生物工程菌株及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了生物工程菌株及其制备方法和用途，其中制备生物工程菌株的方法包括：1)以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，获得第一扩增产物和第二扩增产物；2)利用重叠基因扩增技术将第一和第二扩增产物进行连接处理；3)将连接产物经EcoRI和PstI酶切后插入质粒pK18mobsacB中形成重组质粒pK18DU1；4)将重组质粒导入E.coli S17-1；5)将重组大肠杆菌与M18G进行双亲杂交交换获得M18GU；6)将重组表达质粒pBBRphzH转入M18GU，获得生物工程菌株M18GU/pBBRphzH。该菌株能高效生产吩嗪-1-甲酰胺，且发酵效价稳定，生产成本低，适宜于大规模生产。
【专利说明】生物工程菌株及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物源农药生产【技术领域】，尤其涉及一种改进的用于生产新型微生 物源杀菌剂的工程菌株的制备及其应用。具体地，本发明涉及制备生物工程菌株的方法、生 物工程菌株在制备吩嗪-1羧酸中的用途以及制备吩嗪-1-甲酰胺的方法。
【背景技术】
[0002] 假单胞菌生物合成的吩嗪-1-羧酸，是一种重要的抗真菌物质。吩嗪-1-羧酸化 学结构中的1位羧酸基团的解离状态，与其抗菌活性的强弱密切关系。吩嗪-1-羧酸化学 结构中的1位羧酸基团经酰胺化，衍生为吩嗪-1-甲酰胺，与吩嗪-1-羧酸相比，其抗菌活 性不受使用条件的酸度值影响，从而能稳定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。同 时，吩嗪-1-甲酰胺与吩嗪-1-羧酸相比，对小鼠的急性经口毒性下降一个数量级，是一种 更为安全的生物杀菌剂。长期以来，由于假单胞菌合成吩嗪-1-甲酰胺的效率较低，生产成 本太高，难以实现工业化生产。前不久，我们利用生产吩嗪-1-羧酸的假单胞菌株M18及其 衍生的工程菌株M18G为宿主，携带能表达phzH基因、编码产生谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转 移酶（glutamine phenazine-l-carboxylic acid amidotransferase,PhzH)的重组表达质 粒pBBRphzH，在宿主中补充并添加 phzH基因的拷贝数，并在宿主中进行表达，将吩嗪-1-羧 酸转化为吩嗪-1-酰胺（具体可参见专利申请：CN201110054035. X ;PCT/CN2011/082531)。 但是，该技术所使用的出发菌株为生产吩嗪-1-羧酸的野生型菌株M18及其衍生的工程菌 株M18G。在野生型菌株M18中，发酵生产吩嗪-1-羧酸的产量仅为每升200毫克左右；在 M18衍生的工程菌株M18G中，其发酵效价也只能达到每升1500?1700毫克。由于，在野生 型菌株M18和衍生菌株M18G中，作为吩嗪-1-甲酰胺前体的吩嗪-1-羧酸产量相对地都比 较低，在优化的培养基中，吩嗪-1-甲酰胺的发酵效价只能达到每升2500?2800毫克，生 产成本仍然比较高，难以在农业生产中大规模推广应。
[0003] 因而，目前的生产吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种改进的用于高效生产微 生物源杀菌剂吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株及其制备方法和应用。
[0005] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备生物工程菌株的方法。根据 本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
[0006] 1)以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，分别利用第一引物和第二引物进行第 一 PCR扩增获得第一扩增产物，利用第三引物和第四引物进行第二PCR扩增获得第二扩增 产物，其中，所述第一扩增产物具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列，所述第二扩增产物具 有SEQ ID NO : 7所示的核苷酸序列；
[0007] 2)利用重叠基因扩增技术，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处 理，以便获得连接产物，所述连接产物具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列；
[0008] 3)将所述连接产物经EcoRI和PstI酶切后，插入质粒pK18mobsacB中，形成重组 质粒 PK18DU1 ;
[0009] 4)将所述重组质粒导入E. coli S17-1，以便获得重组大肠杆菌菌株；
