特氏盐芽抱杆菌TCI66207菌株及其破菌液及破菌液的用途的制作方法

特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株及其破菌液及破菌液的用途
技术领域
[0001]
本发明是关于一种特氏盐芽抱杆菌，特别是关于一种特氏盐芽抱杆菌 tci66207菌株及其破菌液及破菌液的用途。


背景技术：

[0002]
皮肤是人体隔绝外界环境中的伤害，例如紫外线、病原体、摩擦力等，与防止水分流失的第一道防线。皮肤由外向内依序包含表皮层、主要由结缔组织构成的真皮层、及皮下组织。表皮层是皮肤的最外层并且不断更新。当皮肤细胞损伤时，或皮肤细胞增生的速度低时，容易发生水份流失，若皮肤的胶原网络被破坏，更进而导致肌肤老化现象发生(如皱纹、松弛、暗沉、干燥)。
[0003]
表皮层与真皮层内含有胶原蛋白(collagen)、弹力蛋白(elastin)、及玻尿酸(hyaluronic acid)，其赋予支撑力量和肌肤弹性，然而当胶原蛋白、弹力蛋白、及玻尿酸随年龄增加而减少，这些因素皆会降低皮肤饱满度与弹性。
[0004]
此外，角质层主要成分为角蛋白(keratin)，会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，并吸收水分使皮肤保持湿润，从而防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤因外在环境刺激，导致角质细胞无法维持正常的代谢循环时，皮肤保水能力下降，并且皮肤表皮层屏障受损，让皮肤产生粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红的状况，因此角质层的健康与保水能力对于抵御外来伤害着实非常重要。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明提供一种一特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株及其破菌液及破菌液的用途。
[0006]
在一些实施例中，一种特氏盐芽抱杆菌(halobacillus trueperi) tci66207菌株，其寄存于dsmz德国微生物保藏中心(dsmz-deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturengmbh)(寄存编号为dsm33381)。
[0007]
在一些实施例中，一种组合物，含有特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液。
[0008]
在一些实施例中，一种特氏盐芽抱杆菌(halobacillus trueperi) tci66207菌株的破菌液用于制备维持皮肤角质层完整及/或增加玻尿酸生成的组合物的用途。
[0009]
任一实施例的特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株寄存于dsmz德国微生物保藏中心(寄存编号为dsm33381)。在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌 tci66207菌株的破菌液具有增进皮肤细胞粒线体活性的功能。又在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液具有促进细胞增生的功能。又在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液具有维持皮肤角质层完整及/或增加玻尿酸生成的功能。又在一些实施例，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液提高角质蛋白(keratin14)及/或透明质酸合成酶基因(has3)的表现。
[0010]
因此，在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液可用于制备维持
皮肤角质层完整及/或增加玻尿酸生成的组合物；又在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液用于制备增进皮肤细胞粒线体活性的组合物；又在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液用于制备促进细胞增生的组合物。
附图说明
[0011]
图1是以萤光显微镜(购自zeiss)观察不同组别的人类皮肤纤维母细胞受损程度。
[0012]
图2显示特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液提升皮肤细胞粒线体活性。
[0013]
图3显示特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液能促进皮肤细胞增生。
[0014]
图4显示人类原发性表皮角质形成细胞在有或无特氏盐芽抱杆菌 tci66207菌株的破菌液处理的情况下，其krt14与has3基因的相对表现量。
[0015]
图5为受试者脸部肌肤涂抹包安慰剂在第0周以检测仪所拍摄的图像。
[0016]
图6为受试者脸部肌肤涂抹包安慰剂在第4周以检测仪所拍摄的图像。
[0017]
图7为受试者脸部尚未肌于肤涂抹包含特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液的精华液，在第0周以检测仪所拍摄的图像。
