一种防治马铃薯黑胫病的生防菌剂及其制备方法与流程

本发明属于微生物应用
技术领域：
，涉及一种防治马铃薯黑胫病的生防菌剂及其制备方法。
背景技术：
：马铃薯是继水稻、小麦、玉米之后的第四大作物。中国是马铃薯第一生产大国。然而，细菌性疾病严重影响马铃薯的产量和品质。其中马铃薯黑胫病是最常见的细菌性疾病之一。马铃薯黑胫病是由果胶杆菌引起的严重病害，可发生在马铃薯植株茎基部及块茎上，主要侵染维管束组织。从种薯发芽到生长后期均可发病，以苗期最盛。该病害主要通过带病种薯和土壤进行传播，发病早，繁殖传播速度快，防治困难，严重影响马铃薯的产量和品质。目前马铃薯黑胫病主要以杀菌广、见效快的化学药剂进行防治，由于病原菌易生抗药性，导致化学农药施用量不断增加，造成了严重的农药残留及土壤生物结构的破坏。减少农药、化肥的使用，施用微生物肥料，可从根本上修复土壤生态系统。施用微生物肥料可提高化肥利用率，降低农作物病害的发生，改善农业生态环境，在提高农作物产品品质和食品安全等方面具有不可替代的作用。经研究发现，芽孢杆菌与几种常见的植物病原菌有拮抗作用，能够有效地抑制病原菌的生长；在生物肥料生产方面，相比其他微生物肥料中的细菌，芽孢杆菌的高抗逆性使其在肥料的发酵、运输以及在农田中的恶劣环境下生存具有优势。但目前关于多种菌复合的微生态制剂对植物微生态环境、土壤酶活的影响及其与病害防治间关系的系统研相对较少。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种防治马铃薯黑胫病的生防菌剂，该生防菌剂具有良好的生防作用和促生作用，可有效防治马铃薯黑胫病。本发明的技术方案如下：一种防治马铃薯黑胫病的生防菌剂，每克菌剂中芽孢杆菌活菌含量≥1×108cfu，所述芽孢杆菌为短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌的复合菌。进一步的，所述短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的菌落形成有效活菌数(cfu)比例为(2.3-5.2):(2.3-6.0):(2.0-5.0):(2.0-5.5):(2.5-5.5)。一种所述防治马铃薯黑胫病的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：a.将已活化的胶质芽孢杆菌接种到的硅酸盐液体培养基中，已活化的短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌接种到lb液体培养基中，接种量为5-8%，在温度为35-37℃，搅拌速度为110-120r/min的条件下培养12-24h，制得种子液；b.将干燥、过筛后的载体与所述种子液以10-20ml:200-300g的比例充分混合，以氯化钠5wt%、蔗糖2.5wt%和柠檬酸1.25wt%作为保护剂，常温培养36-48h，待ph＜4后干燥，干燥温度为45-60℃，即得所述生防菌剂。进一步的，所述硅酸盐液体培养基和lb液体培养基中包括碳源10wt%和氮源5%，以活菌数为指标设计正交实验，优化培养基的碳源和氮源。进一步的，所述碳源为红糖，所述氮源为豆粉3wt%和奶粉2wt%。进一步的，所述载体为豆粉、硅藻土中的至少一种，以载体湿润、疏松、不结块为标准。本发明具有如下有益效果：本发明选用的短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌均具有优良的固氮、解磷作用，同时地衣芽胞杆菌和胶质芽孢杆菌解钾作用效果显著，赋予了生防菌剂良好的促生作用，提高马铃薯产量，与化学肥料混合使用促生增产效果更为显著。复合芽孢杆菌可提高马铃薯叶片的防御酶活性，提高土壤脲酶及蔗糖酶的活性，提高土壤肥力，从而提高植物的抗病能力，促进植物生长。生防菌剂中的短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对黑胫病菌拮抗作用显著。复合芽孢杆菌以空间位点竞争占优势，可在植物不同部位快速繁衍和定殖，有效地阻止病原菌的定殖和侵染，从而起到抑菌控病的效果。复合芽孢菌剂使得土壤微生物菌群结构发生变化，提高马铃薯根际土壤微生物物种丰富度，土壤放线菌属占比增加，有利于植物生防能力的增强。