一种提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法
【专利摘要】本发明公开一种提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法。该方法是从新鲜脐血中分离纯化脐血源外向生长内皮细胞，与脐带来源的间充质干细胞混合培养，培养基为含体积分数10％胎牛血清+EGM-2BulletKit完全培养基。通过本发明的方法，以达到提高其增殖效率及成血管能力的目的。本发明的方法应用后由于间充质干细胞的免疫下调作用和治疗总细胞量的扩充，减少了由于免疫反应损失细胞的比例，保证治疗效果，增强了脐血源外向生长内皮细胞的应用可能性。间充质干细胞还具有辅助维持血管的能力，为长期治疗的效果提供了保证。本发明的主要使用范围是应用于脐血外向生长内皮细胞在血管修复治疗、组织工程等方面。
【专利说明】一种提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞治疗领域，特别涉及一种提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及 性能的方法。
【背景技术】
[0002] 外向生长内皮细胞（outgrowth endothelial cell, 0EC)，属于血管内皮前体类 细胞，体外培养时呈铺路石样生长，形成细胞单层，与成熟内皮细胞形态一致，但其具有快 速扩增和生成血管的能力，使之成为细胞治疗领域的新宠，研究者们希望能将其用于心脑 血管疾病、心脏病、肢体缺血等疾病的治疗。Jumi Kim等（Jumi Kim，Young-Joo Jeon. Comparative proteomic analysis of endothelial cells progenitor cells derived from cord blood-and peripheral blood for cell therapy. Biomaterials. Volume34, Is sue6, February2013, Pagesl669 - 1685.)比较了胳血外向生长内皮细胞和外周血外向生长 内皮细胞的差异，发现无论是体外成血管能力还是动物的体内缺血损伤的修复实验，脐血 外向生长内皮细胞都优于外周血。David A等（David A. Ingram, Laura E. · Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood blood, 2004, 104:2752-2760.)也报道脐血中外向生长内皮细胞体 外培养时表现出更高的扩增能力，能够在长期培养中保持前体细胞特性。
[0003] 虽然脐血外向生长内皮细胞相对外周血外向生长内皮细胞有相当多的好处，但是 由于其适应症多为退行性疾病，类似心脑血管疾病、糖尿病足等，需要长期多次的输注，细 胞量就成为了其应用的瓶颈。脐血外向生长内皮细胞原代诱导率不高，低密度下尤其生长 缓慢，细胞治疗需要的细胞量比较大，如何增加细胞量，同时增强其生成血管的能力是临床 前研究的主要方向。
[0004] 间充质干细胞已证明在增殖过程中分泌大量细胞因子，体内可以促进血管再生、 增加血管强度，现广泛用于糖尿病足等再生医学辅助治疗领域。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种提高脐血源外向生 长内皮细胞增殖能力及性能的方法。通过间充质干细胞和脐血外向生长内皮细胞混合培 养，提高脐血外向生长内皮细胞的增殖效率及成血管能力。该方法采用可靠的供体，经分 离、培养得到干细胞产品。制备过程简单、可靠、重复性好。间充质干细胞和脐血外向生长 内皮细胞共培养，提高脐血外向生长内皮细胞低密度下的增殖能力，同时可以充分利用间 充质干细胞的旁分泌作用促进脐血外向生长内皮细胞成血管。实验证明在胞外基质不足以 支撑血管时，间充质干细胞可以辅助支撑血管，维持血管形态。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提高脐血源外向生长内皮细胞增殖能 力及性能的方法，包括如下步骤：
[0007] 将间充质干细胞和内皮细胞混合培养，即能提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力 及性能；其中所述的间充质干细胞为健康人的脐带源间充质干细胞，所述内皮细胞为健康 人脐血源外向生长内皮细胞，以下简称内皮细胞。
[0008] 所述的提高脐血源外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，具体包括如下步 骤：
[0009] (1)间充质干细胞的分离和原代培养：将脐带剔除血管，去除残余血液，剥离出沃 顿胶，剪成1?2_ 2的组织块，平铺在T25培养瓶底，加入1?2mL间充质干细胞培养基 (L0NZA ;以下简称间充质干细胞培养基），培养7?11天，分离出原代间充质干细胞；
