专利名称：木聚糖酶的基因、质粒、菌株及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种耐高温耐强碱的木聚糖酶的基因、生产 菌株及该基因编码的木聚糖酶在纸浆漂白的应用。
背景技术：
造纸工业是支撑我国国民经济的重要产业之一，但也是我国重要的工业污染源之 一。这是因为目前制浆造纸工业仍主要采用硫酸盐法制浆和氯漂技术，含氯漂剂是造纸工 业中普遍使用的漂白剂。长期以来，人们一直认为氯是纸浆漂白中最经济有效的漂白剂。但 在传统的氯漂工艺中，漂白废水中含有大量对人体有害的物质，其中以二噁英为代表的有 机氯化物对环境的危害尤为严重，它们具有强致癌作用，带来了严重的环境污染。随着全世 界范围内对纸和纸板不断增加的需求和越来越严的造纸废液排放的要求，加剧了漂白工艺 向少氯和无氯漂白的方向发展。在1986年国际纸浆造纸工业生物技术研讨会上，芬兰科学家Viikari等首次报道 应用木聚糖酶处理浆料能改善其漂白性能，减少氯气使用用量，提高纸浆白度的。随后多项 实验证实木聚糖酶用于纸浆预漂能有效降低漂白化学用品的消耗量，提高纸浆强度。为了 获得最佳助漂效果，从微生物中提取的木聚糖酶要求无或低纤维素酶活活性，因为纤维素 酶活性会造成纸浆中纤维素的损失，降低纸浆的质量和增加排放物的处理成本。制浆之后及在用木聚糖酶处理纸浆之前，纸浆处于大约高温(55_70°C )及在高碱 性PH下(pH9-ll)。高温和碱性状态对木聚糖酶制剂提出了严格的要求。许多可商购的野 生型木聚糖酶的缺点是这些酶呈现酸性的最佳PH及大约55°C的最佳温度。如用这些木聚 糖酶进行漂白，纸浆必须酸化为使用的特异性木聚糖酶最佳PH相近的pH。另外，热纸浆必 须冷却至接近选择的木聚糖酶的酶活性的最佳温度。针对木聚糖酶处理而降低纸浆温度降 低了随后化学漂白的效力，而酸化纸浆也需要使用大量酸。另外，加入酸产生侵蚀，对反应 塔提出了新的要求。因此在接近纸浆原漂白条件的温度和PH条件下活性最佳的木聚糖酶 在纸浆生产中最为理想。200610037416. 6号中国专利申请公开了一种高效表达木聚糖酶基因的方法及在 纸浆漂白工艺中的应用。该专利申请中的木聚糖酶的酶活为526IU/mL，在75°C、pH9. 0时 的半衰期为45分钟。该木聚糖酶虽然在一定程度上能耐高温和耐碱，但高温高碱的条件下 半衰期短，不能满足纸浆漂白工艺中处理时间1-1. 5小时的要求。
发明内容
本发明的目的之一在于解决现有技术的不足之处而提供一种能够编码耐高温、耐 碱、高效稳定的木聚糖酶的基因。本发明目的可以通过以下技术措施实现一种木聚糖酶的基因，所述的木聚糖酶 基因xyn的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。Gashaw Mamo 等在 2006 年首次克隆了嗜盐芽孢杆菌(Bcillus halodurans S7)的木聚糖酶A(xyn)基因，并将其在大肠杆菌中成功表达；同年他们报道了其主要的酶学性 质，发现该木聚糖酶具有耐热性、耐碱性，且不含纤维素酶活，可能具有应用于造纸工业的 理想特性。但此后并没有看到关于该酶应用于生产的报道。其原因可能在于，其一，在原始 菌株的表达量低；其二，尽管Gashaw Mamo等将其基因在大肠杆菌中表达，但表达的酶活相 对较低，分泌的酶活为5. lU/mL，该酶不能完全分泌，有部分分布在在胞内及周质空间而且 表达量不高，提取酶时必须进行破壁处理，因而限制了其作为工业用酶制剂的进一步开发。本发明采用密码子优化、基因全合成等方法，实现对S7_Xyn(嗜盐芽孢杆菌S7 的木聚糖酶A)基因的分子改造和人工组建，得到一种能够高效表达木聚糖酶的基因。发 明人根据美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上公布的 S7-xyn基因序列，对序列进行优化，替换成毕赤酵母偏好的密码子，再将优化后的基因序列 用 DNAW0RKS 软件(http://mcll. ncifcrf. gov/lukowski. html)，设计全基因合成的引物， 设计了 34 条引物，采用两步法(PCR-base two-step DNA synthesis PTDS)合成 S7_xyn 基 因序列，得到的木聚糖酶基因的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。