一种马铃薯疮痂病菌定性检测的方法
【专利摘要】本发明公开了马铃薯疮痂病菌致病菌的快速定性分子检测方法，以我国发现的具有代表性的致病菌株CPS-1(S.scabies)、CPS-2(S.galilaeus)、CPS-3(S.acidiscabies)、SHXHZ-3(S.turgidiscabies)为模式菌株，根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）设计引物，筛选疮痂致病链霉菌的通用引物，筛选到的通用引物B1/B2对马铃薯疮痂病致病菌具有特异性。本发明设计的对马铃薯疮痂病致病链霉菌的快速定性检测方法不仅可用于对马铃薯疮痂病菌DNA的检测，还可以直接用于对孢悬液以及马铃薯疮痂病组织和土壤中的马铃薯疮痂病菌的检测，且检测准确，灵敏度高。
【专利说明】一种马铃薯疮痂病菌定性检测的方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于分子检测方法的发明，特别指马铃薯疮痂病致病菌的分子检测方法的 建立。 【背景技术】
[0002] 马铃薯疮痂病是由多种植物病原链霉菌引起的经济性病害，随着我国近年来马铃 薯生产规模不断扩大，疮痂病的危害也日益严重，目前已成为影响种薯生产的主要障碍之 一，有的地区微型薯的发病率可达309Γ60%(白晓东，2002)。由于该类病原菌的组成较为复 杂，明确不同地区病原菌的存在情况是病害防治工作的首要问题，因此建立快速准确的病 原菌检测方法是当前生产的急需。
[0003] 针对生产中马铃薯疮痂病普遍发生却缺乏病原菌检测方法的实际问题，我们在 前期工作中通过对我国马铃薯疮痂病菌进行采集鉴定，获得了大量病原菌菌株(赵伟全， 2006)。对病原菌致病因子分析后发现该类病原可产生特有的致病毒素，且该毒素是疮痂病 菌侵染过程中的主要致病因子（Goyer C et al，1998;赵伟全，2005)。将毒素合成基因簇 进行克隆和分析后，发现该基因簇符合致病岛（pathogenicity island)的特点，包含trM、 等多个基因。
[0004] 基于PCR技术的快速分子检测技术是目前研究的热点，在病原菌的检测方面具有 较大的应用潜力。该技术具有快速高效，操作简单，重复性强等优点，并可以同时处理大量 样品，满足生产的需要。根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇中的不同基因序列设计引物， 通过筛选稳定的特异性引物和优化反应体系，建立病原菌的分子检测方法。该工作有助 于快速定性测定从疮痂病斑和土壤中分离到的疮痂病原链霉菌菌株，缩短病原菌的鉴定周 期，准确地对马铃薯疮痂病菌进行定性检测，为病害的诊断提供有力依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一对检测马铃薯疮痂病菌的引物Β1/Β2。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供一种马铃薯疮痂病菌的定性检测方法。
[0007] 本发明的整体技术构思是：在此研究中我们采用我国存在的四种模式菌株进行了 基因组DNA的提取。根据上述致病岛中的不同基因序列设计了 4对引物，通过对引物的筛 选找到能检测疮痂链霉菌的快速分子检测方法。筛选到引物后，我们也是从疮痂病组织、带 菌土壤、非致病菌以及其他非疮痂病菌等方面对引物进行了验证，证明了引物的稳定性以 及可用性。
[0008] 以我国发现的具有代表性的致病菌株CPS-1 (5： 、CPS-2 (5： <3--Υ￡//5·--?(95·)、3ΗΧΗΖ-3(5·· 为模式菌株，根据疮 痂病菌特有的毒素合成基因簇序列切（/705〇设计引物。然后 以模式菌株基因组DNA为模板筛选疮痂致病链霉菌的通用引物。对模式菌株一定量的孢子 提取的DNA进行梯度稀释用来测定引物的灵敏度；提取马铃薯疮痂病组织以及带有疮痂病 菌的土壤DNA对筛选到的引物进行稳定性验证；提取实验室保存的其他革兰氏阳性菌株的 DNA对引物的特异性进行检测。
[0009] 本发明的研究方法包括： A、 各菌株基因组DNA的提取和引物的设计； B、 引物的筛选； C、 引物的灵敏度、稳定性及特异性检测。
[0010] 设计的全部引物序列见下表： 表1本研究设计的引物序列
【权利要求】
1. 马铃薯疮痂致病菌株通用引物的筛选方法，其特征在于：根据疮痂病菌特有的毒素 合成基因簇序列trM、trii?、trif (/￥5^0、（/705·)设计引物，以不同马铃薯疮痂病致 病菌株 CPS-1 (5： Μ?Μ)、CPS-2 (5： gahVaeiAs)、CPS-3 (5： acii/isciies)、SHXHZ-3 (5： 基因组DNA为模板，进行PCR扩增，筛选并获得通用检测引物B1/B2。
2. 根据权利要求1所述的方法，采用的扩增反应条件特征在于：所述的PCR反应体系 为模板 DNA 1000 ng，TaqlO 酶 1 U，100 μπιο? · Γ1 的上、下游引物各 0.5 yL，10 mmol ? Γ1的dNTP 0.5 μ L，2 XGC buffer II缓冲液12. 5 μ L，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 yL;PCR反应程序为：95°C预变性5 min;95°C变性30s，62°C退火50s，72°C延伸1 min， 共30个循环；最后72°C延伸10 min，4°C保存。
3. 根据权利要求2所述的方法对引物的灵敏度进行检测，其特征在于用平板计数法 对病原菌的孢子数进行定量；将燕麦固体培养基上培养10 d的疮痂病菌孢子用无菌水洗 下，把孢悬液进行101，1〇2··· 101°倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50 μ L涂布于燕麦固体培 养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总数；提取一定量菌株孢子的基因组 DNA，将所提取的孢悬液DNA稀释成一样的浓度后进行101，102,4X 102,8 X 102, 103,4X 103， 6 X 103,8 X 103, 104, 2 X 104,4 X 104,8 X 104, 105倍不同梯度稀释，用筛选到的引物对不同浓 度的疮痂病原菌孢悬液DNA进行PCR扩增，确定最低检测浓度，并根据孢悬液和孢悬液DNA 的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。
4. 根据权利要求2、3所述的方法对样品进行检测，其特征在于：经CTAB法提取样品的 基因组后，该方法可对致病菌株、非致病菌株进行有效鉴别，也可对病薯组织、带菌土壤进 行有效定性检测。
【文档编号】C12Q1/68GK104099408SQ201310128374
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月15日 优先权日:2013年4月15日
【发明者】赵伟全, 于秀梅, 郭凤柳, 刘大群, 张汀 申请人:河北农业大学