[0010] (2)间充质干细胞的传代：将步骤（1)获得的原代间充质干细胞传代，质量分数 0. 25%胰酶消化，间充质干细胞培养基终止消化，离心去上清，留取细胞沉淀，用间充质干 细胞培养基重悬，接种在T75培养瓶中培养，按1:3的比例传代，3?4天传代一次；
[0011] (3)内皮细胞的分离和原代培养：新鲜脐血密度梯度离心分离出单个核细胞，所 得单个核细胞重悬于内皮细胞培养基中，在胶原预铺板的6孔板中培养10?20天后得到 原代内皮细胞；
[0012] (4)内皮细胞P1传代：在步骤⑶获得的原代内皮细胞集落细胞数大于1000时， 传代，37°C预热的质量分数0. 25%胰酶消化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离 心去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培养基重悬，接种在胶原预铺板的6孔板中培养；
[0013] (5)内皮细胞P2传代：P1细胞70%融合后传代，37°C预热的质量分数0· 25%胰酶 消化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培 养基重悬，接种在胶原预铺板的T25培养瓶中培养；
[0014] (6)内皮细胞P3传代：P2细胞70 %融合后传代，37°C预热的质量分数0· 25 %胰酶 消化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培 养基重悬，接种在胶原预铺板的T75培养瓶中培养；
[0015] (7)内皮细胞与间充质干细胞混合培养：将内皮细胞与间充质干细胞分别计数， 以细胞个数1 :1的比例混合，以每瓶10mL的量接种在胶原预铺板的T75培养瓶中培养，即 能提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能。
[0016] 步骤（1)中所述的培养的条件优选为置于37°C，饱和湿度，体积分数5%二氧化碳 培养箱中培养；
[0017] 步骤⑵中所述的离心的条件优选为离心时间5min，离心力500g，离心加速度7g， 减速度7g，温度20°C ;
[0018] 步骤⑴和⑵中所述的间充质干细胞培养基优选为L0NZA公司的 TheraPEAK?MSCGM-CD?Medium ；
[0019] 步骤（3)中所述的新鲜脐血优选应采用24小时之内新鲜脐血；
[0020] 步骤（3)中所述的新鲜脐血密度梯度离心分离出单个核细胞的条件优选为新鲜 脐血与生理盐水体积比1 :1稀释后，经Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，离心时间 25min，尚心力500g，尚心加速度lg，减速度lg，温度20 C ;尚心结束后，取白?旲层（白?旲层 在血浆层和分离液层之间）；加入3倍体积的生理盐水，洗涤一次，离心力800g，离心时间 8min，离心加速度7g，减速度7g，收集细胞沉淀，30mL的生理盐水再洗一次，离心力200g，离 心时间lOmin，离心加速度4g，减速度4g，收集细胞沉淀，即为单个核细胞；
[0021] 步骤（4)、（5)和（6)中所述的传代优选按1 : (3?5)比例进行传代；更优选为1 : 3 ；
[0022] 步骤（4)、（5)和（6)中所述的离心的条件优选为离心时间4?8min，离心力 400g?800g，离心加速度7g，减速度7g，温度20°C ;更优选为离心时间5min，离心力500g， 离心加速度7g，减速度7g，温度20°C ;
[0023] 步骤（3)?（7)中所述的内皮细胞培养基优选为体积分数10%胎牛血清 +EGM-2BulletKit 完全培养基（L0NZA 公司）
[0024] 步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质混合培养，接种时总细胞密度优选为 3 X 104 ?5 X 104 个 /mL ;更优选为 4 X 104 个 /mL ;
[0025] 步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，内皮细胞代数优选为3? 6代，更优选为3代；
[0026] 步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，间充质干细胞代数优选为 4代以内，更优选为2代；
[0027] 步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，培养时间优选不超过7天， 更优选为3?4天；
