专利名称：含有枯草菌脂肽的用于防除农作物疮痂病的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有式I的化合物或其盐的用于防除农作物疮痂病的组合物。 本发明还进一步涉及疮痂病的防除方法，其使用含有式I的化合物或其盐的用 于防除农作物疮痂病的组合物。
背景技术：
马铃薯疮痂病是由链霉菌属放线菌引起的难防除土壤病害之一，在世界各 地从古至今广有发生。发病的马铃薯块茎表面产生红褐色疮痂状病斑，其组织 产生木栓化小突起、小龟裂。其结果使生食及加工用马铃薯的商品价值严重受损，重度发病时其淀粉价也大幅度降低。在日本国北海道，由于1980年以来伴 随发生地区的扩大其受害程度也增加，给维持马铃薯的稳定供应带来巨大障碍， 所以有关马铃薯疮痂病的研究开始发展起来。以往，针对马铃薯疮痂病的防除措施采取用链霉素等抗生素消毒处理种薯 的方法，使用氯化苦、五氯硝基苯等合成药剂对土壤进行杀菌消毒的方法。但是，由于马铃薯疮痂病的感染源主要是土壤，所以如前者只是单纯消毒 种薯还不能得到显著的效果。另一方面，如后者通过合成药剂进行土壤杀菌时， 还会杀死对土壤传染性病原菌有拮抗性的具有抑制发病能力的土壤微生物，有 时反而会助长发病。另外，还存在着在土壤中积累有害化学物质、具有损害药 剂散布操作者健康的危险性等因药害导致工伤、环境破坏的巨大问题。其他防除措施，有为了偏离疮痂病病原菌即链霉菌属菌生长发育所适合的 PH值范围而降低土壤pH值的方法，但问题是该方法会造成收获量大幅度减少或 对马铃薯之后的栽培作物产生不良影响等，所以其适用性极其有限。因此，作为不产生上述问题的植物病害防治措施还有利用微生物进行生物 学防除的方法，至今为止也己报到了很多事例，但针对马铃薯疮痂病的生物学防除例却很少。例如，已被报道的有将种薯浸渍于含有属于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的MD-4f株、属于假单胞菌属(Pseudomonas) 的F13-l株、属于成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的2-3B株、属于不 动杆菌属(Acinetobacter)的M24-1株中至少一种的悬浮液中，或将细菌制成干燥粉末或浆状物涂布或散布在种薯上、或散布于马铃薯栽培土壤中的方法(曰 本特开平1-193203)，在芽孢杆菌KF-44 (Bacillius sp.KF-44)菌株的悬浮液 中浸渍处理马铃薯等植物体的方法(日本特开平2-48509)，将含有多粘芽孢杆 菌NT-107 (Bacillus polymyxa NT-107)及/或枯草芽孢杆菌NT-107 (Bacillus subtilis NT-107)的资材直接散布于马铃薯上或散布于栽培土壤中的方法(日 本特开200卜327281)，将含有芽孢杆菌MK-1-1株的资材散布于马铃薯栽培土壤 中的方法(日本特开2004-2390)。但是，对于实际上是何种物质对病原菌即链霉菌属菌具有抗菌性，上述任 一种通过微生物的方法中均未作任何说明。至今为止已报道的来自枯草芽孢杆菌的抗菌化合物， 一般已为人所知的有 伊枯草菌素(Itsurin) (Peypoux et al. Biochemistry, 17， 3992-3996 (1978))、 枯草菌月旨月太 (surfactin ) (Vollenbroich et al.Appl. Environ. Microbiol. ，63(1) :44-9(1997))等的环肽化合物，但对于疮痂病病原菌即链霉 菌属放线菌的抗菌作用却不为人所知。另外，在日本特开平6-135811中报道了通过并用枯草菌脂肽可提高伊枯草 菌素对植物病原菌的抗菌作用，且单独使用枯草菌脂肽不具抗菌作用，但对于 疮痂病病原菌即链霉菌属放线菌的抗菌作用却没有任何论述。