附图说明图1为大田试验中各组马铃薯产量和叶片防御酶活性的动态变化图；图2为大田试验中各组马铃薯根际土壤脲酶和蔗糖酶活性的动态变化图；图3为大田试验中各组马铃薯根际土的活性菌群的动态变化图；图4为高通量测序分析中各处理组的物种门（phylum）水平注释图；图5为高通量测序分析中weightedunifracpcoa排序图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。实施例一种防治马铃薯黑胫病的生防菌剂，每克菌剂中芽孢杆菌活菌含量为1×108cfu，所述芽孢杆菌为短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌的复合菌；其中，所述短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的菌落形成有效活菌数(cfu)比例为2.3:2.3:2.0:5.5:5.5。一种防治马铃薯黑胫病的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：a.滤纸片法把短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌分别涂布至lb固体培养基上进行菌体的拮抗试验，设空白对照组，试验结果显示各芽孢杆菌间没有拮抗作用；b.将已活化的胶质芽孢杆菌接种到的硅酸盐液体培养基中，已活化的短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌接种到lb液体培养基中，接种量为5-8%，在温度为35-37℃，搅拌速度为110-120r/min的条件下培养12-24h，制得种子液；其中，所述硅酸盐液体培养基和lb液体培养基中包括碳源10wt%和氮源5%，以活菌数为指标设计正交实验，优化培养基的碳源和氮源；所述碳源为红糖，所述氮源为豆粉3wt%和奶粉2wt%。c.将干燥、过筛后的豆粉载体与所述种子液以10-20ml:200-300g的比例充分混合，以氯化钠5wt%、蔗糖2.5wt%和柠檬酸1.25wt%作为保护剂，常温培养36-48h，待ph＜4后干燥，干燥温度为45-60℃，即得所述生防菌剂。一、大田试验供试大田的土壤理化指标：土壤信息ph有机质（g/kg）碱解氮(mg/kg)有效磷(mg/kg)速效钾(mg/kg)田15.72117.48123.2032.4356.92田25.90120.47137.2429.6177.05供试马铃薯品种为荷兰7号，田1、田2中各选取60株长势相近的马铃薯，共120株，分为6组，每组20株，田1、田2中各10株，检测平行样n=3。对比本发明生防菌剂（fh）、格喜•田壮肥料（gt肥）、绿硕1号肥（ls）的肥效，施肥方案如下表所示，本发明生防菌剂的施用量为每株20ml，其它肥料按配方施用。1.马铃薯产量测定各组20株马铃薯于收获期测产，以每株马铃薯的产量为指标评价本发明生防菌剂的促生作用，测试结果见图1（a），复合芽孢菌剂组（fh）的产量显著高于空白对照（bc）,而复合芽孢菌剂与化肥配施组（gf）的产量更高，说明本发明生防菌剂对马铃薯生长具有促生作用，与化肥配合使用，促进马铃薯增产效果更为显著。2.马铃薯叶片防御酶活性测定以马铃薯（苗期到蕾期）最后一次施肥为起点，每组5株随机取3株来检测，分别测定施肥后6d测定马铃薯叶片的过氧化物酶（pod）、超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）、多酚氧化酶（ppo）、苯丙氨酸解氨酶（pal）酶活性，通过spss分析对比不同肥料对马铃薯防御酶活性的影响（n=3），测试结果见下表和图1（b-f），添加了生防菌剂的实验组（fh和gf）与空白对照组（bc）比较，在过氧化物酶（pod）和苯丙氨酸解氨酶（pal）活性上有十分显著差异，在多酚氧化酶（ppo）上有显著差异。生防菌剂与化肥配施的，其多酚氧化酶（ppo）和苯丙氨酸解氨酶（pal）的活性显著高于空白对照组。可见，本发明生防菌剂（fh组）可显著提高马铃薯叶片过氧化物酶（pod）的活性，有利于维持植株体内活性氧代谢平衡。生防菌剂与gt肥联合使用的gf组，多酚氧化酶（ppo）活性显著提高，其能将酚类物质转化为木质素、植保素等从而增强植物抗性，可有效抵御病原物的侵染。3.马铃薯土壤脲酶和蔗糖酶活性测定以马铃薯（苗期到蕾期）最后一次施肥为起点，每组5株随机取3株来检测，分别测定施肥后3d、6d、9d、12d马铃薯根际土壤中的脲酶、蔗糖酶活性。