[0028] 步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，混合细胞可在一代内获得 5?6倍的扩增，有效减少传代次数，避免传代时损伤细胞和引起分化；
[0029] 步骤（7)中所述的混合培养后的细胞在matrigel中表现出更好的成血管能力；
[0030] 步骤（7)中所述的混合培养后的细胞在去除培养基中外源因子的条件下，在 matrigel中血管保持的时间更长；
[0031] 步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，两种细胞在混合前的特征 为：
[0032] ①内皮细胞铺路石样生长，细胞形态均一，高密度培养时增殖迅速；⑶309、⑶34 阳性表达；⑶105>80% ;在matrigel中能迅速成血管；在培养到5?6代后进入分化，⑶34 表达量增加，增殖能力减弱，在matrigel中成血管能力减弱；
[0033] ②脐带源间充质干细胞成纤维样生长，细胞形态均一，增殖迅速，流式表型为 CD105>90 %, CD90>90 %, CD73>90 %, CD45〈2 %, CD34〈2 %。
[0034] 步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，两种细胞在混合后的特征 为：增殖迅速，在matrigel中能迅速成血管，流式表型⑶105>80%。
[0035] 本发明的机理是：间充质干细胞分泌大量血管生成相关细胞因子，有助于内皮细 胞的增殖和血管的形成，例如VEGF-A、VEGF-D、bFGF等，并且脐带间充质干细胞在分泌细胞 因子促进血管生成方面优于骨髓间充质干细胞。外向生长内皮细胞是一种密度依赖形的细 胞，增殖需要一定的细胞数量和生长因子含量，脐血外向生长内皮细胞由于细胞量的制约 而不能有效用于临床，间充质细胞刚好可以提供这样的条件，作为一种基质细胞加速脐血 外向生长内皮细胞的生长。
[0036] 同时，间充质干细胞作为一种基质细胞支持内皮细胞血管形成，增加血管形成的 数量，特别是在胞外基质不能够支撑所形成的血管时，间充质细胞可以起到支撑的作用，辅 助维持血管形态。
[0037] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0038] (1)本发明将间充质干细胞在短时间内旁分泌促进血管再生的能力利用起来，首 先促进了脐血外向生长内皮细胞迅速增殖，缩短应用所需要的时间，增加细胞数量；其次增 强细胞成血管能力，在matrigel中能迅速成血管，提高治疗效果；再者，间充质干细胞具有 辅助维持血管的能力，为长期治疗的效果提供了保证；此外，本发明得到的混合细胞的流式 表型 CD105>80%。
[0039] (2)在细胞治疗中，细胞总量是一个很重要的问题，外源细胞进入人体会引发一定 程度的免疫反应，这些免疫反应导致细胞量减少。而本发明的方法应用后扩充了治疗总细 胞量，减少由免疫反应损失细胞的比例。同时由于间充质干细胞的免疫下调作用，进一步减 少了损失的细胞量，保证治疗效果
[0040] (3)对于患者来说，自体外周血的外向生长内皮细胞活性一般较差，异体细胞来源 虽然丰富但免疫原性较强，不适合细胞治疗应用。脐血外向生长内皮细胞经大量文献证实， 其治疗前景是优于外周血来源的，但是由于来源有限，导致细胞量受到限制而难以进入应 用，本发明的方法在扩充了总细胞量、增强其作用能力的同时减少了治疗中的损耗。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1是倒置显微镜下观察第2代间充质干细胞的形态图。
[0042] 图2是流式细胞仪检测第2代间充质干细胞的表面抗原的表达情况图。
[0043] 图3是倒置显微镜下观察第3代内皮细胞的形态图。
[0044] 图4是流式细胞仪检测第3代内皮细胞的表面抗原的表达情况图。
[0045] 图5是第3代、4代、5代和6代内皮细胞的成血管实验图。
[0046] 图6是倒置显微镜下观察第2代间充质干细胞和第3代内皮细胞共培养的形态 图。
[0047] 图7是成血管实验图；其中，图A为第2代间充质干细胞和第3代内皮细胞共培养 后的混合细胞成血管实验图；图B为内皮细胞成血管实验图；图C为间充质干细胞成血管 实验图。
[0048] 图8是流式细胞仪检测实施例5混合组细胞的⑶105表达情况图。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0050] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制 造厂商所建议的实验条件。
[0051] 间充质干细胞培养基为L0NZA公司的TheraPEAKTMMSCGM-CD?Medium ;
[0052] 内皮细胞培养基为体积分数10 %胎牛血清+EGM-2BulletKit完全培养基， EGM-2BulletKit 购自 L0NZA 公司。
