一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物降解技术领域，具体涉及一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)又称为呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生。其化学名为3α，7α，15-三羟基-12，13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，化学式为c15h20o6，纯品是一种无色针状结晶，具有很高的热稳定性和化学稳定性。呕吐毒素可污染多种谷物，如小麦、黑麦、燕麦、玉米等，且也能污染饲料原料和全价配合饲料(李笑樱等，2012)。呕吐毒素具有慢性和亚慢性毒性(andrettaietal.，2012)、急性毒性(霍星华等，2008)、免疫毒性(mikamioetal.，2010)、神经毒性(fitzpatrickdwetal.，1988)等多种毒性作用，可对动物的消化系统、血液系统、中枢系统以及钙磷代谢均产生影响。饲料中低剂量的呕吐毒素会引起动物食欲下降、体重减轻、代谢紊乱等症状，高剂量可导致动物呕吐(bennettjwetal.，2003)。目前关于呕吐毒素的生化、毒性和作用方式有很多的研究报道，但是仍未构建有效防治或根除这些毒素的可行性办法。虽然物理，化学方法常被用来去除饲料中呕吐毒素的污染，如热处理，比重分选和清洗，但这些脱毒方法不仅效率低、效果差，还有可能带来二次污染、影响口感、降低粮食的营养价值等，因此“生物脱毒”开始被广泛关注。相关研究认为，最佳的脱毒方法是筛选有效微生物降解真菌毒素，该法可避免在食品加工过程中引入有害化学试剂，不会造成食品风味的改变和营养价值流失。

生物脱毒可通过微生物或者酶将有毒的物质转化为低毒甚至无毒的代谢产物。例如，乳酸菌在一定条件下可以降解真菌毒素(el-nezamihetal.，1998)；motomura等从糙皮侧耳中提取并纯化了一种几乎能完全降解黄曲霉毒素的胞外酶，通过裂解黄曲霉毒素的苯环来达到生物脱毒作用(motomurametal.，2003)，若能通过生物脱毒的方法对呕吐毒素的毒性基团进行改造从而降低毒性，则可实现高效、无污染的生产需求。

技术实现要素：

本发明提供一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)n-22菌株，所述n-22菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏编号cgmccno：19864。

所述菌株是在感染赤霉病的小麦籽粒上分离筛选得到的。

所述菌株的分离筛选方法是：包括步骤：

(1)取1g赤霉病菌污染的麦粒置于试管中，加9ml蒸馏水，室温孵育12小时，孵育期间震荡试管两到三次；

(2)取孵育好的溶液1ml加至含200mg/l呕吐毒素的lb培养基中，在30℃、220rpm的条件下富集培养7天；

(3)将富集培养后的菌液稀释为原浓度的10^-4、10^-5、10^-6倍，涂于lb平板培养基上，过夜培养于30℃培养箱中；

(4)挑选菌落生长密度适中的平板，挑取平板上所有的菌落至lb液体培养基中，30℃、220rpm培养12小时，得到所有待选的呕吐毒素降解菌株；

(5)对所有待选的呕吐毒素降解菌株进行筛选，检测其呕吐毒素降解能力，筛选得到降解能力最高的菌株。

其中所述步骤(5)中的筛选和检测过程具体为：

a)将待选菌株在lb平板培养基上划线活化。

b)挑取单菌落至lb液体培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养12小时。

c)吸取20μl上述新鲜菌液接种至含有20mg/l呕吐毒素的msm培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养96小时。

d)用hplc检测上述共培养混合液中呕吐毒素的含量，记录呕吐毒素降解效率。

经过上述分离筛选过程后，最终得到一株降解能力最高的菌株，将其命名为n-22。其在含有呕吐毒素的环境中共培养96小时后，环境中呕吐毒素浓度即可降解至14mg/l以下。证明其具有高效降解呕吐毒素的能力。

本发明还提供所述的n-22菌株在饲料生产或食品加工中的应用。所述应用是在饲料生产或食品加工过程中，将所述菌株加入到含有呕吐毒素的环境中共培养。随着共培养时间的延长，呕吐毒素浓度可持续降低。