本发明的另一目的在于提供一个携带3个拷贝S7-Xyn的毕赤酵母分泌表达 重组载体pPICZ α A-(XYN) 3。通过在商用毕赤酵母分泌表达载体pPICZ α A中连续三次 连入S7-Xyn的表达盒，构成重组质粒pPICZaA-(XYN)3。携带该木聚糖酶基因的菌株 Escherichia coli TOPlO/pPICZ α A-(XYN)3已于2010年7月26日在中国典型培养物保藏 中心保藏，保藏号为CCTCC NO =M 2010186。保藏地址为湖北省武汉市武汉大学(430072)。重组质粒pPICZ α A-(XYN)3可以通过以下技术措施实现(1)采用第一个发明目的所述方法全基因合成S7-xyn时，在上游和下游已分别 引入了限制性内切酶EcoRI和NotI酶切位点。因此将全基因PCR产物和毕赤酵母分泌表 达载体PPICZ α A质粒(invitrogen)都用EcoRI和NotI双酶切，体外连接构建重组质粒 pPICZα A-XYN0(2)外源基因的拷贝数的增加有可能提高木聚糖酶基因S7_Xyn在毕赤巴斯德酵 母中的表达，因此通过分子克隆，在体外以多个表达盒串联的形式构建得到多拷贝的载体。 根据pPICZ α A载体特点设计了引物克隆含成熟S7木聚糖酶基因及表达调控元件完整的表 达盒(Cassette)，上游引物 Fl 5 ‘-GGAAGATCTAACATCCAAAGACGAMGG-3’，含 Bgl II 酶切位 点(以下划线示出)以及保护碱基；下游引物Rl 5- ‘GTATAGGATCCGCACAAACGAAGGTCTC-3’ ，含BamH I酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基。Bgl II与BamH I是同尾酶，酶切后 产生相同的粘性末端。以质粒pPICZ α A-XYN为模板，Fl和Rl为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序94°C 预变性3min ；94°C变性60s，55°C退火60s，68°C延伸3min，共30个循环；第30个循环68°C 延伸lOmin。将PCR产物用BglII和BamH I双酶切，质粒pPICZ α A-XYN用BamH I单酶 切，16°C下Τ4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌宿主菌(T0P10或DH5ci) 经Zecoin抗性平板筛选阳性转化子。转化子提取质粒经双酶切鉴定后得到构建重组质粒 pPICZ α A-(XYN)20 再将重组质粒 pPICZ α A-(XYN)2 用 BamH I 单酶切，与经 Bgl II 和 BamH I双酶切后的表达盒再次进行体外连接，可得到重组质粒pPICZ α A- (XYN)30本发明的又一目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种能高效表达木聚糖 酶的毕赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ α A-(XYN) 3。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类酵母菌，可以利用甲醇作为唯一碳源和能 源。作为真核表达系统，具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点具有强有力的乙醇氧 化酶(AOXl)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；酵母生长繁殖速度快、营养要求低、 培养基廉价；外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上，外源基因不会发生随 生长繁殖而丢失；表达量高，许多蛋白可达到每升克级以上；同时，毕赤酵母自身分泌的蛋 白(背景蛋白)非常少，有利于纯化。