[0053] 实施例1
[0054] 脐血和脐带标本为通过无菌操作，由健康产妇娩出的胎盘获取。经检测乙型肝炎、 丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、TORCH检测、支原体、衣原体、G-6TO和地贫等均阴性。标 本采集后运回血库过程保持4?8°C运输条件。按照以下方法处理。
[0055] 1、脐带间充质干细胞的制备
[0056] 从健康人的脐带组织中提取间充质干细胞，获取的间充质干细胞进行体外培养、 扩增。原代细胞收集后按1 :3的比例进行传代培养，当细胞铺满瓶底约80%密度时，利用 胰酶进行消化、收集，按相同的比例进行传代，最多传代培养至第3代，收集第3代的细胞， 此时收集的细胞生物学性状稳定，细胞活性好，增殖能力强。具体过程如下：
[0057] 1)无菌采取健康人的脐带；
[0058] 2)去掉脐带里的血管和外层羊膜，留取沃顿胶质；
[0059] 3)将脐带组织剪切成1?2cm2的小块。
[0060] 4)将剪切后的小块接种T25的培养瓶中，加入1?2mL间充质培养基，置于37°C， 饱和湿度，体积分数5%二氧化碳培养箱（Thermo公司，美国）中培养；
[0061] 5)经过7天后，细胞换液，3?4天后细胞可以传代。
[0062] 6)利用质量分数0. 25%的胰酶（GIBC0公司，美国）进行消化，收集细胞，接种在 T25的培养瓶中传代培养。
[0063] 7)当细胞铺满瓶底约80 %密度时，利用质量分数0. 25%的胰酶进行消化，收集细 胞。
[0064] 2、脐血外向生长内皮细胞的制备
[0065] 从24小时内的新鲜健康人脐血中获取单个核细胞，于内皮细胞培养基中培养至 P1代，具体过程如下。
[0066] 1)生理盐水与50mL新鲜脐血1:1的比例稀释，混合均匀后，加到淋巴细胞分离液 上，进行单个核细胞的分离，离心时间25min，离心力500g，离心加速度lg，减速度lg，温度 20。。。
[0067] 2)离心结束后，取白膜层（白膜层在血浆层和分离液层之间）。加入3倍体积的 生理盐水，洗涤一次,离心力800g，离心8min。
[0068] 3)收集细胞沉淀，用30mL的生理盐水再洗一次，离心力200g，离心时间lOmin，离 心加速度4g，减速度4g，收集细胞沉淀，即得单个核细胞。
[0069] 4)将脐血单个核细胞以1 X 105个/mL接种在胶原预铺板的6孔板中，加入2mL内 皮细胞培养基/孔。
[0070] 5)第5天将未贴壁细胞弃去，3天换液一次直到发现铺路石样细胞集落。继续培 养4天左右即可收集细胞。
[0071] 6)P1传代：利用37°C预热的质量分数0. 25%的胰酶进行消化，内皮细胞培养基终 止消化，收集细胞悬液，离心，离心时间5min，离心力500g，离心加速度7g，减速度7g，温度 20°C，去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培养基重悬，接种在胶原预铺板的6孔板中培养。
[0072] 7) P2传代：P1细胞70 %融合后，利用37°C预热的质量分数0. 25 %的胰酶进行消 化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心，离心时间5min，离心力500g，离心加速 度7g，减速度7g，温度20°C，去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培养基重悬，接种在胶原预 铺板的T25培养瓶中培养。
[0073] 8) P3传代：P2细胞70 %融合后，利用37°C预热的质量分数0. 25 %的胰酶进行消 化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心，离心时间5min，离心力500g，离心加速 度7g，减速度7g，温度20°C，去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培养基重悬，接种在胶原预 铺板的T75培养瓶中培养。
[0074] 3、间充质干细胞和内皮细胞的鉴定
[0075] 1)间充质干细胞的鉴定通过以下方法
[0076] a)间充质干细胞的形态学分析及细胞计数：将培养至第2代的细胞，在倒置显微 镜观察细胞状态，并拍照。
[0077] b)流式细胞仪的表型测定：取第2代细胞，经质量分数0. 25%胰酶消化收集后，生 理盐水离心洗涤2次。同型对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE (BD公司，美国），检测管分别 加入鼠抗人 CD105-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD45-FITC、CD34-PE(BD 公司，美国）各 5μ L。 室温避光孵育30min，流式细胞仪（Fascalibur，BD公司，美国）检测。