本发明的枯草芽孢杆菌n-22生长活力高、代谢水平较为稳定，可广泛应用于饲料生产和食品加工等领域中。本发明分离筛选得到的呕吐毒素降解微生物n-22对于研究开发呕吐毒素的生物脱毒剂、饲料生产和食品加工上具有十分重要的作用。

微生物保藏说明

本发明提供的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)n-22菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，菌株编号cgmccno：19864。保藏时间：2020年5月22日。详见所附的微生物保藏证明材料。

附图说明

图1为n-22菌株的呕吐毒素降解能力hplc检测结果。

图2为n-22菌株的16srdna鉴定图谱。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

本实施例通过多次分离筛选，从自然环境中筛选分离得到一株可高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌，命名为n-22(cgmccno：19864)，是从感染赤霉病的小麦籽粒上分离并筛选得到的。具体的，本发明菌株的分离筛选方法，包括：

(1)取1g赤霉病菌污染的麦粒置于试管中，加9ml蒸馏水，室温孵育12小时，孵育期间震荡试管两到三次；

(2)取孵育好的溶液1ml加至含200mg/l呕吐毒素的lb培养基中，在30℃、220rpm的条件下富集培养7天；

(3)将富集培养后的菌液稀释为原浓度的10^-4、10^-5、10^-6倍，涂于lb平板培养基上，过夜培养于30℃培养箱中；

(4)挑选菌落生长密度适中的平板，挑取平板上所有的菌落至lb液体培养基中，30℃、220rpm培养12小时，得到所有待选的呕吐毒素降解菌株；将所有菌株冻存于20％甘油管中(-80℃)。

(5)对所有待选的呕吐毒素降解菌株进行筛选，检测其呕吐毒素降解能力，筛选得到降解能力最高的菌株。

其中所述步骤(5)中的筛选和检测过程具体为：

a)将待选菌株在lb平板培养基上划线活化。

b)挑取单菌落至lb液体培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养12小时。

c)吸取20μl上述新鲜菌液接种至含有20mg/l呕吐毒素的msm培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养96小时。

d)将上述共培养混合液在95℃高温加热15分钟，然后用12000rpm高速离心，取上清液与等体积40％甲醇溶液混合。用0.22μm有机相滤器过滤混合液以除杂质；将lb液体培养基做同样处理，以作为呕吐毒素浓度检测的阳性对照；用hplc检测上述共培养混合液中呕吐毒素的降解量。hplc检测使用watersc185μm色谱柱(4.6×120mm)，流动相为a(甲醇)和b(超纯水)，va∶vb＝20∶80，流速1ml/min，测定波长为218nm。

经过上述分离筛选后，最终得到一株降解能力最高的菌株，将其命名为n-22。n-22的呕吐毒素降解能力hplc检测结果如图1所示，从图1可以看出，本发明最终筛选得到一株可以高效快速地降解环境中的呕吐毒素的菌株，其在呕吐毒素浓度为20mg/l的培养基中共培养96小时后，可将呕吐毒素浓度降解至14mg/l，随着共培养时间的延长，呕吐毒素浓度可持续降低。证明其具有高效降解呕吐毒素的能力。

接着检测菌株n-22的16srrnagene，进行菌种鉴定，使用的pcr扩增引物是：

上游引物：27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′；

下游引物：1492r：5′-ggttaccttgttacgactt-3′；

构建载体并转化至大肠杆菌，进行16srdna序列比对，结果如图2所示，从图2可以看出，本实施例分离筛选得到的是一株枯草芽孢杆菌，命名为n-22。

在得到菌株n-22的基础上，本实施例还涉及该菌株的应用方法。即在饲料生产或食品加工过程中，将所述菌株加入到含有呕吐毒素的环境中共培养。可以有效降解真菌毒素，且饲料或食品产品中不用再添加其他有害化学试剂，不会造成食品风味的改变和营养价值流失。本发明中的枯草芽孢杆菌n-22生长活力高、代谢水平较为稳定，可广泛应用于饲料生产和食品加工等领域中。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。