毕赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ α A-(XYN)3可以通过以下技 术措施实现以LiCl法将Sac I线性化的重组质粒pPICZ α A- (XYN) 3转化毕赤巴斯德酵母 宿主菌GS115或Χ33，转化物涂布于MD平板，培养2_3天。将MD平板上的转化子分别接种 于含不同浓度的Zeocin (博莱霉素)抗性YPD平板上，培养3_5天。将高浓度Zeocin-YPD 平板上出现的转化子挑取其对应的单克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作 为模板，进行酵母基因组PCR鉴定，获得重组转化子。重组转化子先接种于200mL的YPD培养基中，培养至0D600到8_12作为种子液。 培养种子液8-10瓶，然后以5-10%的接种量(体积比)转接至含20-35L BSM培养基的50L 发酵罐中培养。用25%氨水控制pH为5. 0，通气约1. 5m7h(25L/min)，培养温度为28°C。 甘油耗完后再补加5-8L 50% (体积比，1 1)的甘油，至二次甘油消耗完，0D_达280-320 左右，饥饿0. 5-lh后，补料甲醇，甲醇流加速度为30g/L h-60g/L · h，溶氧控制在5-10%, 氨水自动流加，发酵120-140h后结束，发酵液中木聚糖酶酶活为1200U/mL左右。本发明的再一目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种木聚糖酶在纸浆漂 白的应用。本发明一种毕赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ α A-(XYN) 3，由 质粒pPICZ α A-(XYN)3转化毕赤酵母宿主菌Χ33后得到，所述的基因工程酵母菌Pichia Pastoris X33/pPICZ α A_ (XYN) 3产的木聚糖酶可应用在纸浆漂白。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。本发明的具体实验方法可以参照分子克隆实验指南(第三版，冷泉港出版社出 版)以及 Pichia Fermentation Process Guidelines(Invitrogen)0实施例1合成木聚糖酶基因(S7-xyn)嗜盐芽孢杆菌(B. halodurans S7)内切木聚糖酶的基因S7-xyn的基因序列及蛋 白结构信息来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/) 禾口蛋白数据库(PDB, http://www. rcsb. org/pdb/search/advSearch. do)。根据NCBI上公布的S7_Xyn基因序列，对序列进行优化，全部替换成毕赤酵母 偏好的密码子，再将优化后的基因序列用DNAW0RKS软件(http://mcll.nciferf, rov/ lukowski. html)，设计全基因合成的引物，设计了 34条引物(即依次对应于SEQ ID NO 2 SEQ ID NO 35)，其中第1条引物S7-1和第34条引物分别引入了 EcoRI和NotI酶切位点 以及酶切保护碱基，见表1。表1全基因合成S7-xyn基因的引物名称_序列(S，一3”_
S7-1ACGGAATTCATGATTACTTTGTTTAAGAAGCCATTTGTTGCTGGTTTGG EcoRl
S7-2CAACGTTACCCAAACCACCACCAACCAACAAAGAAATAGCCAAACCAGCAACAAATGGC
S7-3TGGTGGTTTGGGTAACGTTGCTGCTGCTCAAGGTGGTCCACCAAAGTCTGGTGTTTTTG
S7-4CAAGCAAATGGTTGATCGTTTCTCTTTTGGTTTTCACCAAAAACACCAGACTTTGGTGG
S7-5GAAACGATCAACCATTTGCTTGGCAAGTTGCTTCTTTGTCTGAAAGATACCAAGAACAA
S7-6ATTGGTATGGTTCAACAGCAGCACCAATATCAAATTGTTCTTGGTATCTTTCAGACAAA
