柑橘防腐保鲜生防菌34－9，含有该菌的菌剂及发酵工艺与应用的制作方法

专利名称：柑橘防腐保鲜生防菌34－9，含有该菌的菌剂及发酵工艺与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于果蔬贮藏保鲜技术领域，具体地说涉及一种用于果品蔬菜特别是柑橘防腐保鲜生防菌34-9的分离筛选，含有该菌的菌剂以及该菌剂的发酵工艺与应用。
背景技术：
2001年我国柑橘面积已达132万公顷、年产量达1160.7万吨，面积居世界第一位，产量居世界第三位，是仅次于巴西和美国的第三大柑橘主产国。我国柑橘的成熟期主要集中在每年的9-12月，大量的柑橘果品除供应市场外需要进行贮藏保鲜。
柑橘安全防腐保鲜直接关系到我国柑橘业的内、外贸易的发展和增加橘农的收入的一个十分迫切的问题。目前柑橘贮藏中的病害主要是青霉病、绿霉病、褐腐病和蒂腐病等常见贮藏病害。目前比较肯定的效果仍以化学药剂保鲜为主，公认多菌灵和2，4-D的组合药剂效果最好，但是化学保鲜剂对人体健康影响和对环境的污染是一个不争的事实，生产上急需研制一种既有良好的保鲜效果，又尽可能地减少污染的保鲜剂(邓伯勋著，柑橘果品贮藏保鲜技术，中国农业科技出版社，1992年，北京；邓伯勋主编，园艺产品贮藏运销学(面向二十一世纪课程教材)，中国农业出版社，2002年，北京)。针对柑桔及其果品保鲜的安全问题，我国农业部在2001年就颁布了无公害柑桔食品的行业标准-NY5014-2001，对柑橘等果品的安全生产进行了严格的技术规范。
应用生防菌中的抗生菌抑制柑橘的贮藏病害国内外已有一些报道，例如已故的知名园艺学家章文才教授在上世纪七十年代初就提出了应用“5406”生防菌(一种真菌)V14抗生菌悬浮液防治柑橘黑腐病，经1972-1974年试验证明，V14抗生菌悬浮液对于柑橘黑腐病有显著的抑制作用(见华中农学院宜昌分院果树专业编著，柑橘-生产技术与科学实验，科学出版社，1977年，北京)。经检索，在现有的专利和非专利文献中没有一篇涉及本发明主题的文献报道。申请人检索到专利申请号为01109245.9“一种防治果蔬采后软腐病的生物防治拮抗菌(BAY-1)及技术使用方法”和申请号为011118646.1“一种防治果树采后青霉和灰霉等主要病害的生物防治拮抗菌(BAY-2)及技术使用方法”，发明人分别从桃果实的伤口上分离得到一种BAY-1拮抗菌株和一种BAY-2拮抗菌株，属于酵母类真菌，据称能够对桃软腐病、苹果青霉病和苹果灰霉病有一定的保鲜效果。该发明的主题与本发明的主题明显不同，同时该专利申请公开不充分(例如用于专利程序的菌株未送交保藏，详细的制备方法也未完全公开)，从而使本领域的技术人员难以实施。

发明内容
本发明的第一个目的是克服现有技术存在缺陷，从自然环境中分离筛选出一株对柑橘青、绿霉病菌有特异抑制能力的酵母菌株；本发明的第二个目的是采用含有该菌株和辅助成分制备用于果蔬保鲜的生物保鲜剂；第三个目的是研制制备该生物保鲜剂方法；第四个目的是该生物保鲜剂在果品或蔬菜上的应用，以克服目前化学保鲜剂对果品和蔬菜的污染，或者现有生防菌针对性不强，以提高果品和蔬菜的保鲜效果，并提高对柑橘青霉病和绿霉病抑制的特异性。
本发明通过以下技术方案实现一种用于果蔬防腐保鲜的和对柑橘青霉病(Penicillium italium Wehmer)、绿霉病(Penicillium digitalum Sace)有抑制能力的生防菌为林德纳克勒克酵母(Kloecheralindneri)34-9，保藏在CCTCC NO.M204025。
一种用于果蔬防腐保鲜的生防菌菌剂，其特征在于，1)含有对柑橘青霉病(Penicillium italium Wehmer)、绿霉病(Penicilliumdigitalum Sace)有抑制能力的生防菌为林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，保藏在CCTCC NO.M204025；2)将该生防菌制备成液体菌剂或者固体菌剂；3)所述的液体菌剂可以是不浓缩的或浓缩的；4)所述的液体菌剂中加入或不加入乳化剂，所述的乳化剂为1-3％农乳100；5)所述的固体菌剂是干酵母、压榨酵母或酵母乳。