[0010] 5)将所述重组大肠杆菌菌株与所述假单胞菌株M18G进行双亲杂交交换，以便获 得假单胞菌株M18GU ;
[0011] 6)将携带PhzH基因的重组表达质粒PBBRphzH转入所述假单胞菌株M18⑶，以便 获得携带PhzH基因的重组表达质粒的生物工程菌株M18⑶/pBBRphzH。
[0012] 需要说明的是，本发明的制备生物工程菌株的方法，通过定向缺失M18衍生菌株 M18G的基因组中吩嗪-1-羧酸合成基因簇（phzl)上游的5' -非编码区，构建成基因突变 菌株M18⑶，去除对吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzl表达的抑制作用，从而M18⑶菌株合成 吩嗪-1-羧酸的效率大大提高；然后将PhzH基因重组表达质粒转化入M18⑶菌株，以便 获得能够高效生产吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株，实现PhzH基因的高效表达，并将吩 嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-甲酰胺，从而能够高效地生产吩嗪-1-甲酰胺。发明人发现， 本发明的制备生物工程菌株的方法，操作简单、适于大规模生产，并且制备获得的生物工 程菌株能够有效用于吩嗪-1-甲酰胺的生产，且生产效率高，发酵效价稳定，不需要异丙 基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，生产成本低，适宜于大规模生产。
[0013] 需要说明的是，本发明所述的单胞菌株M18GU，其是通过运用无缝拼接技术制备 的。其中，本发明所采用的表达方式"无缝拼接技术"是指一种DNA片段缺失技术。通常缺 失DNA片段的技术，都需要在缺失处插入一个编码抗生素抗性的标记基因作为筛选指标， 表明该DNA区域已经缺失，以区别野生型的未缺失DNA片段的菌株，本发明构建的生物工程 菌株Μ18⑶，是通过缺失基因组中吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5' -非编码区实现的。从 理论上讲，在非编码区插入了诸如标记基因的其他序列后，将对基因表达产生难以预测的 影响，因而，不允许插入诸如标记基因的其他序列。本发明采用的DNA片段缺失技术为一种 无缝拼接法，即通过DNA序列之间的两次同源重组，所引起的抗药性改变和蔗糖致死性的 改变筛选出突变菌株，在DNA片段缺失处不需要携带通常的选择标记，直接将缺失区两端 的DNA连接，定向缺失Μ18衍生菌株M18G的基因组中吩嗪-1-羧酸合成基因簇（phzl)上 游的5'-非编码区，构建成基因突变菌株（M18GU)。由此，去除对吩嗪-1-羧酸合成基因簇 phzl表达的抑制作用，从而，M18⑶菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率大大提高。
[0014] 其中，本发明所述的"M18"菌株为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏号为CGMCC NO. 0462的一种生物农药促生拮抗菌。假单胞菌株"M18G"为 M18(CGMCC NO. 0462)的衍生菌株，其制备方法已为公知，例如可参考发表于2004年的《微 生物学报》44卷第761?765页的《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸 合成代谢的差异性调控》。相比M18，M18G的吩嗪-1-羧酸的产量获得了很大的提升，因而， 本发明在此基础上对假单胞菌株M18G进行进一步改进。
[0015] 根据本发明的实施例，phzl基因簇上游5' -非编码区可以为完整的或是部分的 5' -非编码区，所述的5' -非编码区在转录后形成的信使mRNA中，可形成一种二级结构阻 止翻译的正常进行，从而抑制了吩嗪-1-羧酸的合成。优选地，Phzl基因簇上游5' -非编 码区含有翻译起始密码子上游第335位碱基始至其上游第31碱基止的多核苷酸片段。根 据本发明的实施例，所述Phzl基因簇为铜绿假单胞菌的phzl。优选的，所述的phzl基因 簇5' -端非编码区来源于铜绿假单胞菌株PA01、PA7、LESB58、PA7、PUPa3、M18。更优选，所述 Phzl基因簇上游5' -端非编码区来源于假单胞菌株M18,其碱基序列如SEQ ID NO :1所示： [0016] Λ?：ΛΤ€Λ?α；Λ CCAtitKiAIOC ?(?(；ΠΛΤ--(? ΛΛΛΙ'ΛΟΤ?Λ Ct；t；AATt；.\CG CTGAAAGTCT 60 TCXJCGACCTC {；π：Τ{；Τ(：(；(；Λ (；(；ΓΓΛΛ(；(?ΛΛ Λ(Χ；Λ1Τ(；(；(；/\ ATCCATTACC (；AC/\(；GTTTC 120 ?ΛΛΛΛΟΛΛΛ? CCGGGATGAA ACTCCTATTG CCTTTCGAAA ATTGGAAACG ACAGGCGAAC 180 ATATGTAACG CGAAATTTCA CCCTACGTAl' ΛΛΛ?'ΛΛ--Χ'Ο CCCAGCGAAT ATCGCTCCCT 210 T/\(；CG/\GCG/\ CGAACTCCTG CGCGCCAGCG ΛΛΤΛΛ?ΧΧΛ? GCCGCGACGG ΛΛΛΛΟΤΤ?ΙΤ 300 CCGGC (SEQ ID NO： 1) 305