[0018]
图8为受试者脸部肌肤涂抹包含特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液的精华液，在第4周以检测仪所拍摄的图像。
[0019]
图9显示受试者肌肤在第0周与第4周涂抹安慰剂与含有tci66207菌株破菌液的精华液a的肌肤水分散失状况。
[0020]
图10显示受试者肌肤在第0周与第4周涂抹安慰剂与含有tci66207菌株破菌液的精华液a的肌肤皱纹的状况。
[0021]
图11显示受试者肌肤在第0周与第4周涂抹安慰剂与含有tci66207菌株破菌液的精华液a的肌肤松弛度状况。
[0022]
生物材料保藏
[0023]
特氏盐芽抱杆菌(halobacillus trueperi)tci66207菌株，于2019年11 月25日保藏于dsmz德国微生物保藏中心(dsmz-deutschesammlung von mikroorganismen und zellkulturengmbh)，保藏编号为dsm33381。
具体实施方式
[0024]
关于本文中所使用的浓度符号「wt％」通常是指重量百分浓度，而浓度符号「vol％」通常是指体积百分浓度。
[0025]
图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。
[0026]
在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌(halobacillus trueperi)tci66207菌株，是分离自中国台湾东岸太平洋海域深度662公尺的海水的菌株。特氏盐芽抱杆菌tci66207以寄存编号dsm33381寄存于dsmz德国微生物保藏中心。特氏盐芽抱杆菌tci66207为革兰氏阳性杆菌，生长于高盐浓度环境，且为异营生物。在此，特氏盐芽抱杆菌tci66207生长的温度为25℃，并可于2.5％氯化钠(nacl)的盐度下生存。
[0027]
在一些实施例中，一种组合物，含有所述的特氏盐芽抱杆菌tci66207 菌株的破菌液。
[0028]
在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液具有增进皮肤细胞粒线体活性的功能。
[0029]
在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液具有促进皮肤细胞增生的功能。
[0030]
在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液具有维持皮肤角质层完整及/ 或增加玻尿酸生成的功能。
[0031]
在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液提高角质蛋白(keratin14) 及/或透明质酸合成酶基因(has3)的表现。
[0032]
在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌(halobacillus trueperi)tci66207菌株的破菌液用于制备维持皮肤角质层完整及/或增加玻尿酸生成的组合物的用途。
[0033]
在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液提高角质蛋白(keratin14) 及/或透明质酸合成酶基因(has3)的表现。
[0034]
在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液用于制备增进皮肤细胞粒线体活性的组合物的用途。
[0035]
在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液用于制备促进皮肤细胞增生的组合物的用途。
[0036]
在一些实施例中，前述组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状皮肤涂抹等方式给予一个体。前述组合物可制成食品、饮品、营养补充剂、或医药品，藉由口服方式给予一个体。
[0037]
菌种鉴定
[0038]
特氏盐芽抱杆菌tci66207将分离自中国台湾东岸太平洋海域深度 662m的海水的分离菌株以盐芽孢杆菌16s核糖体基因(16srdna)进行菌种鉴定。透过聚合酶连锁反应(pcr)得到此分离菌株的16s核醣体基因 (16srdna)序列(即seq id no:1)。接着，将seq id no:1序列以美国国家生物技术资讯中心(ncbi)网站与其他特氏盐芽抱杆菌的亚种的 16s核醣体基因(16srdna)进行序列比对后可知，特氏盐芽抱杆菌 tci66207为特氏盐芽抱杆菌种。
[0039]
范例一：tci66207破菌液的制备
[0040]
将特氏盐芽抱杆菌(halobacillus trueperi)tci66207菌株的冷冻保存管中取出，以10vol％接种于培养基，于25℃培养三天得到菌液。
[0041]
其中，培养基包含10vol％酵母抽提物(购自bd pharminge公司，型号 bd bacto
tm
212750)、0.09vol％磷酸氢二钾(k
2
hpo
4
)(购自sigma
-ꢀ
aldrich公司，型号p5656)、0.43vol％硫酸镁(mgso
4
)(购自sigma
-ꢀ