一种用于果蔬防腐保鲜的生防菌剂的制备方法，其中的液体菌剂的制备包括下列步骤1)斜面试管菌种的培养将保藏的34-9菌株接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％琼脂配制的斜面固体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养4-5d，使其活化即为斜面菌种；2)液体试管培养将步骤1)制备的斜面菌株接种于按常规方法灭菌的并加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养1-2d，即为试管菌种，然后接入三角瓶进行扩大培养；3)三角瓶培养将步骤2)的试管菌种接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养24-30小时，即为三角瓶菌种，然后接入玻璃瓶培养；4)玻璃瓶或卡氏罐培养。配制20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基，分装入10L细口玻璃瓶(或卡氏罐)中，该培养基的pH自然，将该玻璃瓶或卡氏罐在100℃蒸煮1小时以上灭菌，冷却后加入亚硫酸盐最好是亚硫酸钠，使二氧化硫含量达80mg/L，4-8小时后接种步骤3)的所述的三角瓶菌种，摇匀，于20-25℃条件下培养2-3天(d)，培养期间需摇动数次，增加其通气，然后接入培养罐培养；5)发酵罐培养将200-300L带盖木桶或不锈钢罐用常规的硫磺烟熏蒸杀菌，按所述木桶或不锈钢罐容积的80％加入100-150mg/L亚硫酸盐，最好是亚硫酸钠、过4小时后加入20％豆芽汁、5％葡萄糖和水配制的液体培养基，培养基的pH自然，摇匀，静置过夜，吸取上清液至另一桶中，剩余菌液放弃；再在装有添加20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基接种步骤4)的菌液，在25℃条件下培养，每天用酒精消毒的木耙搅动1-2次，加速酵母生长繁殖，2-3天，取其中2/3菌液作为配制商业液体菌剂的母液；留下1/3的菌液作为种子液循环使用，将该种子液转接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基继续培养，培养基的pH自然，即成为下一次使用的用于配制商业液体菌剂的母液，循环该制备步骤；6)在步骤5)的母液中加入乳化剂所述的乳化剂为1-3％农乳100(江苏省海安石油化工厂生产)即为商业液体菌剂产品。
在本发明中，34-9菌剂可以通过固体发酵工艺进行制备，其具体步骤是一种制备用于果蔬防腐保鲜的生防菌剂的制备方法，其中固体菌剂的制备包括下列步骤1)斜面试管菌种的培养将保藏的34-9菌株接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％琼脂配制的斜面固体培养基上，培养基的pH自然，在25℃条件下培养4-5天，使其活化即成为斜面菌种；2)菌种液体试管培养将步骤1)制备的斜面菌株接种于按常规方法灭菌的并加有20％豆芽汁和5％葡萄糖配制的液体培养基上，培养基的pH自然，在25℃条件下培养1-2d，即为试管菌种，然后接入三角瓶进行扩大培养；3)菌种的三角瓶培养将步骤2)的试管菌种接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养24-30小时，即为三角瓶菌种，然后接入玻璃瓶培养；4)制作罐头瓶固体菌种按重量百分比称取20％的豆芽汁作基本培养基，加5％的葡萄糖，再添加1-5％膨润土，3-5％麦麸，补充适量的水，水的添加量以手捏培养基成团，松开后培养基立即分散的含水量即可；然后分装于普通玻璃罐头瓶，瓶口用纸和橡皮筋封口，在0.1Mpa下灭菌30min，冷却10min后接种上述步骤3)制备的三角瓶液体菌种，28℃培养48小时，使之成为罐头瓶固体菌种；5)将步骤4)的固体菌种接种到如步骤4)培养基成分相同的发酵罐中，发酵温度控制在25-28℃，发酵48小时，即为固体菌剂；
