本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种硝化-反硝化细菌复合微生态制剂的联合发酵方法。
背景技术：
当今，因人类活动影响，城市河道及相对开放的水域氨氮指标高居不下。由此引发的生态环境问题已经对人类居家环境和城市形象产生重大影响。微生物修复水环境成为目前研究的热点领域，目前在针对污水水体氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐的去除也正在随着对硝化细菌，反硝化细菌的研究而逐渐提升到新的层次。
废水中存在着有机氮、氨氮、硝态氮等形式的氮，其中以氨氮和有机氮为主要形式。在生物梳理过程中，有机氮被一样微生物氧化分解，即通过氨化作用转化为氨氮，而后经硝化过程转化为亚硝态氮和硝态氮，最好通过反硝化作用使硝态氮转化为氮气，逸入大气，从而降低废水中n的含量。
硝化细菌为化能自养型微生物，细菌的生长代谢尤为缓慢，在实际的规模化生产中较为困难，其相对于一般细菌培养的代时较长，对溶解氧、温度等较为敏感。目前对硝化的细菌培养已有相关发明专利，但其只是培养单一的硝化细菌制剂，单一菌株在处理污水时会造成总氮的积累，因此还需要配合反硝化细菌进行脱氮。而目前，硝化细菌和反硝化细菌的培养均来及分开培养，或者培养后混合得到复合微生物制剂，这一工艺费时，且增加成本。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种硝化-反硝化细菌复合微生态制剂的联合发酵方法，以提供高活性可降低硝化细菌的菌株、反硝化细菌的菌株，硝化细菌和反硝化细菌联合培养的方案。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种硝化-反硝化细菌复合微生态制剂的联合发酵方法，该复合微生态制剂由维氏硝化杆菌ks05、反硝化细菌ks03组成，联合发酵的方法具体包括步骤如下：
s1、菌株的制备，由实验室从好氧曝气池分离得到维氏硝化杆菌，从河底淤泥分离得到反硝化细菌；
s2、培养基的制备，具体如下：
反硝化细菌培养基：
酵母粉2-4g/l，
醋酸钠2.5-5g/l，
磷酸氢二钾0.5-1g/l，
硫酸镁0.25g/l，培养基121℃灭菌20分钟，备用；
硝化杆菌培养基：
氯化钠1g/l，
亚硝酸钠0.5g/l，
无水乙酸钠3g/l，
磷酸氢二钾3g/l，
硫酸锰0.2g/l，
硫酸镁0.2g/l，
硫酸亚铁0.1％；
s3、按照硝化杆菌培养基体积的5％-10％进行接种维氏硝化杆菌ks05，同时每隔8-12h进行补料亚硝化钠，维持亚硝化钠浓度100mg/l,培养48-72h；
s4、上述硝化细菌培养完毕后，在此基础上按照发酵液体积的20％投加上述反消化细菌培养基，搅拌均匀后，按5％的接种量接种反硝化细菌ks03，实时监测培养基中亚硝酸盐及硝酸盐的含量，当达到0mg/l时，混合培养结束，得到硝化-反硝化复合细菌发酵液；
s5、细菌活菌数的检测：通过稀释涂布的方法进行硝化细菌和反硝化细菌的浓度检测。
进一步的，在s3中，培养温度为30℃，培养过程稳定ph：7.5，转速120rpm。
进一步的，在s4中，培养温度为32℃，转速100rpm，培养40小时后，静止培养18h。
本发明提出的一种硝化-反硝化细菌复合微生态制剂的联合发酵方法，有益效果在于：
1、硝化细菌和反硝化细菌分阶段的连续培养可完成短时间内硝化和反硝化的培养富集难题，节约时间成本，提升发酵效率。
2、本发明的硝化细菌发酵过程中已将亚硝酸盐转化为硝酸盐，而发酵结束后的硝酸盐又可被反硝化细菌重新利用。同时发酵培养基中其他成分也被悉数利用殆尽。因此该发酵方案充分吸收营养元素，降低在实际生产中的成本。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
硝化-反硝化细菌复合微生态制剂的联合发酵，该复合微生态制剂由维氏硝化杆菌ks05、反硝化细菌ks03组成，维氏硝化杆菌ks05来源是由本实验室于2019年12月从南京市某水务有限公司好氧曝气池分离得到，经过形态学和pcr鉴定，经过序列比对确认为维氏硝化杆菌。其具备高效的亚硝酸盐去除能力，实际应用中测得硝化速率达到600-850mgno2-n/l/h。
反硝化细菌ks03是由本实验室于2020年3月从南京市城市景观河河底淤泥分离得到，经过形态学和pcr鉴定，经过序列比对确认为反硝化细菌，上述菌株均保存于lb固体平板中，保藏于4℃冰箱。
实施例1
一种硝化-反硝化细菌复合微生态制剂的联合发酵方法，具体包括步骤如下：
s1、菌株的制备，由实验室从好氧曝气池分离得到维氏硝化杆菌，从河底淤泥分离得到反硝化细菌；