S7-7GCTGCTGTTGAACCATACCAATTGGAAGGTAGACAAGCTCAAATTTTGAAGCATCATTA
S7-8TGGCTTCATAGCGTTTTCAGCAACCAAAGAGTTGTAATGATGCTTCAAAATTTGAGCTT
S7-9CTGAAAACGCTATGAAGCCAGTTTCTTTGCAACCAAGAGAAGGTGAATGGAACTGGGAA
S7-10TTATGCTTTCTAGCAAATTCAACAATCTTATCAGCACCTTCCCAGTTCCATTCACCTTC
S7-11TTGTTGAATTTGCTAGAAAGCATAACATGGAATTGAGATTTCATACTTTGGTTTGGCAT
S7-12TTTTCATCAATAAAAAACCATTCTGGAACTTGAGAATGCCAAACCAAAGTATGAAATCT
S7-13TCCAGAATGGTTTTTTATTGATGAAAACGGTAACAGAATGGTTGATGAAACTGATCCAG
S7-14TTTCCAACAACAATTGCTTGTTAGCCTTTCTCTTTTCTGGATCAGTTTCATCAACCATT
S7-15CTAACAAGCAATTGTTGTTGGAAAGAATGGAAAACCATATTAAGACTGTTGTTGAAAGA
S7-16AACAACATCCCAAGAAGTAACATCATCCTTGTATCTTTCAACAACAGTCTTAATATGGT
S7-17GATGTTACTTCTTGGGATGTTGTTAACGAAGTTATTGATGATGGTGGTGGTTTGAGAGA
S7-18TTAATGTAATCAGTACCAGTAATTTGGTACCATTCAGATTCTCTCAAACCACCACCATC
S7-19CCAAATTACTGGTACTGATTACATTAAGGTTGCTTTTGAAACTGCTAGAAAGTACGGTG
S7-20GTGTTGTAATCGTTAATGTACAACTTAGCTTCTTCACCACCGTACTTTCTAGCAGTTTC
S7-21AGTTGTACATTAACGATTACAACACTGAAGTTCCATCTAAGAGAGATGATTTGTACAAC
S7-22TGGAACACCTTGTTCCAACAAATCCTTAACCAAGTTGTACAAATCATCTCTCTTAGATG
S7-23TTGTTGGAACAAGGTGTTCCAATTGATGGTGTTGGTCATCAATCTCATATTCAAATTGG
S7-24AAAGAAGCTCTAGTATCTTCAATAGATGGCCAACCAATTTGAATATGAGATTGATGACC
S7-25ATCTATTGAAGATACTAGAGCTTCTTTTGAAAAGTTTACTTCTTTGGGTTTGGATAACC
S7-26CAACCGTACAAAGACATATCCAATTCAGTAACTTGGTTATCCAAACCCAAAGAAGTAAA
S7-27TTGGATATGTCTTTGTACGGTTGGCCACCAACTGGTGCTTACACTTCTTACGATGATAT
S7-28TCTATCAGCTTGAGCTTGAAACAATTCTTCTGGAATATCATCGTAAGAAGTGTAAGCAC
S7-29TGTTTCAAGCTCAAGCTGATAGATACGATCAATTGTTTGAATTGTACGAAGAATTGTCT
S7-30CAATACCCCAAAAAGTAACAGAAGAAATAGTAGCAGACAATTCTTCGTACAATTCAAAC
S7-31TCTTCTGTTACTTTTTGGGGTATTGCTGATAACCATACTTGGTTGGATGATAGAGCTAG
S7-32AATGGAGCATCAACACCAACACCGTTGTTGTATTCTCTAGCTCTATCATCCAACCAAGT
S7-33TGTTGGTGTTGATGCTCCATTTGTTTTTGATCATAACTACAGAGTTAAGCCAGCTTACT