6)在45-50℃下将步骤5)的的菌剂烘干，粉碎。
含有林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCC NO.M204025的菌剂，其特征在于该菌剂在柑橘和番茄上的应用。
一、菌株的分离、筛选如附图1所示，本发明的菌株的分离、筛选和鉴定参照《微生物学实验手册》、《酵母菌的特征与鉴定手册》、《微生物实验技术教程》和《真菌鉴定手册》，菌株34-9是从中国湖北省宜昌、湖南省石门和江西省新干等柑橘集中产区的橘园土壤和柑橘果实表面的混合菌中分离得到384个候选菌，在选择其中的酵母菌进行分离、纯化，在培养基上作拮抗实验，得到34-9的酵母菌的初选株，再经过抗生素、拮抗接种(果实表面)和贮藏保鲜实验，得到编号为34-9酵母菌，经鉴定34-9菌株为林德纳克勒克酵母菌(Kloecheralindneri)，该菌对柑橘青、绿霉病菌有明显的抑制作用，其最显著的特点是菌株不产生抗生素，用于果蔬保鲜安全、无毒，本发明的详细技术内容将由实施例给出。
二、34-9菌株的保藏按《微生物学实验技术手册》操作。
三、34-9的菌株的菌学特征34-9菌株菌体大小为0.6-1.4×0.5-1.0um，细胞卵圆形或柠檬形，细胞极性出芽，两端芽殖、很少有假菌丝，液无环，无子囊孢子。在豆芽汁葡萄糖琼脂平板上形成的菌落黄白色、边缘波状、表面隆起、有光泽。发酵葡萄糖，不发酵蔗糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖和棉子糖；碳源同化葡萄糖、纤维二糖，不同化蔗糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖和棉子糖等；氮源同化硫酸铵，不同化硝酸钾；醇类都为阴性；37℃不生长；在无维生素培养基上呈阴性；不产生淀粉；在50％和60％的葡萄糖培养基上不生长。
34-9菌株在分类学上属于林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为NO.M204025，保藏日期2004年3月18日，用于商业贮藏保鲜的固体34-9菌剂至少含有林德纳克勒克酵母活菌40-100亿个/克，液体菌剂含有酵母活菌10-100亿个/毫升。本发明的固体菌剂和液体菌剂可以在采收后的柑橘果品上以浸泡方式处理，也可以在柑橘采收前15天喷洒。使用时以适量自来水将含有酵母菌34-9菌剂活化2-3小时后，采前应用的使用浓度为1010加水全果面均匀喷洒(因菌液的活菌数量的不同，稀释菌剂时添加适量的水，采前菌剂使用树上果实的喷雾浓度最好高于采后的果实的浸泡处理的浓度。采后应用的使用浓度以108菌剂浸泡果实(因菌液的活菌数量每一批次有所不同，稀释菌剂时根据最终要求的酵母菌的活菌数适当添加水)。贮藏设施、条件缓和日常管理按照华中农学院宜昌分院果树专业编著《柑橘-生产技术与科学实验》，科学出版社，1977年版执行。
与已有技术相比本发明的积极效果是
1、本发明菌剂酵母菌34-9对柑橘青霉病和绿霉病病菌有明显的抑制作用，初步实验表明本发明的菌剂对采前或采后柑橘果实的柑橘青霉病和绿霉病的防病率(以好果率计)达到90％以上，对采前或采后的脐橙、番茄果实的病害的抑制也有较好效果。
2、本发明酵母菌34-9菌株不产生抗生素，因而作为一种新的生防菌在果品和蔬菜保鲜上应用将更加安全、无毒。


图1是本发明总体技术路线图。
图2是本发明的固体发酵工艺流程图。
图3从样品中分离筛选的酵母菌(在试管斜面上划线贮藏备用)的状况图。
图4在绿霉菌浓度为105个/ml培养皿中，酵母菌34-9与柑橘绿霉菌之间拮抗后的抑菌圈的大小，显示34-9能够明显地抑制柑橘绿霉病菌的发生。
图5106cfu/ml的酵母菌34-9对105spores/ml的青霉病菌的抑制效果，图中显示在整个培养皿中只生长酵母，不生长柑橘青霉病菌；图6200mg/L的多菌灵抑制柑橘青霉(105spores/ml)的效果，图中显示在整个培养皿中不生长柑橘青霉病菌；图7在同样的针刺接种和培养条件下，本发明的菌株在柑橘表面抑制青霉病病菌的比较图上为只接种柑橘青霉菌 图下为接种酵母菌34-9，再接种青霉菌；图8在培养皿上接种酵母菌34-9显示不产生抗生素的情况，图左30mg/L制霉菌素接种后的效果；图右用酵母菌34-9离心后的上清液接种后的效果。