（1）脲酶活性测试结果见图2。如图2(a)所示，在第3d时，生防菌剂fh组的土壤脲酶活性最高，显著高于空白对照组（bc）；第9d时，生防菌剂与gt肥配施的gf组脲酶最高，随后各组的脲酶活性都大幅降低。在整个处理期间生防菌剂（fh组）和菌剂与化肥配施（gf组）的脲酶活性均高于空白对照组。土壤脲酶是土壤中氮素转化的关键酶，脲酶活性用于表征土壤的氮素状况，评价土壤肥力。本发明生防菌剂的施用，前期有利于提高土壤脲酶的活性，经本发明生防菌剂处理的马铃薯植株，其脲酶活性在喷施处理6-9天后达到了峰值。（2）蔗糖酶活性测试结果见下表和图2(b)，在整个处理期间生防菌剂（fh组）和菌剂与化肥配施（gf组）的脲酶活性均高于空白对照组（bc组）。蔗糖酶能将土壤中的蔗糖水解成容易生物吸收利用的葡萄糖和果糖，能增加土壤中易溶性营养物质，是表征根际土壤生化活性的重要指标之一。可见，本发明生防菌剂的施用有利于提高土壤蔗糖酶活性，且与gt肥配施效果更好。二、盆栽试验1.马铃薯根际的生理活性菌群测定选取温室大棚中30株长势相近的马铃薯，分为6组，每组5株，施肥和施病菌方案如下表所示：其中，所述复合菌剂每克菌剂中芽孢杆菌活菌含量为1×108cfu，所述芽孢杆菌为短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的复合菌，短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌落形成有效活菌数(cfu)比例为4.3:3.3:7.5，所述复合菌剂的制备方法与实施例相同；复合菌剂和本发明生防菌剂施用方法为：每株施用0.2l，以1:200稀释灌根；病菌取500µl（约od值=1.0），稀释至50ml进行马铃薯伤茎灌根。于5d、9d、15d施菌前进行三次采样，每组5株植物随机取3株进行检测，五点采样法获得3份根际土，10倍稀释法制备土悬液至10-6。选合适的稀释度分别用营养琼脂培养基、改良高氏1号培养基、pda培养基、无氮培养基和蛋白胨氨化培养基接种，28℃培养1-3d后进行细菌、放线菌、真菌、固氮菌和氨化细菌的菌落计数，测试结果见图3，防病组（dpa和dpb）先施用生防菌后施黑胫病菌，治病组（dca和dcb）先施黑胫病菌再施生防菌剂，染病组（dg）仅施黑胫病菌而不施生防菌剂，可见在三个不同采样批次，防病组、治病组和染病组的活性细菌数均有下降趋势，放线菌有上升趋势，氨化细菌先上升后下降，均与空白对照组（bc）有一定差异，但差异不够显著。复合芽孢菌剂的施用前期使放线菌数量增加，可能激发了放线菌对病理生理的应答反应。而放线菌在植物病害生物防控中具有重要作用。复合芽孢菌剂对于固氮菌和氨化细菌数量有所增加，但增加不够显著。2.高通量测序分析土壤微生物群落结构选取温室大棚中10株长势相近的马铃薯，分为两组，每组5株，施肥和施病菌方案如下表所示：时间1d3d5d7d9d12d15d实验组gf（5株）实施例gt肥实施例gt肥实施例采样后施病菌采样对照组gt（5株）清水gt肥清水gt肥清水采样后施病菌采样实验组选gf(gt肥+本发明生防菌剂)，以gt肥做壮苗，3次交替施用本发明生防菌剂后才施黑胫病菌。其中，本发明生防菌剂以1:200稀释，每株灌根0.5l；病菌取500µl（约od值=1.0），稀释至50ml进行马铃薯伤茎灌根。对照组（gt）不施入复合微生态制剂，仅施gt肥壮苗和浇灌清水。（1）effectsequence选取实验组gf，分别在施黑胫病菌前后随机各取3个平行土样，用改良的ctab法提取马铃薯根际土壤总dna，胶回收试剂盒纯化dna。用通用引物515f和909r扩增基因的v4-v5高变区。琼脂糖凝胶电泳后采用sanprepdna凝胶回收试剂盒纯化，所得dna等量混合后上机测序。用illuminahiseqpe250对土壤dna样品进行测序。下机后，拼接mergedsequences得到effectsequence。测序工作由广东美立康生物科技有限公司完成。拼接初步得到的mergedsequences经处理后每个样品的序列数（effectsequence）如下表所示：（2）otu聚类分析和注释对effectsequence进行otu聚类分析和注释，采用uparse将序列相似度大于97%的reads归为一类operationaltaxonomicunits(otus)，每个样品的otus结果如下表所示：pecq组在门、纲水平上低于pech组和bc组；在目、科、属和otus水平上pecq组>pech组>bc组，其中pecq组otus数目略高于pech组。