S7-34CAT GCGGCCGCTTAATCAATAATTCTCCAGTAAGCTGGCTTAACTCTGT-3 Notl_本发明采用两步法(PCR-basetwo-step DNA synthesis PTDS)合成 S7_xyn 基因 序列.1.第一步 PCR 反应将34条引物分3组，其中合成片段1的引物为(S7-1-S7-12)、合成片段2的引物
为(S7-13-S7-24)、片段3的引物为(S7_25_S7_34)进行无模板PCR扩增反应。PCR扩增反应程序为94°C预变性2min ；94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸
2min，共30个循环；第30个循环72°C延伸lOmin，PCR产物用凝胶电泳鉴定后存于_20°C备用。2.第二步 PCR 反应以第一步PCR反应得到的三段片段为模板，以S7-1和S7-34引物进行第二轮PCR
反应，PCR扩增反应程序为94°C预变性3min ；94°C变性45s，55°C退火min，72°C延伸2min，
共30个循环；第30个循环72°C延伸lOmin，PCR产物用凝胶电泳鉴定后存于-20°C备用。
将PCR产物测序确认得到所需DNA，如SEQ ID NO 1所示
6
ATGATTACTTTGTTTMGMGCCATTTGTTGCTGGTTTGGCTATTTCTTTGTTGGTTGGT60
GGTGGTTTGGGTMCGTTGCTGCTGCTCMGGTGGTCCACCAMGTCTGGTGTTTTTGGT120
GAAMCCAMAGAGAAACGATCMCCATTTGCTTGGCMGTTGCTTCTTTGTCTGAMGA180
TACCMGMCAATTTGATATTGGTGCTGCTGTTGAACCATACCAATTGGAAGGTAGACAA240
GCTCAMTTTTGMGCATCATTACMCTCTTTGGTTGCTGAAMCGCTATGMGCCAGTT300
TCTTTGCMCCMGAGMGGTGMTGGMCTGGGAAGGTGCTGATMGATTGTTGMTTT360
GCTAGAAAGCATMCATGGAATTGAGATTTCATACTTTGGTTTGGCATTCTCMGTTCCA420
GAATGGTTTTTTATTGATGAAMCGGTMCAGMTGGTTGATGAMCTGATCCAGAAMG480
AGAMGGCTAACMGCMTTGTTGTTGGMAGMTGGAMACCATATTMGACTGTTGTT540
GAMGATACAAGGATGATGTTACTTCTTGGGATGTTGTTAACGAAGTTATTGATGATGGT600
GGTGGTTTGAGAGMTCTGAATGGTACCMATTACTGGTACTGATTACATTMGGTTGCT660
TTTGAMCTGCTAGAAAGTACGGTGGTGMGMGCTMGTTGTACATTMCGATTACMC720
ACTGMGTTCCATCTAAGAGAGATGATTTGTACMCTTGGTTMGGATTTGTTGGMCAA780
GGTGTTCCMTTGATGGTGTTGGTCATCMTCTCATATTCAMTTGGTTGGCCATCTATT840
GAAGATACTAGAGCTTCTTTTGAAMGTTTACTTCTTTGGGTTTGGATMCCMGTTACT900
GAATTGGATATGTCTTTGTACGGTTGGCCACCMCTGGTGCTTACACTTCTTACGATGAT960
ATTCCAGMGAATTGTTTCAAGCTCAAGCTGATAGATACGATCAATTGTTTGMTTGTAC1020
GMGMTTGTCTGCTACTATTTCTTCTGTTACTTTTTGGGGTATTGCTGATMCCATACT1080
TGGTTGGATGATAGAGCTAGAGMTACMCMCGGTGTTGGTGTTGATGCTCCATTTGTT1140