图9、用本发明的生物保鲜剂喷洒在柑橘果实7天后在果实表面数量分布情况。
图10用本发明的菌剂处理温州蜜柑果实的防腐效果，图示状况表明，用本发明的菌剂处理温州蜜柑果实，然后用薄膜单果包装与未薄膜单果包装的防腐效果相当。
具体实施例方式
实施例1菌株的分离、鉴定与筛选1、分离培养基的制备(1)豆芽汁培养基制备按重量计称取黄豆芽500g，加水2500mL，煮沸0.5h，过滤后补足水分至2500mL，在0.1Mpa湿热灭菌后存放备用，即为20％的豆芽汁。用于酵母菌34-9培养培养基配比20％豆芽汁200g、葡萄糖50g、水1000mL，自然PH；用于对照处理即柑橘青霉菌和绿霉菌的培养基配比20％豆芽汁200g，蔗糖50g，水1000mL，培养基PH自然。
2、分离方法(稀释平板法)。
2.1样品稀释液的制备用1ml无菌吸管吸取富集培养液1ml，放入装有9ml无菌水的试管中，振荡混匀即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管吸取10-1稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10-3稀释液；以次类推，每次一定要更换吸管，连续稀释至10-4、10-5、10-6、10-7稀释度。
2.2平板接种培养采用涂抹平板法；先将培养基融化后趁热倒入无菌培养皿中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀。再每次涂抹前将刮铲灼烧灭菌。将涂抹好的平板平放于桌上20-30分钟，使菌液渗透于培养基内，然后将平板倒转，保温培养2-3天。
3、挑菌纯化从培养过的平板中选取分离较好的酵母菌菌落转接斜面。酵母菌落与细菌相仿，一般都有湿润，较光滑，有一定的透明度，容易挑起等特点。酵母菌菌落的颜色比较单调，多数都呈乳白色，少数为红色，个别为黑色。酵母菌菌落一般还会散发出一股悦人的酒香味。
4、菌株筛选4.1酵母菌与病菌之间拮抗、嗜杀作用测定采用移块画线法测定，评价酵母菌对柑橘贮藏主要病害青霉病Penicillum ItalicumWehmer.)绿霉病(Penicillum digitalum Sace.)的防治效果和作用，以及酵母菌与病菌之间的相互作用。试验设计为初步用所分离的酵母菌以不同浓度的酵母菌与病菌之间和不同种类的酵母菌的组合与病菌之间的拮抗、嗜杀作用、初筛，然后对有拮抗作用的酵母菌进行鉴定、实验。
4.2有益微生物效价的测定采用管碟法或琼脂移块法，评价有益微生物的遗传性，竞争生长能力，逆境条件下的生存能力，以及柑橘果实贮藏病原菌的有效程度。
5、酵母菌的鉴定结合菌株的形态学特征、培养特征、生理生化特征，参考《微生物学实验手册》、《酵母菌的特征与鉴定手册》、《微生物实验技术教程》和《真菌鉴定手册》等文献，将酵母菌鉴定到种。鉴定本发明的菌株34-9为林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)。
林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9菌株的保藏培养基为豆芽汁葡萄糖培养基豆芽500g，葡萄糖125g，水2500ml，琼脂50g，培养基pH自然。
分析、比较表明，酵母菌34-9菌株是一株在柑橘病害的生物防治方面具有重要应用价值的酵母菌，特别是对柑橘青、绿霉病菌有明显的拮抗能力和抑制作用。其效果如图2、图3、图4、图5所示。实验表明，在适宜的温度和通气条件下，该菌对柑橘青霉病和绿霉病有明显的抑制效果。
实施例2 34--9菌剂的固体发酵工艺1、菌种的斜面试管培养、液体试管培养和三角瓶培养按照上述的发明步骤进行；2.罐头瓶固体菌种扩大培养基本培养基为20kg豆芽汁，再添加膨润土10kg，麦麸3kg、葡萄糖5kg，pH自然，(在另外的实施例中膨润土、麦麸葡萄糖的实际添加量可按照本发明前面所述的比例范围内加入)，水100L，调料拌匀后将培培养基分装于160个罐头瓶中，28℃培养48小时。