[0017] 根据本发明的实施例，所述第一引物和第二引物分别具有SEQ ID NO :2-3所示的 核苷酸序列，所述第三引物和第四引物分别具有SEQ ID NO :4-5所示核苷酸序列。由此，扩 增效率高。
[0018] 根据本发明的实施例，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理， 进一步包括：将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物混合，并利用DNA聚合酶LA Taq进 行第三PCR扩增，以便获得第三扩增产物；利用第一引物和第四引物进行第四PCR扩增，以 便获得第四扩增产物；将所述第四扩增产物进行纯化回收，以便获得所述连接产物。
[0019] 根据本发明的实施例，所述第三PCR扩增的反应程序为：95°C 3min ;95°C 30s， 50°C lmin，72°C lmin，10个循环；72°C lmin，所述第四PCR扩增的反应程序为：95°C 3min ; 95°C 30s，50°C lmin，72°C lmin，25 个循环；72°C lmin。由此，连接准确、效率高。
[0020] 需要说明的是，本发明所述的"携带phzH基因的重组表达质粒pBBRphzH"，能在产 吩嗪-1-羧酸的工程菌株中表达PhzH基因，其编码产物谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶能 将吩嗪-1-羧酸酰胺化为吩嗪-1-甲酰胺，具体可参考专利申请PCT/CN2011/082531。
[0021] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种生物工程菌株，其是由前面所述 的制备生物工程菌株的方法制备获得的。发明人发现，本发明的生物工程菌株生产吩 嗪-1-甲酰胺的效率尤其高，发酵效价稳定，且不需要异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖 苷的诱导，生产成本低，适宜于大规模生产。具体地，利用本发明的生物工程菌株生产吩 嗪-1-甲酰胺，每升发酵液中含吩嗪-1-甲酰胺5000?5500毫克，相对于现有技术（例如， 专利申请：CN201110054035.X ;PCT/CN2011/082531中所采用的技术方案）产量提高了 1倍 或1倍以上，并且生产成本大大降低。
[0022] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的生物工程菌株在制备吩 嗪-1-甲酰胺中的用途。
[0023] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备吩嗪-1-甲酰胺的方法。根据 本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的生物工程菌株进行活化，其中，所述 生物工程菌株是通过前面所述的制备生物工程菌株的方法制备获得的；以及将活化的生物 工程菌株进行种子扩大培养，以便获得吩嗪-1-甲酰胺。发明人惊奇地发现，利用本发明 的方法，能够高效地生产吩嗪-1-甲酰胺，其每升发酵液中含吩嗪-1-甲酰胺可达5000? 5500毫克，相对于现有技术（例如，专利申请：CN201110054035.X ;PCT/CN2011/082531中 所采用的技术方案）产量提高了 1倍或1倍以上，生产成本大大降低。并且，利用本发明的 方法制备获得的发酵液中除了包含吩嗪-1-甲酰胺外，还含有微量的杀菌活性成分藤黄绿 菌素，因而可以直接用作杀菌剂，且效果更加突出。
[0024] 根据本发明的实施例，所述活化进一步包括：将所述生物工程菌株接种于甘油 培养基平板，在26-30°C下，活化生长20-24小时；以及在所述甘油培养基平板上划菌块， 于26-30°C下活化10-12小时，其中，所述甘油培养基中各组分的重量百分比为：蛋白胨 L 8-2. 2%，甘油 L 3-1. 7%、硫酸镁 0· 05-0. 10%、磷酸二氢钾 0· 01-0. 05%、琼脂 L 2-1. 5%、 余量为水，PH6. 8-7. 2。由此，活化效果好，有利于后续生物工程菌株的扩大培养。