s2、培养基的制备，具体如下：
反硝化细菌培养基：
酵母粉2g/l，
醋酸钠2.5g/l，
磷酸氢二钾0.5g/l，
硫酸镁0.25g/l，培养基121℃灭菌20分钟，备用；
硝化杆菌培养基：
氯化钠1g/l，
亚硝酸钠0.5g/l，
无水乙酸钠3g/l，
磷酸氢二钾3g/l，
硫酸锰0.2g/l，
硫酸镁0.2g/l，
硫酸亚铁0.1％；
s3、取上述制备好的硝化细菌培养基1000l，按照硝化杆菌培养基体积的5％接种量进行接种维氏硝化杆菌ks05，实时检测发酵过程中的亚硝酸盐浓度，当其浓度降至100mg/l时，进行补料发酵。补料时间为8h，搅拌转速100rpm，温度32℃，培养48-72h；
s4、硝化细菌培养完毕后，按照反硝化细菌培养基体积为硝化细菌发酵液体积的20％投加反硝化细菌培养基，搅拌均匀后，按5％的接种量接种反硝化细菌ks03。培养条件：温度32℃，转速100rpm，培养40小时后，静止培养18h。实时监测培养基中亚硝酸盐及硝酸盐的含量，当达到0mg/l时，混合培养结束，得到硝化-反硝化复合细菌发酵液；
s5、细菌活菌数的检测：通过稀释涂布的方法进行硝化细菌和反硝化细菌的浓度检测，反硝化细菌及硝化细菌的活菌数为：2×109cfu/ml、3×109cfu/ml。
实施例2
一种硝化-反硝化细菌复合微生态制剂的联合发酵方法，联合发酵的方法具体包括步骤如下：
s1、菌株的制备，由实验室从好氧曝气池分离得到维氏硝化杆菌，从河底淤泥分离得到反硝化细菌；
s2、培养基的制备，具体如下：
反硝化细菌培养基：
酵母粉4g/l，
醋酸钠5g/l，
磷酸氢二钾1g/l，
硫酸镁0.25g/l，培养基121℃灭菌20分钟，备用；
硝化杆菌培养基：
氯化钠1g/l，
亚硝酸钠0.5g/l，
无水乙酸钠3g/l，
磷酸氢二钾3g/l，
硫酸锰0.2g/l，
硫酸镁0.2g/l，
硫酸亚铁0.1％；
s3、取上述制备好的硝化细菌培养基1000l，按照硝化杆菌培养基体积的10％接种量进行接种维氏硝化杆菌ks05，实时检测发酵过程中的亚硝酸盐浓度，当其浓度降至100mg/l时，进行补料发酵。补料时间为12h，搅拌转速100rpm，温度32℃，培养72h；
s4、上述硝化细菌培养完毕后，按照反硝化细菌培养基体积为硝化细菌发酵液体积的20％投加反硝化细菌培养基，搅拌均匀后，按5％的接种量接种反硝化细菌ks03。培养条件：温度32℃，转速100rpm，培养40小时后，静止培养18h。实时监测培养基中亚硝酸盐及硝酸盐的含量，当达到0mg/l时，混合培养结束，得到硝化-反硝化复合细菌发酵液；
s5、细菌活菌数的检测：通过稀释涂布的方法进行硝化细菌和反硝化细菌的浓度检测，反硝化细菌及硝化细菌的活菌数为：2×109cfu/ml、3×109cfu/ml。
实施例3
本发明还提供了硝化-反硝化细菌发酵液的工程应用。
将上述联合发酵的发酵液应用于南京市六合区生活污水处理泵站中，该泵站日处理污水500立方。将本发明的复合微生物制剂投加入好氧池及反硝化池中，投加比例为5：1；初始投加量为100l，第4日投加50l，第8日投加50l，实时监测水质变化，记录亚硝酸盐及硝酸盐的含量，结果如下所示。
硝化-反硝化细菌治理生活污水总氮的的效果
对照组(不加菌)：
有表可以得出结论，在投加复合微生物制剂后，在第8天时，总氮去除率已经达到95.5％，而对照组未出现总氮的显著降低。由此可见该制剂在对总氮的去除上，效果尤为显著。
实施例4
硝化-反硝化细菌复合微生态制剂在膜生物反应器中的应用。
采用上述联合发酵方法，得到混合培养液。将培养液加入离心管，6000r/min离心15min，弃上清，用生理盐水重悬菌体。
将上述菌悬液按照1％的体积比，投加至膜生物反应器中，该膜生物反应器主要由高效沉淀区和膜生物处理区组成，进水为城市生活污水的原水，处理规模为1m3/d，设计的水力停留时间为6h，曝气方式为采用间歇曝气，气水比为30：1，水温为25-30℃。监测投加菌株ks03、ks05悬液前后膜生物反应器的总氮去除率变化情况见下表。
三联复合除臭剂降解效果测定：
由表可见，复合菌悬液投加至膜生物反应器后总氮的去除率均有提高，投加后10天的总氮去除率比投加时提高34.2％。
由上述实施例可以看出，复合微生态制剂不仅具备优良的好氧反硝化性能，同时还具有自养硝化作用，在生活污水及其他各种污染水体治理中具有较高的应用价值。运用到膜生物反应器中，能有效降低膜生物反应器生活污水中的硝态氮和总氮的含量，对开发脱氮微生物制剂或污水处理剂具有广阔的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。