发明内容鉴于上述现状，本发明的目的在于提供高效且安全的、在大田实际栽培时 也能使用的、用于防除包括马铃薯在内的农作物疮痂病的组合物，以及使用了 该组合物的农作物疮痂病的防除方法。为解决本发明者所关注的课题，针对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )培养液的成分进行锐意研究，结果发现式I的化合物或其盐对农作物疮痂病病原菌即链霉菌属放线菌具有抗菌活性，从而完成了本发明。因此，本发明涉及含有式I的化合物或其盐的用于防除农作物疮痂病的组合物，特别涉及用于防除马铃薯疮痂病的组合物。 式I<formula>formula see original document page 6</formula>其中，R是C" Cm綜基，X从Leu、 Val或Ile中选择。本发明优选含有枯草菌脂肽(式n)或其盐的用于防除农作物疮痂病的组合物。式n<formula>formula see original document page 6</formula>本发明涉及按游离体换算，式I的化合物或其盐的浓度为l 10mg/kg的用 于防除疮痂病的组合物。本发明还进一步涉及含有式I的化合物或其盐的、用于防除以链霉菌属放 线菌为病原菌的疮痂病的组合物。例如，上述链霉菌属放线菌是Str印tomyces turgidiscabies。本发明涉及含有式I的化合物或其盐的用于防除农作物疮痂病的组合物， 进一步涉及含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )的菌体、优选枯草芽孢 杆菌SAM2267株(FERM P-17761)的菌体的用于防除的组合物。本发明涉及含有式I的化合物或其盐的用于防除农作物疮痂病的组合物， 其是含有沸石或咖啡提取残渣、茶类提取残渣等食品工业废弃物的用于防除的 组合物。且本发明还涉及农作物疮痂病的防除方法，其使用含有式I的化合物或其 盐的用于防除农作物疮痂病的组合物。例如，其是通过使上述组合物与种薯接触进行防除、通过在植物体上散布上述防除组合物进行防除、或通过将上述防 除组合物混合或散布于土壤中进行防除的方法。通过将上述防除组合物混合或散布于土壤中的农作物疮痂病的防除方法，是将每单位面积的土壤中按游离体换算后0.01 5mg/m2的量的式I的化合物或 其盐混合或散布于土壤中。且本发明涉及式I的化合物或其盐的使用，其用于阻碍包括马铃薯在内的 农作物疮痂病病原菌即链霉菌属放线菌的增殖。本发明涉及农作物的栽培方法，其在农作物的栽培中使用含有式I的化合 物或其盐的防除组合物。
图1表示琼脂培养基中枯草菌脂肽钠(Surfactin sodium)的浓度对于枯草菌脂肽钠对马铃薯疮痂病病原菌的抗菌作用的影响的结果。培养基中枯草菌脂 肽钠的浓度的影响为A:0ug/ml， B: 10ug/ml， C: 50ug/ml， D: 100ug/ml。图2表示通过纸片法探讨枯草菌脂肽浓度对于枯草菌脂肽对马铃薯疮痂病 病原菌的抗菌作用的影响的结果。用甲醇溶解的枯草菌脂肽浓度为B: 0.01mg/ml， C: 0. lmg/ml， D: 1.0mg/ml，液量为50ul。 A为对照，浸入50ul甲醇。图3表示通过纸片法探讨枯草菌脂肽添加量对于枯草菌脂肽对马铃薯疮痂 病病原菌的抗菌作用的影响的结果。用甲醇溶解的枯草菌脂肽为10mg/ml，分别 取其10ul (B)、 50 ul (C)、 100 ul (D)浸入纸片。A为无添加。
具体实施方式