aldrich公司，型号63138)、0.2vol％葡萄糖(购自sigma-aldrich公司，型号g7021)与2.5vol％氯化钠(购自sigma-aldrich公司，型号s7653)。
[0042]
接着，将菌液以转速5000rmp/分钟离心15分钟，除去上清液收取菌泥，加入菌泥9倍重量的水并将菌泥均匀悬浮，得到溶液a。
[0043]
接下来，使用反复冻融法进行破菌：将溶液a放在-80℃的环境20分钟，再将溶液a放在95℃的环境5分钟。反复进行此步骤5次，得到溶液 b。
[0044]
接着，将溶液b以转速5000rmp/分钟离心15分钟，取上层澄清破菌液作为样品a。0.25ml的样品a(澄清破菌液)与99.75ml的水混合，作为细胞实验的样品b，换句话说，样品b的浓度为0.25vol％。
[0045]
范例二：细胞实验-皮肤抗氧化萤光损伤染色
[0046]
将人类皮肤纤维母细胞(ccd-966sk,bcrc no.60153)培养于24孔培养盘中，每孔添加细胞培养基为3ml，每孔种植2
×
104个人类皮肤纤维母细胞，于37℃恒温培养箱培养过夜(24小时)培养。
[0047]
细胞培养基为添加每升1.5g的碳酸氢钠、1mm(毫摩尔每升)的丙酮酸钠、10vol％的牛胎血清(fetal bovine serum，购自gibco公司)的90vol％伊格尔最低限度必需培养基(minimum essential medium eagle)(配于厄尔平衡盐溶液(earle's balanced salt solution,earle's bss))。
[0048]
将上述培养后的人类皮肤纤维母细胞分成以下三组别：实验组、对照组与控制组。实验组：前述人类皮肤纤维母细胞于培养盘中依照每一毫升的细胞培养基中加入0.01ml的样品b(tci66207破菌液)培养24小时后，加入1mm(毫摩尔每升)的双氧水(h
2
o
2
)培养30分钟。对照组：前述人类皮肤纤维母细胞不加入样品b培养24小时后，加入1mm(毫莫耳每升)的双氧水(h
2
o
2
)培养30分钟。控制组：前述人类皮肤纤维母细胞不加入样品b与双氧水，培养24小时又30分钟。
[0049]
prodidium iodide(pi)试剂(购自bd pharminge公司，型号cat.51
-ꢀ
66211e)购买取得后体积稀释250倍以得到pi溶液，膜联蛋白v(购自 ebioscience公司，型号cat.00-0055-43)购买取得后以膜联蛋白v结合缓冲液(annexin v binding buffer)(购自ebioscience，型号cat.00-0055
-ꢀ
43)将体积稀释250倍以得到膜联蛋白v溶液。于前述培养人类皮肤纤维母细胞步骤后，各组别以pi试剂，以及膜联蛋白v溶液染色15至30分钟。
[0050]
接下来，各组别以hoechst 33342溶液将细胞染色3分钟。接着，各组别以磷酸盐缓冲液(pbs)(购自gibo公司)清洗细胞两次。在此， hoechst 33342试剂(购自thermo公司，型号cat.62249)购买取得后体积稀释20000倍以得到hoechst溶液。
[0051]
请参阅图1所示，所得到的经染色的细胞以萤光显微镜(购自zeiss) 观察。细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)由膜脂内侧翻向外侧。膜联蛋白v是钙离子依赖性磷脂结合蛋白，可与磷脂酰丝氨酸特异结合。而pi试剂为核酸染料。因此，被膜联蛋白v溶液及pi溶液染色的细胞为受损细胞或死细胞，其中，绿色萤光代表被膜联蛋白v溶液染色的细胞，蓝色萤光代表被pi溶液染色的细胞。
[0052]
由图1的结果可知，受损的人类皮肤纤维母细胞经过样品b(tci66207 破菌液)处理后，被膜联蛋白v溶液及pi溶液染色的细胞数量小于没有经过样品b处理的细胞数量。也就是说，受损的人类皮肤纤维母细胞经过样品b处理后，可降低受损程度。
[0053]
范例三：细胞实验-皮肤细胞粒线体活性实验
[0054]
粒线体是供给细胞能量的胞器，并且参与细胞的氧化还原恒定及养分代谢，其正常运作对维持细胞的活力与增殖能力至关重要。为探讨特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液对皮肤细胞粒线体功能的影响，本实施例以流式细胞仪评估人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk经盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液处理后，其粒线体活性的变化。
[0055]
首先，将人类皮肤纤维母(ccd-966sk,bcrc no.60153)细胞培养于 6孔培养盘中，每孔添加细胞培养基为0.01ml，每孔种植1
×
10
5
个人类皮肤纤维母细胞，并于37℃恒温培养箱培养过夜(24小时)。此范例的细胞培养基与前述范例二的细胞培养基相同，故于此不再赘述。
ct
tbp
，
△△
ct＝
△
ct
目标基因
-△
ct
基准基因
，倍数变化＝2
-△△
ct平均值
。以对照组的标的基因表现量作为1的比较基准。个组织间的统计学显着差异是藉由单尾史徒登氏t-检定来决定
[0075]
表一
[0076]
引子名称序列编号序列krt14-fseq id no:2ttctgaacgagatgcgtgackrt14-rseq id no:3gcagctcaatctccaggttchas3-fseq id no:4cgcagcaacttccatgagghas3-rseq id no:5agtcgcacacctggatgtagttbp-fseq id no:6tataatcccaagcggtttgctbp-rseq id no:7gctggaaaacccaacttctg