[0025] 根据本发明的实施例，所述种子扩大培养进一步包括：将所述活化的生物工程菌 株，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26-28°C的摇床中振荡 培养11小时，摇床转速为160-180转/分；以及然后，转接到含有65毫升的产素培养液、 体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，其 中，所述甘油培养液中各组分的重量百分比为：蛋白胨1. 8-2. 2%、甘油1. 3-1. 7%、硫酸镁 0. 05-0. 10%、磷酸二氢钾0. 01-0. 05%、余量为水，pH6. 8-7. 2,所述产素培养液中各组分的 重量百分比为：黄豆粉6. 5-8. 0%、玉米浆1. 0-2. 0%、甘油1. 0-2. 0%、葡萄糖0. 5-1. 5%、 硝酸钾0. 8-1. 8%、余量为水，pH7. 5-8. 0。由此，有利于生物工程菌株的扩大培养，从而有 利于目的产物吩嗪-1-甲酰胺的产出。
[0026] 需要说明的是，本发明利用改进的生物工程菌株M18⑶/pBBRphzH生产吩嗪-1-甲 酰胺，在保留了原先利用生物工程菌株M18G/pBBRphzH生产吩嗪-1-酰胺（可参见专利申 请：CN201110054035. X ;PCT/CN2011/082531)的各项优点外，生产效率整整提高了 1倍或1 倍以上,生产成本大大降低。
[0027] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中 ：
[0029] 图1显示了根据本发明实施例，制备假单胞菌株M18GU的方法的流程示意图，其中，
[0030] 图IA显示了构建重组质粒pK18DUl的流程示意图；
[0031] 图1B、C显示了重组质粒pK18DUl与菌株M18G通过两轮DNA同源重组交换制备假 单胞菌株M18GU的流程示意图。
【具体实施方式】
[0032] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实 施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的， 均按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的 《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注 明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
[0033] -般方法：
[0034] 需要说明的是，本发明实施例中制备假单胞菌株M18GU的方法的一般过程为：
[0035] 设计两对引物，第一引物（UA)和第二引物（UB)，第三引物（UC)和第四引物（UD); 然后以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引物，分别扩 增phzl基因簇5'-非编码区两侧的片段。利用重叠基因扩增技术，将上述两个片段变性和 复性连接成为长片段。运用常规技术，将回收的长度为IlHbp的DNA片段经限制性内切酶 EcoRI和PstI处理后，插入质粒pK18mobsac中，形成重组质粒pK18DUl (如图IA所示）。
[0036] 然后，如图IB和图IC所示，将重组质粒pK18DUl导入E. coli S17-lUPir)，再 转入M18G中，运用双亲杂交交换技术，通过两轮DNA之间的同源重组交换，制备并筛选获 得工程菌株M18GU。其中，筛选过程为：在含有壮观霉素和卡那霉素的平板中选出单交换的 菌落，然后在含有壮观霉素和5%蔗糖的平板中选出双交换的菌落，最后，所获得的菌落为 M18GU菌株。
[0037] 实施例1
[0038] 1、根据上述一般方法，构建生物工程菌株M18⑶，具体步骤为：
[0039] 1. 1、扩增phzl基因簇5' -非编码区两侧的片段
[0040] 设计两对引物，引物的核苷酸序列如下：
[0041] 正向（UA) :5, -AAGAATTCCAGCAGGCGCATCAGTC-3' (SEQ ID N0:2)
[0042] 反向（UB) :5, -CCAGGTATGGATTGCATAAAACACAGAA-3'（SEQ ID N0:3)
[0043] 正向（UC) :5, -TATGCAATCCATACCTGGAGAGCCCTCT-3'（SEQ ID N0:4)
[0044] 反向（UD) :5，-ATCTGCAGTGCTCCTTGGCGGTAGAT-3' (SEQ ID NO:5)
[0045] 序列中下划线为限制性内切酶EcoRI和PstI的酶切位点。上述物均委托上海生 工生物有限公司合成。
[0046] 然后，以假单孢菌株M18G基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引 物，分别扩增Phzl基因簇5'-非编码区两端的片段，扩增产物通过1 %琼脂糖电泳检测，分 别回收长度为572bp和560bp的片段，基因片段经核苷酸测序验证为准确。具体地，回收的 扩增产物序列如下：
[0047] 572bp的扩增产物：