[0078] 2)内皮细胞的鉴定通过以下方法
[0079] a)内皮细胞的形态学分析及细胞计数：将P3代培养至第2天的细胞，在倒置显微 镜观察，并拍照。消化传代过程中取微量细胞悬液，计数细胞数量。
[0080] b)流式细胞仪的表型测定：将第3代培养的细胞，消化传代过程中取足量细胞悬 液，经离心收集后，生理盐水离心洗涤2次。同型对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE，检测管分 别加入鼠抗人CD309-PE、CD34-PE、CD105-PE (BD公司，美国）各5 μ L。室温避光孵育30min， 流式细胞仪（Fascalibur，BD公司，美国）检测。
[0081] c)成血管实验鉴定融解matrigel (BD公司，美国），用预冷枪头将已完全融 解的matrigel加入预冷的的96孔板，每孔40 μ L，37?孵育30?60min。收获内皮细胞， 重悬于EBM-2基础培养基（L0NZA公司），细胞密度5 X 105个/mL，加入96孔板，每孔加入 5〇1^，371：培养1811，观察血管形成效果。
[0082] 3)细胞鉴定结果：
[0083] 倒置显微镜下观察第2代间充质干细胞形态较单一，长梭形细胞多见，少量的星 形细胞，圆形细胞极少。细胞低密度时长成扁平单层细胞，细胞生长密度增加时，细胞形态 变得细长，形态类似成纤维细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长（见图1)。经流式细胞仪 (Fascalibur，BD公司，美国）检测显示，细胞表面抗原CD105、CD90、CD73阳性表达率达到 95%以上，⑶45、⑶34阳性表达率2%以下（见图2)。综上所述，按照本发明专利方法制备 出的间充质干细胞纯度高，活性好，符合要求。
[0084] 倒置显微镜下观察第3代（P3代）内皮细胞形态较单一，铺路石样生长。细胞低 密度时呈集落生长，传代后集落不明显（见图3)。经流式细胞仪检测显示，细胞表面抗原 ⑶309、⑶34阳性表达，⑶105阳性表达率达到80%以上（见图4)。经成血管实验，本申请 所获得内皮细胞在3代到六代均能稳定成血管（见图5)。6代以后细胞增殖速度下降，8? 9代后不再增殖。综上所述，按照本发明专利方法制备出的内皮细胞活性好，符合要求。
[0085] 4、该实验重复3次，每次均后续进行实施例2实验。
[0086] 实施例2
[0087] 参照实施例1的方法，将收集到的内皮细胞以内皮细胞培养基调整密度到IX 105 个/mL，标为细胞悬液A ;将收集到的间充质干细胞以内皮细胞培养基调整密度到1 X 105个 /mL，标为细胞悬液B，取细胞悬液A和细胞悬液B各2mL加入到6mL内皮细胞培养基中，即 混合组。
[0088] 同时设内皮细胞组为0EC组，间充质干细胞组为MSC组，0EC组取细胞悬液A2mL加 入到8mL内皮细胞培养基中。MSC组取细胞悬液B2mL加入到8mL内皮细胞培养基中。
[0089] 3组分别加入到胶原预铺板的T75培养瓶中培养。
[0090] 该实验重复3次，每次实验均按照实施例3、实施例4和实施例5进行结果分析。
[0091] 实施例3
[0092] 参照实施例2的方法，4天后收获细胞，对收获的细胞进行细胞计数，对比3组细胞 量，用以下公式计算其增殖倍数。
[0093] 增殖倍数=收获细胞量/接种细胞量
[0094] 结果见表1 :混合组细胞增殖率较内皮细胞组和间充质干细胞组更大，差异有统 计学意义，达到本申请快速扩增的要求。
[0095] 表 1
[0096]
【权利要求】
1. 一种提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征在于包括如下步 骤： 将间充质干细胞和内皮细胞混合培养，即能提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性 能；其中所述的间充质干细胞为健康人的脐带源间充质干细胞，所述内皮细胞为健康人脐 血外向生长内皮细胞。