生防菌剂的施用能减少有害微生物门的种类，而黑胫病菌的施加（pech）在一定程度上使植株发生病理作用，使门水平微生物种类增加。可见，本发明生防菌剂的施用有利于改善土壤菌群结构，提高土壤微生物物种丰度。（3）门和属分类水平上分析组间的群落结构和物种丰富度各处理组的物种门（phylum）水平注释图如图4所示。pecq组、pech组、bc组三组物种丰度排前10的门基本相同，但每组的物种丰度有差别。与空白对照组（bc）相比，实施例为加了复合芽孢菌剂在施黑胫病菌前（pecq组）和施黑胫病菌后（pech）两个实验组，丰度最高的依次为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和拟杆菌门；其中在放线菌门中pecq组与bc组差异十分显著，pech组与bc组差异显著，实验组均表现为丰度下降；在拟杆菌门中pech组与bc组差异显著，实验组表现为丰度上升；此外，在变形菌门、厚壁菌门上实验组(pecq、pech)与bc组均存在差异，而在酸杆菌门、腐霉菌门和芽单胞菌门上，pech组与bc组存在差异。厚壁菌门、酸杆菌、变形菌在根际微生物中占优势地位，黑胫病菌属于变形菌门，生防芽孢杆菌属于厚壁菌门。可见，本发明生防菌剂有利于提高马铃薯盆栽根际土壤变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门等微生物相对丰度，减少放线菌门和厚壁菌门微生物相对丰度，且在黑胫病处理后土壤微生物菌群维持动态稳定，对黑胫病的防控、土壤物质循环和生态环境构建过程中起重要作用。在属（genus）水平上，pecq组、pech组和bc组存在显著差异的优势属统计如下表所示：bc组、pecq组、pech组属水平微生物共有1187种，其中含量大于1%的有26种，各处理组均未检测到黑胫病菌(pectobacteriumspp.)，表明施加的黑胫病菌未成为根际土壤微生物的优势属。bc组和pecq组、pech组的共有的优势菌属为arthrobacter（节细菌属）、sagma-x、gaiellaceae（放线菌属）、rhodoplanes（红细菌属）、candidatusnitrososphaera（氨氧化古菌属）、gemmataceae（芽单孢菌属）、mnd1、koribacteraceae。bc组与pecq组和pech组原核微生物群落优势属种类和组成差异较大。与bc组相比，pecq组和pech组优势菌属数量增加，放线菌属和红细菌属成为主要优势菌，节细菌属和sagma-x（泉古菌目）属含量明显降低。与pecq组相比，pech组放线菌属、sbla14属含量降低；芽孢杆菌属（bacillus）相对丰度提高近2倍，成为优势属；红细菌属成为最主要优势菌。黑胫病菌的施加在一定程度上使植株发生病理作用，减少了放线菌属物种丰度；但又刺激芽孢杆菌属物种丰度增加，一定程度上提高对黑胫病菌的抗性。可见，施用本发明生防菌剂有利于提高放线菌属、红细菌属和氨化古细菌属丰度，提高马铃薯的抗病性，对黑胫病菌的定植起到抑制作用。（4）α-多样性指数α-多样性指数（shannon指数、pd指数、chao1指数、simpson指数）结果如下表所示：α-多样性指数pecq组>pech组>bc组，且pecq组和pech组各α-多样性指数相差不显著。可见，施用本发明生防菌剂能够有效提高马铃薯盆栽土壤根际土微生物的多样性，且在黑胫病菌对马铃薯盆栽处理后，土壤微生物多样性维持相对恒定。（5）pcoa排序分析weightedunifracpcoa排序图如图5所示，weightedunifracpcoa反映出组与组之间的物种组成相似程度：bc组与pecq组和pech组距离较远，表明bc组与pecq组和pech组物种组成差异性最大，而pecq组和pech组两组差异较小；此外，从图5中还可看出，对于贡献值最小的第一主成分来说，bc组组间间隔较远，而pecq组和pech组组间间隔相对较近。可见，施用本发明生防菌剂前物种组成结构差异较大，施用后对于土壤微生物群落的结构稳定的维持及在黑胫病处理后对土壤微生物群落的结构稳定的维持具有重要作用。当前第1页12