用于防除农作物疮痂病的组合物本发明中所述的"农作物"包括甜菜、胡萝卜、萝卜及马铃薯等所有可患 疮痂病的农作物。本发明中所述的"疮痂病"是土壤传染病害，是由放线菌引起的疾病。病 斑为疮痂状，与病原菌的种无关，因环境条件不同而形成凹陷型和隆起型。本说明书中所述的"疮痂病防除"包括基于阻碍疮痂病病原菌即链霉菌属 放线菌生长发育的作用预防疮痂病、轻度及/或低频度地控制疮痂病的发生以及 抑制疮痂病的发展。本发明的用于防除农作物疮痂病的组合物含有式I的化合物或其盐，优选含有枯草菌脂f太(式n)或其盐。且式I中的R是Cn d4烷基，烷基是指直链垸烃或支链垸烃。即C C14烷基部分存在直链结构和分支位置不同的结构，优选环结构一侧的C7部分为直 链结构，进一步优选环结构一侧的C9部分为直链结构。 式iR-CHCH2C0—L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-X其中，R是d
C,4烷基，X从Leu、 Val或Ile中选择。式nR-CHCH2C0—L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-X I-0-1其中，R二(CH2)9—CH(CH3)2 X二Leu枯草菌脂肽是从枯草芽孢杆菌的培养液中通过提取、分离而发现的物质， 如上式所示其分子是由7分子氨基酸组成的环肽的亲水性部分和由长脂肪酸残 基组成的疏水性部分构成。氨基酸包括1分子L-谷氨酸、1分子L-天冬氨酸、2 分子D-亮氨酸、2分子L-亮氨酸。脂肪酸部分存在链长和分支位置不同的多种 物质。皮肤一次刺激性极低，生物降解能力良好。由广泛用作洗面奶、香波等 的材料上可知，其是安全性高的物质。本发明的用于防除农作物疮痂病的组合物的成分即式I的化合物或其盐， 可以是这些化合物中的任一个，也可以是这些多个物质的混合物。且式I的化合物的盐，例如可以是如钠、钾、钙、镁的碱金属或碱土金属盐，赖氨酸等的 氨基酸盐或铵盐，如盐酸、硝酸的无机酸盐，乙酸、柠檬酸的有机酸盐中的任 一个，也可以是水合物等的溶剂化物。其中，可优选使用钠盐及游离体。式I的化合物或其盐，可来自微生物、合成品等，无特别限定，也可使用 市售品。且使用来自微生物的物质时可精制后使用，也可使用来自含有式I的 化合物或其盐的微生物的组分，例如菌体或其提取物等。为通过使用微生物的方法获得式I的化合物或其盐，可进行培养、提取、 根据需要进行分离、精制的工序。使用的菌株只要是具有阻碍原菌的链霉菌属 菌增殖活性的枯草芽孢杆菌，可为任意菌株。枯草芽孢杆菌的培养可使用本领 域技术人员周知的方法进行。从枯草芽孢杆菌培养液中提取式I的化合物或其 盐，例如可通过溶剂萃取进行。例如，可使用乙酸乙酯或比乙酸乙酯极性稍高 的溶剂，使用可充分混合混合液的装置进行。分离、精制可通过本领域技术人 员熟知的方法或其方法的组合进行。例如，可通过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等进行分离精制。经分离的成分的结构可通过丽R、 GC-MS、 IR等一般分析手段的组合确认。对于马铃薯疮痂病病原菌即链霉菌属放线菌的式I的化合物或其盐的抗菌 活性，可通过本领域技术人员周知的试验方法确认。例如，在预先灭菌的纸片 上浸入枯草菌脂肽类型的肽后使其干燥，将其置于链霉菌属菌的孢子平板中央， 通过测定经一定时期培养后的抑菌圈半径进行评价。本发明的用于防除农作物疮痂病的组合物中，按该组合物中的游离体换算， 优选所含有的式I的化合物或其盐为0. 1 100mg/kg程度，更优选为l 10mg/kg。本发明的用于防除农作物疮痂病的组合物可含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌体，优选含有枯草芽孢杆菌SAM2267株(FERM P-17761)的菌体。 该菌体可通过将枯草芽孢杆菌以适合其生长发育的条件培养后回收菌体来获 得。该菌体可以是干燥菌体或湿菌体。且该菌体也可以不作为本发明的用于防 除农作物疮痂病的组合物的成分，而另行散布于土壤中。本发明的用于防除农作物疮痂病的组合物也可含有农用资材。农用资材中包括可用于农作物栽培的土壤、蛭石等的土壤替代物，沸石等的土壤改良资材， 肥料、食品工业废弃物等的有机质资材及使这些资材发酵(优选好气发酵)后 的发酵产物以及这些资材的组合。其中，优选食品工业废弃物、沸石。