3.固体高密度发酵生产在搅拌机中按以下配方调好料，培养基配比豆芽汁200kg、膨润土100kg、麦麸30kg、葡萄糖50kg、水1000kg，pH自然。将培养基输送到灭菌池中灭菌，冷至28℃接种罐头瓶固体菌种，按固体发酵工艺发酵，通无菌风，控制温度在25-28℃，48小时发酵完成，即为固体菌剂，在45-50℃条件下烘干，粉碎，检验，包装即为固体菌剂产品。
实施例334-9液体菌剂的发酵工艺1)斜面试管菌种的培养将保藏的34-9菌株接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％琼脂配制的斜面固体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养4-5d，使其活化即为斜面菌种；2)液体试管菌种培养将步骤1)制备的斜面种株接种于按常规方法灭菌的并加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基(pH自然)上，在25℃条件下培养1-2d，即为试管菌种，然后接入三角瓶进行扩大培养；3)三角瓶菌种培养将步骤2)的试管菌种接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖和水配制的三角瓶液体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养24-30小时，即为三角瓶菌种，然后接入玻璃瓶培养；4)菌种的玻璃瓶或卡氏罐培养。配制20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基，分装入10L细口玻璃瓶(或卡氏罐)中，该培养基的pH自然，将该玻璃瓶或卡氏罐在100℃蒸煮1小时以上灭菌，冷却后加入亚硫酸盐最好是亚硫酸钠，使二氧化硫含量达80mg/L，4-8小时后接种步骤3)的所述的三角瓶菌种，摇匀，于20-25℃条件下培养2-3d，培养期间需摇动数次，增加其通气，然后接入培养罐培养；5)发酵罐培养将200-300L带盖木桶或不锈钢罐用常规的硫磺烟熏蒸杀菌，按所述木桶或不锈钢罐容积的80％加入100-150mg/L亚硫酸盐，最好是亚硫酸钠、过4小时后加入20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基，培养基的pH自然，摇匀，静置过夜，吸取上清液至另一桶中，剩余菌液放弃；再在装有添加20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基接种步骤4)的菌液，在25℃条件下培养，每天用酒精消毒的木耙搅动1-2次，加速酵母生长繁殖，2-3天，取其中2/3菌液作为配制商业液体菌剂的母液；留下1/3的菌液作为种子液循环使用，将该种子液转接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基继作为种子液循环使用，将该种子液转接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基继续培养，培养基的pH自然，即成为下一次使用的用于配制商业液体菌剂的母液，循环该制备步骤；6)在步骤5)的母液中加入乳化剂即1-3％农乳100(中国江苏省海安石油化工厂生产)即为商业液体菌剂成品。
实施例434-9菌剂在柑橘果实贮藏中的应用为了验证酵母菌34-9菌剂对柑橘果实防腐保鲜的效果，申请人于2001-2004年度柑橘果实成熟季节，应用本发明的菌剂分别在湖北省武汉市、宜昌市、丹江口市、巴东县和江西省新干县等柑橘集中产区连续两年进行了34-9菌剂的保鲜柑橘果品的实验。贮藏保鲜的品种为无核温州蜜柑和脐橙。其中温州蜜柑为市场销量最大的宽皮类柑橘，易剥皮，采后果实易感染柑橘青霉病和柑橘绿霉病，是常用的贮藏实验品种，且实验效果易于评价。脐橙是国际市场销售的王牌水果，经济价值极高，作为本发明的应用对象也是十分有价值的。