TTTGATCATAACTACAGAGTTMGCCAGCTTACTGGAGMTTATTGATTAA1191结果表明合成的基因片段全长1191bp，与拟合成的S7-xyn优化后的序列一致，且 读码框正确。采用两步PCR方法可以快速地合成目的基因，且错误率低。根据测序结果，将 优化后的基因序列与原始序列在NCBI上进行比对，同源性是80%。本发明提供的基因序列也可以通过专门的生物技术公司或机构使用全自动合成 仪合成。实施例2制备含3拷贝的S7-xyn基因的质粒将实施例1得到的PCR产物电泳，切胶回收约1200bp处的目的条带，回收产物经 EcoRI和NotI双酶切处理，与同样经EcoRI和NotI双酶切、胶回收的表达载体pPICZ α A用 T4DNA连接酶连接。10 μ L体积反应体系如下=PPICZaAlyL(SOng),加入全合成基因产物 6 μ L，含 ATP 的 IOXBuffer 1 μ L，T4DNA 连接酶 1 μ L，用 ddH20 补足至 10 μ L。稍加离心， 16°C水浴连接过夜，并转化Ε. coli ToplO中，在含有Zeocin (博莱霉素，25 μ g/mL)的LB 平板上筛选阳性转化子。随机挑取一定量的转化子，小量制备质粒，经限制性内切酶EcoRI 和NotI双酶切处理后，进行电泳分析。成功连接目的基因的质粒经酶切后，预计可得到 1200bp，和3. 5kb两个片段，质粒酶切鉴定正确。将重组质粒测序，证实木聚糖酶S7-Xyn基 因编码框完全正确。将重组质粒命名为pPICZ a A-XYN重组质粒。根据pPICZ a A载体特点设计了引物克隆含成熟S7木聚糖酶基因及表达调控元件 完整的表达盒(Cassette)，上游引物Fl 5 ‘-GGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG-3’，含 BgI II 酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基；下游引物Rl 5-GTATAGGATCCGCACAAACGAAGGTCT C-3’，含BamH I酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基。
以质粒pPICZ α A-XYN为模板，Fl和Rl为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序94°C 预变性3min ；94°C变性60s，55°C退火60s，68°C延伸3min，共30个循环；第30个循环68°C 延伸lOmin。将PCR产物用Bgl II和BamH I双酶切，质粒pPICZ α A-XYN用BamH I单酶 切，16°C下Τ4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌宿主菌(T0P10或DH5ci) 经Zecoin抗性平板筛选阳性转化子。转化子提取质粒经双酶切鉴定后得到构建重组质粒 pPICZ α A- (XYN)20 再将重组质粒 pPICZ α A- (XYN) 2 用 BamH I 单酶切，与经 Bgl II 和 BamH I 双酶切后的表达盒再次进行体外连接，可得到重组质粒pPICZ α A" (XYN) 3。实施例3木聚糖酶S7-Xyn在毕赤酵母中的高效表达通过LiCl法将经Sac I酶线性化完全的实施例2的pPICZ α A_ (XYN)3转化Pichia pastoris X33。转化物涂布MD平板，30°C培养2天。将MD平板上的转化子分别接种于含 Zeocin 100 μ g/mL, 200 μ g/mL, 300 μ g/mL, 400 μ g/mL, 500 μ g/mL 的 YPD 平板上，30°C培养 3天。将较高浓度Zeocin-YPD平板上出现的转化子挑取单克隆。按Invitrogen操作指南 提取酵母基因组DNA作为模板，利用目的基因序列的PCR引物进行酵母基因组PCR鉴定，总 反应体积为20 μ L，Taq酶量为2U，取2 μ LPCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的重组转化子X33/pPICZ α A-(XYN)3先接种于200mL的YPD培养基中， 培养至OD6tltl到10作为种子液。培养种子液8瓶，然后以5%的接种量(体积比)转接至含 30L BSM培养基的50L发酵罐中培养，甘油耗完后再补加6L 50% (质量体积比)的甘油， 至二次甘油消耗完，OD600达300，饥饿半小时后，补料甲醇，甲醇流加速度为50g/L · h，溶氧 控制在5-10%，氨水自动流加，发酵120h后结束。