[0048] AAGAATICCA GCAG(；C(；C：AT CAGTCCiATGG ATGC(；CTC(；(； (：ΛΤ€(；(；ΛΛ(：(； GACCWXiGCG 60 GCCAGCCTCT CC.'I'CGCIGTC GATCCCGCTC TCGATCAGA Γ CGGCCA(X：C：(： (；Λ(：；(；σ；(：(7ΓΛ 120 Γ,Γ{；ΛΟ；? ΛΓ,Λ (：(；ΓΛΛ('(：Γ,Γ,Λ (TKX'.ATTCC ΓΓ(Η；ΤΛΛ(：Λ·\ ΠΤ(；ΤΛΤ(：ΛΛ ΛΤΤΛ(：Γ,(：(；(：Λ 180 GC.WCAAGAT ?+?:ΛΛΤΙ;νΠ + (:Λ?Π?Τ?Λ丨 KI'arrCGI+ ?兄 GAAGTACCCA .\€,(：(',(：1Γ!'Λ'Γ TTCGCACTTC TTGCC(：(；CT(： C,GC(；AG;/\AT /\CC(；CAa>/\(： 300 Accccanit Λ?τα;ι；ΛΛα --(；λι;λλλλλ λ ιΛα,αca γ ααχχκ?Λ?Γ aucgctccct ：Μ5〇 (?(；Λ?(：π'{ΠΤ <；(：(；(；ΛΛΛ{'ΛΑ (：(：(：Τ(；{；：\ΛΙ'Γ ΤΤΓΓΛΛΓΓ(；(： (：?(；ΤΤΠ 'Λ(；^ (Κ.'Π?ΤΤΠΤ 120 ?；[：(',?Λ(：(：(；ΛΛ ΛΙ'-ΛΑΤΛΛΛΛ? ΤΛ?：ΛΛ(：!?'(；(； CTAt：,l\(；(：TC： CGGCATKiCA (；(：,ΛΛ(；(；ΛΤ(：Λ 180 (',CU ACCAAT CCCGCAIACC Π Cl CTGGCA C(：T.\CC,\GAT CITGTAGTTG AGCCGGTACG δ 10 Λ(：.αΠΤ€Τ(；Τ 0?Τ?ΤΛ'[(；(：Λ ATCCATACCT' (：,(； -SEQ ID N0:6) 572
[0049] 560bp的扩增产物：
[0050] TATGCAATCC ATACCTGGAC AGCCCTCICG GAGCCGGCGC AIGAACGGTC ACCCGTACAC 60 GGAAACACCC CTCGACATCG AGCGTCTGCG GCGCCTGAAT CGCGCCACGG TGGAGCGCTA 120 CAT'GGCAATG AAGGGGGCCG AACGGTTACA GCGGCACAGC CTCiTTCGT'CG AGGACGGCTG 180 CGCCGGCAAC TGGAa:ACGG ΛΛΛ(Χ(Μ(:(?\ Λ〇αΧ.:ΤαΓΙΤ CAGGCGGCTC GCCGAGTGGC TCGAGCGCTG CTTCCCCGAC TGGGAGTGGC ACAACGTGCG 300 CATCTTCGAi； ACCCiAGiJATC CGAACCACTT CTGGGTCGAG TGCGACGGCC GCGGCAAGGC 860 GCTGGTCCCG GGGTATCCGC AGGGCTATTG CGAGAACCAC TACATCCATT CCTTCCAACT 420 CGAGAACGGC €(Κ.；ΛΤΛΛΛΛ(： GTAATCGCGA C,T1'CATGAAC CCGATACAGA AAC1't；C(.；TCC ?80 ΛΤΤ(；(；(；ΛΛΤΛ (；(：(；(；?Τ(：(：{；(： ΛΛΛΤΛΛΛΛ?Χ； Τ(；Λ(：('.(；ΤΛΤΤ (：(；(：Λ(?Τ(；ΛΛ Τ(；Λ(：ΛΤ(；ΤΛ(： δ Η) CCCCAAGGAC CACT(；CAG,-\T (SEQ ID ΝΟ:7) 560
[0051] 其中，所述假单胞菌M18G基因组DNA的制备利用AxyPrep细菌基因组DNA试剂盒 进行，基因片段的回收利用Axygene DNA凝胶回收试剂盒进行，均由爱思进生物技术（杭 州）有限公司提供，产品目录号分别为AP-MN-BT-GDNA-4和AP-GX-50 ;所述基因扩增反应 的条件以及琼脂糖电泳，分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出 版的《分子克隆实验指南（第三版）》，第8章第611?618页和第5章第387?400页中 所述的方法进行。其中，所使用的DNA聚合酶LA Taq和基因扩增试剂盒，购自TAKARA公司 上海代理公司，产品目录号：DRR002AG。琼脂糖购自GENE TECH公司上海代理公司。基因片 段（PhzH及其5'端的非编码区）的核苷酸测序验证委托上海英骏生物技术有限公司完成， 测序结果证实基因片段分别含SEQ ID NO: 1的两侧序列。
[0052] 1. 2、利用重叠基因扩增技术，将上述两个片段连接成IlHbp的长片段
[0053] 重叠基因扩增分两步进行：
[0054] 第一步，将上述片段SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7混合。因为两个片段的末端有 18bp序列完全相同，在变性后退火时有一定几率配对，可以互为引物和模板，利用DNA聚合 酶LA Taq，将两个片段连接。反应体系如下： Buffer 12.5μ1 ?Ν--1 2μΙ SEQ IDNO:6 Ιμ?
