1h),7.62(d,j＝8.5hz,1h),7.46(d,j＝8.6hz,1h),7.38(d,j＝8.4hz,1h),7.24(dd,j＝8.2,4.9hz,1h),7.01-6.90(m,3h),4.93(s,2h),4.71(s,2h),4.66(d,j＝5.5hz,1h),3.84(s,3h),3.79(s,3h),3.67(d,j＝16.1hz,1h),2.78(dd,j＝16.1,6.4hz,1h).
[0089]
测试例：
[0090]
溶解度实验
[0091]
按照常规溶解度测定方法，测试本发明化合物在四种不同系统中的溶解度：磷酸盐缓冲液pbs(ph7.4)，甲醇，0.1％hcl及水中，结果如下表所示：
[0092][0093][0094]
结论：本发明化合物的钠盐(化合物1)与其游离酸(化合物1m)相比，溶解度明显改善。
[0095]
生物学评价
[0096]
测试例1本发明化合物对人源at2r配体结合拮抗活性的测试
[0097]
angiotensin ii type 2receptor(at2r)参与神经元分化与再生、细胞增殖与血管发生以及骨量的维持。at2r抑制剂可以用于疼痛和异常神经再生性疾病的治疗，抑制肿
瘤细胞的增殖以及增加骨量。以下方法通过at2配体结合试验，研究本发明化合物对于at2r的拮抗程度，
[0098]
1、试剂与耗材
[0099][0100][0101]
2、试剂配制
[0102]
(1)10mm人源血管紧张素ii(angiotensin ii human)：将10mg angiotensin ii human(纯度99.09％)溶解于0.947ml去离子水，分装后于-80℃保存；
[0103]
(2)化合物储液的制备
[0104]
根据标准的方法，所有化合物溶于二甲基亚砜，制备成10mm的储液。
[0105]
(3)tag-lite angiotensin receptor red agonist:8600nm储液，分装后于-80℃保存；
[0106]
(4)1x tag-lite buffer(tlb):将5x tlb用去离子水稀释至1x。
[0107]
3、实验步骤
[0108]
(1)配制适量的1x tlb，混匀待用；
[0109]
(2)测试化合物进行5倍稀释，共10个浓度梯度；
[0110]
(3)将步骤(2)中稀释好的化合物转移各160nl/孔至工作板中(3657,corning)，200g，室温，1分钟；
[0111]
(4)加入40μl 1x tlb至上述工作板中，室温条件下离心1分钟，200g(离心力)，于振荡器振荡15分钟混匀后，室温条件下离心1分钟待用，200g(化合物的工作浓度为4x)；
[0112]
(5)用1x tlb将tag-lite angiotensin receptor red agonist(8600nm储液)稀释至12nm待用；
[0113]
(6)取5ml 1x tlb于15ml离心管中；
[0114]
(7)于37℃水浴中将1支tb-labeled-at2r细胞冻融，直至冰全部融化(1～2分钟)；
[0115]
(8)迅速将冻融的细胞转移至步骤(6)中的1x tlb中，轻柔混匀后，于室温下离心5分钟，1200g；
[0116]
(9)轻柔的将上清液吸出，用1ml 1x tlb将细胞重悬混匀后，再加入1.7ml 1x tlb混匀后至于室温待用；
[0117]
(10)加入10μl细胞至所有试验孔中，室温下离心3秒，200g；加入5μl步骤(4)中的化合物工作液4x至相应的孔中；加入5μl步骤(5)中稀释的4x tag-lite angiotensin receptor red agonist至所有试验孔中。
[0118]
(11)将反应板于室温下离心1分钟，200g，室温25℃静置1小时后，室温下离心1分钟，200g，利用envision htrf酶标仪收集数据，利用非线性拟合公式计算ic
50
。
[0119]
(12)同理，采用基本相同的方法，不同的是使用tb-labeled-at1r细胞代替tb-labeled-at2r，测试本发明化合物对于at1r的拮抗活性的ic
50
。
[0120]
4、实验结果
[0121]
本发明化合物对at2r拮抗活性测试的ic
50
值见下表。
[0122]
化合物编号ic
50
(nm)/at2ric
50
(μm)/at1r化合物1m10>10化合物16>10
[0123]
结论：(1)本发明化合物的钠盐(化合物1)和其游离酸(化合物1m)，对于at2r具有显著拮抗活性；
[0124]
(2)本发明化合物的钠盐(化合物1)和其游离酸相比(化合物1m)，对于at1r拮抗的ic
50
值>10μm，对于at1r无拮抗活性；
[0125]
因此，本发明化合物对at2r的拮抗作用具有高度选择性。
[0126]
药代动力学测试
[0127]
1、实验目的
[0128]
以sd大鼠为受试动物，采用lc/ms/ms法测定大鼠静脉注射或灌胃给予本发明化合物，测定其不同时刻血浆中的药物浓度，研究本发明化合物在大鼠体内的药代动力学特征。
[0129]
2、实验方案
[0130]
2.1、实验药品与动物
[0131]
化合物1m及化合物1
[0132]
健康成年sprague dawley(sd)雄性大鼠6只，购自维通利华实验动物技术有限公司。
[0133]
2.2药物配制与给药
[0134]
(1)药物配置：
[0135]
称取76.32mg化合物1m，溶于12.72ml 0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)中，涡旋1分钟至化合物完全悬浮，最终配置浓度为6mg/ml；
[0136]
称取76.61mg化合物1，溶于12.768ml 0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)中，涡旋1分钟至化合物完全悬浮，最终配置浓度为6mg/ml。
[0137]
(2)给药
[0138]
健康成年sd大鼠6只，雌雄各半，平均分成2组；每组3只。禁食过夜后灌胃给药(po)
给予本发明化合物1m及化合物1，给药剂量均为60mg/kg。
[0139]
2.3样品采集
[0140]
于给药前和给药后0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时经颈静脉采约0.25ml血液，肝素钠抗凝。血液样本采集后置于冰上，离心分离血浆(离心条件：7000转/分钟，5分钟)。收集的血浆分析前存放于-70℃以下。
[0141]
2.4样品前处理
[0142]
取100μl血浆样品中加入300μl甲醇(包含内标工作液，氯雷他定800ng/ml)，涡旋5分钟，10000转/分钟离心10分钟，取1μl混合液至lc-ms/ms进样分析。
[0143]
3、药代动力学参数结果
[0144]
本发明的化合物和阳性对照的药代动力学参数如下表所示。
[0145][0146]
结论：本发明化合物的钠盐(化合物1)与其游离酸相比(化合物1m)相比，血药浓度和曲线下面积均有明显改善。