食品工业废弃物，可来自原料、产品成分、制造工序或排水等，只要是进 行直接或发酵等处理后可还原于土壤的物质，无特别限定。例如，可为从啤酒 工厂等排放的糖化渣、酵母废弃物、麦芽根(麦芽制造工序中产生的来自麦芽 的副产物)、葡萄渣、活性炭及污泥以及上述物质的组合等。其中，咖啡提取残 渣及/或茶类提取残渣为优选实例。咖啡提取残渣或茶类提取残渣是指例如在饮 料制造工场或咖啡馆、快餐店等外卖食品工业中产生的、咖啡或茶类提取后的 残渣。咖啡提取残渣或茶类提取残渣可单独或组合后使用。本发明的组合物在甜菜、胡萝卜、萝卜及马铃薯疮痂病的防除中特别有效， 对马铃薯疮痂病防除尤其有效。农作物疮痂病的防除方法本发明农作物疮痂病的防除方法，是使用含有式I的化合物或其盐的防除 农作物疮痂病的组合物防除疮痂病。该方法例如包括1)使含有式I的化合物或其盐的防除农作物疮痂病的组合物与种薯接触的工序，2)将含有式I的化合物 或其盐的防除农作物疮痂病的组合物散布于植物体的工序，3)将含有式I的化 合物或其盐的防除农作物疮痂病的组合物混合或散布于土壤中的工序。将含有式I的化合物或其盐的防除农作物疮痂病的组合物混合或散布于土 壤中的方法，优选将每单位面积的土壤中按游离体换算后为0.001 50mg/m2、 更优选为0.01 5mg/m2的量的式I的化合物或其盐混合或散布于土壤中。本发 明的方法，在农作物开始栽培前单次添加于土壤中时，可在农作物栽培期间发 挥持续的抗菌效果。农作物的栽培方法本发明的农作物栽培方法是使用含有式I的化合物或其盐的防除组合物防 除疮痂病，同时栽培农作物。疮痂病的防除可通过1)使含有式I的化合物或其盐的防除农作物疮痂病的组合物与种薯接触，2)将含有式I的化合物或其盐的防除农作物疮痂病的组合物散布于植物体，3)将含有式I的化合物或其盐的防除农作物疮痂病的组合物混合或散布于土壤中来进行。通过实验例及实施例进一步详细说明本发明，但本发明不只限定于上述范围。实施例实施例1.针对马铃薯疮痂病病原菌的抗菌活性的评价培养基中枯草菌脂 肽钠浓度的影响制备含有最终浓度为10 u g/ml、 50 u g/ml、 100 ix g/ml的枯草菌脂肽钠(和 光纯药工业株式会社制以下实施例中也同样)的琼脂培养基(将可溶性淀粉 10g、蔗糖lg、酵母膏lg、 KH2P04 0. lg、 NaN03 0. lg、 KC1 0. lg、 MgS04 '7H20 0. lg、 琼脂15g溶解于1L蒸馏水中，调整到pH 7.0)和作为对照不含枯草菌脂肽钠 的琼脂培养基(组成与上述相同)，在琼脂培养基上涂抹马铃薯疮痂病病原菌即 Streptomyces turgidiscabies 91SY-12 ( Streptomyces turgidiscabies 91SY-12,以下为91SY-12株)的孢子悬浮液，30。C培养3日。其结果，枯草菌 脂肽钠浓度为10ug/ml、 50ug/ml、 100ug/ml的任一个时，孢子形成均有受 抑制的趋势(图1)。实施例2.针对马铃薯疮痂病病原菌的抗菌活性的评价(纸片法)枯草菌 脂肽浓度的影响在实施例1中所示的琼脂培养基上(不含枯草菌脂肽或枯草菌脂肽钠)涂 抹91SY-12株的孢子悬浮液，放置4张纸片(直径8毫米)。使纸片渗入用甲醇 溶解的枯草菌脂肽溶液，量为50u 1恒定，改变枯草菌脂肽的浓度为0mg/ml、 0.01mg/ml、 0.1mg/ml、 1.0mg/ml。 30。C培养6日的结果，单独为甲醇时与枯草 菌脂肽浓度为0. 01mg/ml时，对孢子形成无抑制效果，但当浓度为0. lmg/ml时， 虽然效果弱但也可抑制孢子的形成，浓度为1. Omg/ml时，孢子的形成受到强烈 阻碍(图2)。实施例3.针对马铃薯疮痂病病原菌的抗菌活性的评价(纸片法)枯草菌 脂肽添加量的影响与实施例2相同，在琼脂培养基上涂抹91SY-12株的孢子悬浮液，放置4 张纸片(直径8毫米)。