[0077]
需要特别说明的是，图示中之基因相对表现量是将控制组的表现量视为 1来计算各组别的表现量。，并且，各组之间的统计学显著差异是藉由学生 t-试验(student t-test)来统计分析。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。
[0078]
本实验例的结果显示于图4，与对照组相较，实验组krt14和has3 的基因表现量有显着的提升。特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液可以提升krt14基因的表现，详细来说，当对照组的krt14基因表现量为1 时，实验组的krt14基因表现量为1.52倍，因此，特氏盐芽抱杆菌 tci66207菌株的破菌液，能维持角质细胞排列，使皮肤角质组织完整，进而防止肌肤水分散失。
[0079]
另一方面，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液可以提升has3的基因的表现，详细来说，当对照组的has3基因表现量为1时，实验组的 has3的基因表现量为1.34倍，因此，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液能促进内生性玻尿酸生成，以维持肌肤的弹性及光泽。
[0080]
范例六：人体实验
[0081]
8位受试者每日早晚清洁脸部后，将包含特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液的精华液(精华液a)与安慰剂分别涂抹于左右半脸，以指腹稍加按摩促进吸收，并持续4周。其中，精华液a成分主要是1vol％的样品a 与99vol％的空白精华液，其中空白精华液的成分包含93.5vol％的水、 0.6vol％的馨鲜酮、0.vol％的己二醇、5vol％的1,3丁二酮、0.2vol％的三仙胶及0.1vol％的三乙醇胺。
[0082]
并于开始使用第0周(未涂抹过精华液a或安慰剂)，以及使用后第4 周(连续涂抹精华液a或安慰剂)分别以仪器(combo皮肤分析仪)进行检测。
[0083]
请参阅图5及图6，涂抹安慰剂的受试者，眼下皱纹于第4周(如图6 所示)相较于第0周(如图5所示)的皱纹无明显的减少或是变浅。请参阅图7及图8，涂抹精华液a的受试者，眼下的皱纹于第4周(如图8所示) 相较于第0周(如图7所示)的皱纹较浅且稀疏。由此可知，相较于第0周时的皱纹状态，在连续涂抹包含特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液的精华液后，受试者的皱纹减少，换句话说，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液具有改善皱纹的能力。
[0084]
于仪器(combo皮肤分析仪)检测后，将第0周之肌肤状况为基准(即
第0周之相对肌肤状况为100％)，计算第4周的相对肌肤状况(％)。并且，第0周的相对肌肤状况与第4周的相对肌肤状况之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析，如图9至图11所示。在图9 至图11中，「*」代表在与第0周比较下其p值小于0.05。
[0085]
请参阅图9，涂抹安慰剂的受试者，肌肤水分散失状况于第4周相较于第0周上升了1.2％，然而涂抹精华液a的受试者，肌肤水分散失状况第4 周相较于第0周下降了4.9％，也就是在连续涂抹含有tci66207菌株的破菌液的精华液后，受试者的肌肤具有较佳的保水度。
[0086]
请参阅图10，涂抹安慰剂的受试者，肌肤皱纹的状况于第4周相较于第0周上升了14.8％，然而涂抹精华液a的受试者，肌肤皱纹的状况第4周相较于第0周下降了19.1％，也就是在连续涂抹含有tci66207菌株的破菌液的精华液后，受试者的肌肤具的皱纹得到改善。
[0087]
请参阅图11，涂抹安慰剂的受试者，肌肤松弛度于第4周相较于第0 周下降4.6％，然而涂抹精华液a的受试者，肌肤皱纹的状况第4周相较于第0周下降了19.1％，也就是在连续涂抹含有tci66207菌株的破菌液的精华液后，减缓受试者肌肤松弛状况。
[0088]
综上所述，在一些实施例中，特氏盐芽抱杆菌tci66207菌株的破菌液具有皮肤细胞粒线体活性的功能。在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液具有促进皮肤细胞增生的功能。在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液能提高角质蛋白(keratin14)基因的表现，因而具有维持皮肤角质层完整的功能。在一些实施例中，tci66207菌株的破菌液能提高透明质酸合成酶基因(has3)的表现，因而具有增加玻尿酸生成的功能。
[0089]
虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神所作些许的更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明的保护范围当视后附的申请权利要求所界定者为准。