所用的酵母菌34-9液体菌剂为含酵母菌活菌数10-100亿cfu/ml。实验设每处理3箱(每箱20公斤，约160个果实)，重复处理三次，设对照1为不处理(空白)，对照2为“多菌灵”(中国江苏省无锡农药厂生产)药剂处理，分别记作CK1和CK2。在柑橘基本成熟期采果，刚采下的果实及时用34-9菌液(浓度如上所述含酵母菌活菌数10-100亿cfu/ml)浸果，将果实晾干，1-2天后将处理过的果实用聚乙烯薄膜单果包装，置于纸箱内，纸箱外覆聚乙烯薄膜，贮藏室为自然室温(贮藏室消毒和管理参照《柑橘-生产技术与科学实验》，科学出版社，1977年版)，试验贮藏周期定为100天。从柑橘果实处理后入库开始，每天记录、观察柑橘果实感病(重点是柑橘青霉病和绿霉病)的发生时间和状况。将上述的液体菌剂(含酵母菌活菌数10-100亿cfu/ml)先用少量自来水活化2-3小时，之后将菌液稀释至1000倍，按上面的方法浸泡果实和日常管理。如果应用34-9固体菌剂，依照上述方法在固体兑水后的浸泡洗果菌液中的保持酵母菌活菌数10-100亿cfu/ml范围即可。
表1生防菌34-9液体菌剂及相关处理采后温州蜜柑贮藏试验设计1

试验品种为温州蜜柑，采收后立即处理。
表2生防菌34-9固体菌剂和药剂对不同产区采后温州蜜柑贮藏试验设计2

试验地点为湖北宜昌、丹江口、巴东和江西新干柑橘产区，贮藏品种为采收后立即处理的温州蜜柑果实。
表3柑橘果实感染柑橘青霉菌和绿霉病的情况处理即浓度 柑橘青霉菌柑橘绿霉菌其他的病害感染率(％)感染率(％)感染率(％)34-9(108CFU/ml) 5.3bc 4.0bc 12.7b34-9(106CFU/ml) 6.0bc 2.7bc 10.0b多菌灵 16.0b 10.0b 14.0bControl50.0a 40.0a 31.3a贮藏期为100天时记载的数据。
3、表面酵母菌的数量的测定柑橘果面施用含有本发明菌株34-9的菌剂后，立即开始测定柑橘果实表面的酵母菌的数量，以后每隔2天再测定一次，结果表明用本发明的34-9菌剂处理的柑橘果实上林德纳克勒克酵母的数量在105-107cfu/ml的范围内波动，刚刚开始时候数量很高。达到1010cfu/ml，大约10多天后数量维持在105-107cfu/ml的范围内。测定结果如图9所示。
4、贮藏后柑橘果实中的可溶性固形物、柠檬酸和维生素C的测定柑橘果实可溶性固性物测定采用用折光法；柠檬酸测定采用滴定法，维生素C的测定采用2，6二氯靛酚滴定法，参照华中农学院宜昌分院果树专业编著《柑橘-生产技术与科学实验》，科学出版社，1977年版)进行，测定结果如表4所示表4应用生防菌34-9对温州蜜柑贮藏后的主要理化指标的影响可溶性 柠檬酸 维生素C处理 固形物 (mg/100ml(％)(％)果汁)0d 50d 100d0d 50d 100d0d 50d 100d1 10.610.211.00.540.540.4036.g32.3 32.72 10.610.810.40.540.490.3736.833.6 32.93 10.610.611.00.540.510.4536.842.7 41.64 10.610.310.30.540.560.5336.832.8 31.45 10.610.512.00.540.530.5236.833.0 32.4
6 10.610.610.50.540.510.4836.835.3 33.41010.610.410.30.540.530.2936.834.9 33.4CK10.610.210.20.540.520.4236.835.5 34.7CK为清水。
实验表明，应用34-9菌剂处理柑橘后贮藏后的温州蜜柑果实中的可溶性固形物基本上没有什么变化，可溶性固形物在10.2％-12.0％之间变化，与对照没有差异。此外在柠檬酸和维生素C的等技术指标方面的变化与对照也没有差异。