在甲醇中溶解枯草菌脂肽，使浓度为10mg/ml，将其 10yl、 50ul、 100ul分别浸入到纸片上。30。C培养11日的结果，枯草菌脂肽 的任一添加量均强烈阻碍孢子的形成(图3)。实施例4.用于防除马铃薯疮痂病的组合物的使用将O.lg枯草菌脂肽钠溶解于20升水中，与100kg沸石混合，制备用于防 除疮痂病的组合物。将上述组合物散布于10公亩耕地上后种植马铃薯。在该耕 地上未发生疮痂病，可获得良好的马铃薯。实施例5.用于防除马铃薯疮痂病的组合物的使用以乌龙茶提取残渣、咖啡提取残渣、污泥为原料制成堆肥。将0.1g枯草菌 脂肽钠溶解于30升水中，与上述堆肥30kg、沸石70kg混合，制备用于防除疮 痂病的组合物。将上述组合物散布于10公亩耕地上后种植马铃薯。在该耕地上 没有发生疮痂病，可获得良好的马铃薯。对于来自枯草芽孢杆菌培养液的抗菌性化合物的报道有很多，但式I的化 合物或其盐可阻碍疮痂病病原菌链霉菌属菌的生长发育这个结论在由本发明者 证明之前还不为人所知。其中，从枯草菌脂肽广泛用于洗面奶、香波等中可知， 其高度的安全性已被证实。本发明不仅是用于防除包括马铃薯在内的农作物疮 痂病病原菌的有力手段，还可期待其能解释证明对于疮痂病菌的拮抗作用的原 理等。
权利要求
1.一种用于防除农作物疮痂病的组合物，其含有式I的化合物或其盐，式I其中，R是C11～C14烷基，X从Leu、Val或Ile中选择。
2. 权利要求1中所述的组合物，其中，式I的化合物是枯草菌脂肽。
3. 权利要求1中所述的用于防除疮痂病的组合物，其含有按游离体换算浓 度为l 10mg/kg的式I的化合物或其盐。
4. 权利要求3中所述的用于防除的组合物，其中，式I的化合物是枯草菌 脂肽。
5. 权利要求1 4中任一项所述的用于防除的组合物，其中，农作物疮痂 病是马铃薯疮痂病。
6. 权利要求1 4中任一项所述的用于防除的组合物，其中，农作物疮痂 病是以链霉菌属放线菌为病原菌的疮痂病。
7. 权利要求6中所述的用于防除的组合物，其中，链霉菌属放线菌为 Streptomyces turgidiscabies。
8. 权利要求1 7中任一项所述的用于防除的组合物，其中，进一步含有 枯草芽孢杆菌的菌体。
9. 权利要求1 8中任一项所述的用于防除的组合物，其中，迸一步含有 农用资材。
10. 权利要求9中所述的用于防除的组合物，其中，农用资材为沸石。
11. 权利要求9中所述的用于防除的组合物，其中，农用资材为食品工业 废弃物。
12. 权利要求11中所述的用于防除的组合物，其中，食品工业废弃物为咖 啡提取残渣及/或茶类提取残渣。
13. 农作物疮痂病的防除方法，其使用权利要求1 12中任一项所述的防除组合物。
14. 权利要求13中所述的方法，其特征在于，使权利要求1 12中任一项 所述的防除组合物与种薯接触。
15. 权利要求13中所述的方法，其特征在于，将权利要求1 12中任一项 所述的防除组合物散布在植物体上。
16. 权利要求13中所述的方法，其特征在于，将权利要求1 12中任一项 所述的防除组合物混合或散布于土壤中。
17. 权利要求16中所述的方法，其中，将每单位面积的土壤中按游离体换 算后为0. 01 5mg/m2的式I的化合物或其盐混合或散布于土壤中。
18. 式I的化合物或其盐的使用，其用于阻碍包括马铃薯在内的农作物疮 痂病病原菌即链霉菌属放线菌的增殖。
19. 农作物的栽培方法，其特征在于，在农作物的栽培中使用权利要求l 12中任一项所述的防除组合物。
全文摘要
本发明涉及含有式I的化合物或其盐的用于防除农作物疮痂病的组合物。本发明还进一步涉及农作物疮痂病的防除方法，其使用含有式I的化合物或其盐的用于防除农作物疮痂病的组合物。
文档编号C07K7/02GK101257799SQ20068003228
公开日2008年9月3日 申请日期2006年9月28日 优先权日2005年9月30日
发明者佐伯雄史, 大和田二, 小村启, 木下干朗 申请人:三得利株式会社