发酵液经3000rpm离心后收集上清，上清 测定木聚糖酶酶活为1200U/L。该上清可直接作为木聚糖酶液应用于后续的麦草浆漂白预 处理。酶活的测定原理木聚糖酶在一定条件下水解底物木聚糖，生成木糖等醛糖，醛糖 与3，5-二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈 色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而计算出木聚糖酶酶 活。酶活的测定方法酶液加蒸馏水稀释至适当的稀释倍数，取0. 5mL于25mL比色管， 加入ImL 桦木木聚糖，pH7. 0，50°C下准确反应30min，立即拿出流水冷却后，加入3. OmL DNS，沸水浴5分钟后定容至25mL，在540nm下测定其吸光度，根据被测液的吸光度，由木糖 标准曲线计算样品中的总还原糖的浓度，计算木聚糖酶活。DNS试剂配置方法用400mL蒸馏水溶解6. 3g 3，5_ 二硝基水杨酸，逐步加入21g氢氧化钠，再加入 185g四水合酒石酸钾钠、5. Og苯酚、5. Og无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48°C )，不断搅拌， 直至溶液清澈透明。用蒸馏水定容至IOOOmL,保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5 7天后使用，贮存期为6个月酶活力的定义为在50°C、pH7. 5的条件下，每分钟从的木聚糖溶液中降解释 放1 μ mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。实施例4 S7-xyn木聚糖酶的酶学性质本实施例采用的S7_Xyn木聚糖酶为实施例3的发酵后上清液。1、S7-xyn木聚糖酶的最适 pH值和最适温度
使用不同pH缓冲液(3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0,12. 0) (pH 彡 8. 0
用磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液，PH > 8. 0用甘氨酸氢氧化钠溶液)分别配制1 %桦木木 聚糖底物溶液及稀释S7-Xyn木聚糖酶液，测定木聚糖酶在各种不同pH值下的相对酶活。 S7-xyn木聚糖酶最适作用pH值为9. 0，pH6. 0 10. 0范围内相对酶活维持在90%以上；当 pH< 5.0或> 10.0后，S7-xyn木聚糖酶的酶活降到60%以下。在451、501、551、601、651、701、751、801、851，？冊.0或？!110.0 的条件下 测定S7-Xyn木聚糖酶的相对酶活。在ρΗΙΟ.Ο下，最适作用温度为70°C，pH9.0下，最适作 用温度为75°C。在60°C 80°C范围内，酶活均能维持在85%以上的，即使pH10. 0条件，温 度为80°C时，相对酶活仍保持在60%以上。2、S7-xyn木聚糖酶的耐热性及耐碱性将S7-xyn木聚糖酶分别在60°C、65°C及70°C的水浴锅中保温，每隔30min时间 取样，在最适温度75°C和最适pH9. 0下测定S7-Xyn木聚糖酶活的热稳定性。S7_Xyn木 聚糖酶在60°C、65及70°C保温Ih后，木聚糖酶活性都可以维持在80%以上；60°C及65°C 时、S7-xyn半衰期为6h以上(6h时，活力仍保留60% )，70°C条件下，S7-xyn半衰期长达 2. 5h(3h时，酶活力保持在40% )0S7-xyn 木聚糖酶分别被不同 pH 缓冲液(ρΗ3· 0、ρΗ4· 0、ρΗ5. 0、ρΗ6. 0、ρΗ7. 0、 ρΗ8· 0、ρΗ9· 0、ρΗ10· 0、ρΗ11· 0、ρΗ12· 0)处理 12h 后，然后在最适温度 75°C和最适 ρΗ9. 0 条 件下测定相对酶活变化。经上述处理后，相对酶活均能维持75%以上，而pH9. 0 pH12. 0 时，相对酶活为最大酶活80%以上，S7-Xyn木聚糖酶适合在碱性条件下作用。