表5应用34-9菌剂对温州蜜柑贮藏果实感官指标的影响处理新鲜度 评分 色泽 评分 质地 评分风味评分 总分1 新鲜6.85 橙黄 6.46 脆嫩 5.56甜酸适 6.38 25.25度2 新鲜6.64 橙黄 6.36 脆嫩 5.32甜酸适 6.42 24.74度3 新鲜6.32 橙黄 6.87 脆嫩 5.24甜酸适 6.25 24.68度3 新鲜6.32 橙黄 6.55 脆嫩 5.71甜酸适 6.36 24.94度4 新鲜6.22 橙黄 6.39 脆嫩 5.26味淡5.87 23.745 新鲜6.21 橙黄 6.46 脆嫩 5.44甜酸适 6.41 24.52度6 新鲜6.63 橙黄 6.35 脆嫩 5.48甜酸适 6.43 24.89度CK 较新鲜 5.87 橙黄 6.22 脆嫩 5.28甜酸不 6.35 23.72适6、贮藏100天后温州蜜柑主要贮藏病害的发生的情况表6应用34-9生防菌对温州蜜柑贮藏中主要病害的影响处理腐烂率柑橘青霉病(％)及发病时间 柑橘绿霉病(％)及发病时间 其他病害1 3.33病2002-12-24 0 10.002 3.332002-12-260 16.673 3.332002-12-120 16.674 6.672002-11-303.332002-12-1320.005 6.672002-11-223.332002-12-3 26.676 6.672002-10-313.332002-11-2626.6720 6.672002-12-226.672002-12-2326.67CK 10.00 2002-11-206.672002-11-2020.00
此外，34-9生防菌还可以在柑橘果实成熟前15天左右进行喷洒果实，喷洒剂的使用浓度要大于果实浸泡处理的浓度，使用浓度参见前面的描述。此外，申请人曾在采后番茄上进行过初步保鲜实验，表明34-9菌剂对番茄的防腐保鲜也有较好的效果。对于果皮紧密的脐橙的初步实验也表明，34-9生防菌菌剂对于脐橙防腐保鲜效果明显优于温州蜜柑果实的贮藏效果。
权利要求
1.一种用于果蔬防腐保鲜的和对柑橘青霉病(Penicillium italiumWehmer)、绿霉病(Penicillium digitalum Sace)有抑制作用的生防菌，其特征在于该菌为林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCCNO.M204025。
2.一种用于果蔬防腐保鲜的生防菌菌剂，其特征在于，1)含有对柑橘青霉病(Penicillium italium Wehmer)、绿霉病(Penicilliumdigitalum Sace)有抑制作用的生防菌林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCC NO.M204025；2)将该生防菌制备成液体菌剂或者固体菌剂；3)所述的液体菌剂可以是不浓缩的或浓缩的；4)所述的液体菌剂中加入或不加入乳化剂，所述的乳化剂为1-3％农乳100；5)所述的固体菌剂是干酵母、压榨酵母或酵母乳。
3.一种用于果蔬防腐保鲜的生防菌菌剂的制备方法，按照以下步骤制备1)斜面试管菌种的培养将保藏的34-9菌株接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％琼脂配制的斜面固体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养4-5d，使其活化即为斜面菌种；2)液体试管培养将步骤1)制备的斜面菌株接种于按常规方法灭菌的并加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基上，培养基pH自然，在25℃条件下培养1-2d，即为试管菌种，然后接入三角瓶进行扩大培养；3)三角瓶培养将步骤2)的试管菌种接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养24-30小时，即为三角瓶菌种，然后接入玻璃瓶培养；4)玻璃瓶或卡氏罐培养配制20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基，分装入10L细口玻璃瓶(或卡氏罐)中，该培养基的pH自然，将该玻璃瓶或卡氏罐在100℃蒸煮1小时以上灭菌，冷却后加入亚硫酸盐最好是亚硫酸钠，使二氧化硫含量达80mg/L，4-8小时后接种步骤3)的所述的三角瓶菌种，摇匀，于20-25℃条件下培养