2. 根据权利要求1所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于包括如下具体步骤： (1) 间充质干细胞的分离和原代培养：将脐带剔除血管，去除残余血液，剥离出沃顿 胶，剪成1?2_2的组织块，平铺在T25培养瓶底，加入1?2mL间充质干细胞培养基，培 养7?11天，分离出原代间充质干细胞； (2) 间充质干细胞的传代：将步骤（1)获得的原代间充质干细胞传代，质量分数0. 25% 胰酶消化，间充质干细胞培养基终止消化，离心去上清，留取细胞沉淀，用间充质干细胞培 养基重悬，接种在T75培养瓶中培养，按1:3的比例传代，3?4天传代一次； (3) 内皮细胞的分离和原代培养：新鲜脐血密度梯度离心分离出单个核细胞，所得单 个核细胞重悬于内皮细胞培养基中，在胶原预铺板的6孔板中培养10?20天后得到原代 内皮细胞； (4) 内皮细胞P1传代：在步骤（3)获得的原代内皮细胞集落细胞数大于1000时，传代， 37°C预热的质量分数0. 25%胰酶消化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心去上 清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培养基重悬，接种在胶原预铺板的6孔板中培养； (5) 内皮细胞P2传代：P1细胞70%融合后传代，37°C预热的质量分数0.25%胰酶消 化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培养 基重悬，接种在胶原预铺板的T25培养瓶中培养； (6) 内皮细胞P3传代：P2细胞70%融合后传代，37°C预热的质量分数0.25%胰酶消 化，内皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心去上清，留取细胞沉淀，用内皮细胞培养 基重悬，接种在胶原预铺板的T75培养瓶中培养； (7) 内皮细胞与间充质干细胞混合培养：将内皮细胞与间充质干细胞分别计数，以细 胞个数1 :1的比例混合，接种在胶原预铺板的T75培养瓶中培养，即能提高脐血外向生长内 皮细胞增殖能力及性能。
3. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于： 步骤（3)中所述的新鲜脐血应采用24小时之内新鲜脐血； 步骤（3)中所述的新鲜脐血密度梯度离心分离出单个核细胞的条件为新鲜脐血与生 理盐水体积比1 :1稀释后，经Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，离心时间25min，离 心力500g，离心加速度lg，减速度lg，温度20°C;离心结束后，取白膜层；加入3倍体积的生 理盐水，洗涤一次，离心力800g，离心时间8min，离心加速度7g，减速度7g，收集细胞沉淀， 30mL的生理盐水再洗一次，离心力200g，离心时间lOmin，离心加速度4g，减速度4g，收集细 胞沉淀，即为单个核细胞。
4. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步骤（4)、（5)和（6)中所述的传代按1 : (3?5)比例进行传代。
5. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于： 步骤（2)中所述的离心的条件为离心时间5min，离心力500g，离心加速度7g，减速度 7g，温度 20°C ; 步骤（4)、（5)和（6)中所述的离心的条件为离心时间4?8min，离心力400g?800g, 离心加速度7g，减速度7g，温度20°C。
6. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特 征在于：步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质混合培养，接种时总细胞密度为3X10 4? 5X104f/mL。
7. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，内皮细胞代数为3?6代。
8. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，间充质干细胞代数为4代以 内。
9. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，培养时间不超过7天。
10. 根据权利要求2所述的提高脐血外向生长内皮细胞增殖能力及性能的方法，其特 征在于：步骤（7)中所述的内皮细胞与间充质干细胞混合培养，两种细胞在混合前的特征 为： ① 内皮细胞铺路石样生长，细胞形态均一，高密度培养时增殖迅速；CD309、CD34阳性 表达，⑶105>80%;在matrigel中能迅速成血管；在培养到5?6代后进入分化，⑶34表达 量增加，增殖能力减弱，在matrigel中成血管能力减弱； ② 脐带源间充质干细胞成纤维样生长，细胞形态均一，增殖迅速，流式表型为 CD105>90%, CD90>90%, CD73>90%, CD45〈2%, CD34〈2%。
【文档编号】C12N5/071GK104099291SQ201410333512
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】嵐山芮, 魏伟, 郭磊 申请人:广州市天河诺亚生物工程有限公司