3、木聚糖酶的底物专一性S7_Xyn木聚糖酶对不同来源的木聚糖表现不同的酶活性，对燕麦木聚糖的水解能 力比桦木木聚糖强，特别是对sigma木聚糖的水解酶活比桦木木聚糖高35%。对不同来 源的燕麦木聚糖也表现出不同的水解酶活，对sigma木聚糖的水解酶活比Fluka木聚糖高 15. 1%。S7-Xyn木聚糖酶对羧甲基纤维素、蔗糖和淀粉作用时没有酶活性，说明S7_Xyn无 纤维素酶活性实施例5 S7-xyn木聚糖酶在麦草浆ECF和TCF漂白中的应用本实施例采用的S7_Xyn木聚糖酶为实施例3的发酵后上清液。在传统的氯漂工艺中，漂白废水中含有大量对人体有害的物质，其中以二噁英为 代表的有机氯化物对环境的危害尤为严重，它们具有强致癌作用，造成了严重的环境污染。 用Cio2取代氯气漂白会大大降低漂白废水中的氯化有机化合物含量，这就是通常所说的无 元素氯(ECF)漂白技术。全无氯漂白(TCF)是指不用任何含氯漂剂而用H2O2、臭氧及过醋 酸等含氧化学药品对浆样进行漂白，在整个过程造成的污染小。以氧脱木素和过氧化氢漂 白为主的全无氯漂白(TCF)技术和以二氧化氯漂白为主的无元素氯漂白技术(ECF)，是近 期我国纸浆清洁漂白技术研发和推广的重点技术。使用木聚糖酶对麦草浆预处理，可以使浆样中的发色基团、木聚糖、木素碳水化合 物复合体结构等可以发生一定程度的变化，从而使纸浆中残余木素或发色物质在后续的 ECF和TCF漂白工序中更容易除去，以达提高纸浆白度和物理性能、节约后续漂白剂的用 量，降低成本以及减轻漂白废水对环境的污染负荷等目的。本实施例考察了重组S7-Xyn木 聚糖酶在麦草浆ECF和TCF漂白中的应用。
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1、S7-xyn木聚糖酶处理对麦草浆DEpP漂白的影响在麦草浆ECF漂白中，选用DEpP漂白工序D (ClO2漂白)，Ep (H2O2强化碱抽提)， P(H2O2漂白)。在ClO2漂白前利用S7-xyn木聚糖酶对麦草浆进行预处理(Xs7DEpP)后，有利 于提高DEpP漂白后的最终白度和物理性能经S7-xyn木聚糖酶处理后，最终白度由处理前 的79. 8% ISO提高到了 81. 9% ISO,比未经过预处理提高了 2. 1% ISO ；抗张指数、撕裂指 数以及耐破度方面均有改善。而且加入S7-xyn木聚糖酶预处理同时减少10% ClO2时，漂 白后麦草浆的性能能达到未经酶处理的所有指标并有所提升(表2)。表2 S7-xyn木聚糖酶处理对麦草浆DEpP漂白的影响
权利要求
一种木聚糖酶的基因，其特征在于，所述的木聚糖酶基因xyn的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种含有权利要求1所述的木聚糖酶基因的质粒PPICZ α A- (XYN) 3，是将基因xyn串 联为3个拷贝，连入毕赤酵母分泌表达载体pPICZ α A中，构成重组质粒pPICZ α A_ (XYN) 3 ； 携带该木聚糖酶基因的菌株Escherichia coliTOPlO/pPICZ α A_ (XYN) 3的保藏号为CCTCC M 2010186。
3.一种含有权利要求2所述质粒的毕赤酵母基因工程菌株Pichia PastorisX33/ pPICZ α A- (XYN)3,由质粒 pPICZ α A-(XYN) 3 转化毕赤酵母宿主菌 Pichia Pastoris X33 后 得到。
4.权利要求3所述的基因工程酵母菌产的木聚糖酶在纸浆漂白的应用。
全文摘要
本发明提供一种耐高温耐强碱、高效稳定的木聚糖酶的基因、表达载体、生产菌株及其在纸浆漂白的用途。本发明提供的木聚糖酶基因利用密码子优化、多拷贝技术实现在毕赤酵母中的高表达；表达的木聚糖酶无纤维素酶活性，具有耐高温、耐高碱性质；该木聚糖酶可应用于麦草浆漂白应用于无元素氯(ECF)漂白工序，节省二氧化氯10％；应用于过氧化氢(OP)漂白工序，节省过氧化氢10％。
文档编号C12R1/84GK101955958SQ201010256129
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者廖超登, 林小琼, 林影, 郑穗平, 韩双艳 申请人:华南理工大学