[0055] SEQ ID ΝΟ:7 Ιμ? LA Taq 0,2μ1 H2O 8,3μ1
[0056] 反应程序为：
【权利要求】
1. 一种制备生物工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，分别利用第一引物和第二引物进行第一 PCR 扩增获得第一扩增产物，利用第三引物和第四引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物， 其中，所述第一扩增产物具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列，所述第二扩增产物具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列； 2) 利用重叠基因扩增技术，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理， 以便获得连接产物，所述连接产物具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列； 3) 将所述连接产物经EcoRI和PstI酶切后，插入质粒pK18mobsacB中，形成重组质粒 PK18DU1 ； 4) 将所述重组质粒导入E. coli S17-1，以便获得重组大肠杆菌菌株； 5) 将所述重组大肠杆菌菌株与所述假单胞菌株M18G进行双亲杂交交换，以便获得假 单胞菌株M18GU ; 6) 将携带phzH基因的重组表达质粒pBBRphzH转入所述假单胞菌株M18⑶，以便获得 携带phzH基因的重组表达质粒的生物工程菌株M18⑶/pBBRphzH。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物分别具有SEQ ID NO :2-3所示的核苷酸序列，所述第三引物和第四引物分别具有SEQ ID NO :4-5所示核 苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产 物进行连接处理，进一步包括： 将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物混合，并利用DNA聚合酶LA Taq进行第三 PCR扩增，以便获得第三扩增产物； 利用第一引物和第四引物进行第四PCR扩增，以便获得第四扩增产物； 将所述第四扩增产物进行纯化回收，以便获得所述连接产物。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第三PCR扩增的反应程序为： 95°C 3min ;95°C 30s，5(TC lmin，72°C lmin，10 个循环；72°C lmin， 所述第四PCR扩增的反应程序为：95°C 3min ;95°C 30s，50°C lmin，72°C lmin，25个循 环；72°C lmin。
5. -种生物工程菌株，其是由权利要求1-4任一项所述的方法制备获得的。
6. 权利要求5所述的生物工程菌株在制备吩嗪-1-甲酰胺中的用途。
7. -种制备吩嗪-1-甲酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤： 将权利要求5所述的生物工程菌株进行活化，其中，所述生物工程菌株是通过权利要 求1-4任一项所述的方法制备获得的；以及 将活化的生物工程菌株进行种子扩大培养，以便获得吩嗪-1-甲酰胺。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化进一步包括： 将所述生物工程菌株接种于甘油培养基平板，在26-30°C下，活化生长20-24小时；以 及 在所述甘油培养基平板上划菌块，于26-30°C下活化10-12小时， 其中，所述甘油培养基中各组分的重量百分比为：蛋白胨1. 8-2. 2%，甘油1. 3-1. 7%、 硫酸镁 〇· 05-0. 10%、磷酸二氢钾 0· 01-0. 05%、琼脂 L 2-L 5%、余量为水，ρΗ6· 8-7. 2。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子扩大培养进一步包括： 将所述活化的生物工程菌株，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角 瓶中，在26-28°C的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为160-180转/分；以及 然后，转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培 养，温度和转速不变，发酵时间为72小时， 其中，所述甘油培养液中各组分的重量百分比为：蛋白胨1. 8-2. 2%、甘油1. 3-1. 7%、 硫酸镁 〇· 05-0. 10%、磷酸二氢钾 0· 01-0. 05%、余量为水，ρΗ6· 8-7. 2， 所述产素培养液中各组分的重量百分比为：黄豆粉6. 5-8. 0%、玉米浆1. 0-2. 0%、甘 油 L 0-2. 0%、葡萄糖 0· 5-L 5%、硝酸钾 0· 8-L 8%、余量为水，ρΗ7· 5-8. 0。
【文档编号】C12R1/38GK104263748SQ201410333642
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】许煜泉, 刘海明, 周泉, 周万平 申请人:武汉汉申生物科技有限责任公司