2-3d，培养期间需摇动数次，增加其通气，然后接入培养罐培养；5)发酵罐培养将200-300L带盖木桶或不锈钢罐用常规的硫磺烟熏蒸杀菌，按所述木桶或不锈钢罐容积的80％加入100-150mg/L亚硫酸盐，最好是亚硫酸钠、过4小时后加入20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基，培养基的pH自然，摇匀，静置过夜，吸取上清液至另一桶中，剩余菌液放弃；再在装有添加20％豆芽汁、5％葡萄糖和水配制的液体培养基接种步骤4)的菌液，在25℃条件下培养，每天用酒精消毒的木耙搅动1-2次，加速酵母生长繁殖，2-3天，取其中2/3菌液作为配制商业液体菌剂的母液；留下1/3的菌液作为种子液循环使用，将该种子液转接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液体培养基继续培养，培养基的pH自然，即成为下一次使用的用于配制商业液体菌剂的母液，循环该制备步骤；6)在步骤5)的母液中加入或不加入乳化剂1-3％农乳100即为液体菌剂产品。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，按照以下步骤制备1)斜面试管菌种的培养将保藏的34-9菌株接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％琼脂配制的斜面固体培养基上，培养基的pH自然，在25℃条件下培养4-5天，使其活化即成为斜面菌种；2)菌种液体试管培养将步骤1)制备的斜面菌株接种于按常规方法灭菌的并加有20％豆芽汁和5％葡萄糖配制的液体培养基上，培养基的pH自然，在25℃条件下培养1-2d，即为试管菌种，然后接入三角瓶进行扩大培养；3)菌种的三角瓶培养将步骤2)的试管菌种接种于按常规方法灭菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液体培养基上，该培养基的pH自然，在25℃条件下培养24-30小时，即为三角瓶菌种，然后接入玻璃瓶培养；4)制作罐头瓶固体菌种按重量百分比称取20％的豆芽汁作基本培养基，加5％的葡萄糖，再添加1-5％膨润土、3-5％麦麸、加适量的水，水的添加量以手捏培养基成团，松开后培养基立即分散的含水量即可；然后分装于普通玻璃罐头瓶，瓶口用纸和橡皮筋封口，在0.1Mpa下灭菌30min，冷却10min后接种上述步骤3)制备的三角瓶液体菌种，28℃培养48小时，使之成为罐头瓶固体菌种；5)将步骤4)的固体菌种接种到如步骤4)培养基成分相同的发酵罐中，发酵温度控制在25-28℃，发酵48小时，即为固体菌剂；6)在45-50℃下将步骤5)的菌剂烘干，粉碎。
5.含有林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCCNO.M204025的菌剂，其特征在于该菌剂在柑橘和番茄上的应用。
全文摘要
本发明属于果蔬保鲜技术领域。公开了一种对柑橘青霉病和绿霉病有抑制作用的生防菌即酵母菌34－9的分离筛选，还涉及用该菌株制备的保鲜剂以及该保鲜剂的制备工艺，还包括该保鲜剂的应用。其特征在于，所述的菌株为林德纳克勒克酵母(Kloechera lindneri)34－9，该菌株不产生抗生素。保藏在CCTCC，NO.M204025。其制备方法包括将所述的菌株先接种于种子培养基，再接种于扩大培养基，制备出所述的液体菌剂；或者将所述的菌株接种于固体种子培养基，然后再接种于罐头瓶培养基，生产出含有该酵母菌的固体菌剂。本发明已在柑橘和番茄贮藏保鲜中推广应用，柑橘经90天贮藏，好果率达90％以上。本发明减少了化学保鲜剂造成的污染，对人体无毒，是一种无公害的生物保鲜技术。
文档编号C12N1/16GK1563349SQ200410012938
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月30日 优先权日2004年3月30日
发明者邓伯勋, 龙超安, 邓秀新, 何秀娟, 何绍江, 武峥, 成协设, 史辉, 杨晓平 申请人:华中农业大学