本发明涉及一种防治花生根腐病的复合菌群及其应用，属于土传病害防治技术领域。
背景技术：
花生是我国的重要油料作物，常年播种面积占油料作物总播种面积的35％左右。限于耕地面积和农业产业化发展，花生集约化生产现象普遍，造成连作障碍问题突出。花生连作重茬往往导致土传真菌性病害加剧，其中根腐病是红壤地区花生连作地发病最为严重的病害，是制约当地花生生产的重要因素。
目前常见防控土传病害的措施有物理、化学和生物方法。其中生物防治因其低成本、高效率、环境友好和无药物残留等特点已成为当前花生根腐病防治的研究热点。生物防治目前研究大多限于单株生防菌。但单株菌易受外界环境干扰且与土著菌群竞争力弱，导致防效不理想。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种防治花生根腐病的复合菌群及其应用，本发明的复合菌群能够有效防治花生根腐病。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种防治花生根腐病的复合菌群，包括泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌。
优选的，所述泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌的有效活菌数的比例为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。
优选的，所述泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌的有效活菌数的比例为1：1：1：1：1：1：1。
优选的，所述复合菌群的总有效活菌数为1×1010～9×1010cfu/g。
本发明还提供了上述方案所述复合菌群在防治花生根腐病中的应用。
优选的，所述花生根腐病包括尖孢镰刀菌引起的花生根腐病。
优选的，所述应用包括以下步骤：将所述复合菌群和花生种子混拌施用；和/或，将所述复合菌群和腐熟有机肥混合后施用。
优选的，所述复合菌群和花生种子的质量比为(1：2)～(1：5)。
优选的，所述复合菌群和腐熟有机肥的质量比为(1：10)～(1：15)。
优选的，所述复合菌群和腐熟有机肥的复混料的施用方式包括根区施肥，施用量为50kg/亩～100kg/亩。
本发明的有益效果：本发明提供了一种防治花生根腐病的复合菌群，包括泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌；所述泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌的有效活菌数的比例为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。本发明的复合菌群中泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌是在连作花生根际不能有效定殖、而在轮作花生根际存在的菌株，上述复合菌群中单个菌或者2～6个菌的组合对病原真菌抑制效果均显著低于全部菌群组合；与单株菌相比，复合菌群的根际定殖力明显提升，能够有效弥补连作花生根际抗病性弱化，优化了根际微生态环境。本发明的复合菌群接种到花生根部，能够有效防控尖孢镰刀菌侵染花生根部，保护花生根部健康。本发明的复合菌群易于推广、防病效果稳定等优点。
具体实施方式
本发明提供了一种防治花生根腐病的复合菌群，包括泛菌(pantoeasp.)、假芽孢杆菌(fictibacillussp.)、肠杆菌(enterobactersp.)、类芽孢杆菌(paenibacillussp.)、芽袍八叠球菌(sporosarcinasp.)、芽孢杆菌(sporosarcinasp.)和绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)；所述菌群分离于轮作花生根际、且在连作花生根际不能获取的菌株；所述泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌的有效活菌数的比例为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，所述泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌的有效活菌数的比例为1：1：1：1：1：1：1；所述复合菌群的总有效活菌数优选为1×1010～9×1010cfu/g。
本发明对所述复合菌群的制备方法没有特殊限制，将泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌分别培养后，将培养得到的混合液混合均匀即可。
本发明还提供了上述方案所述复合菌群在防治花生根腐病中的应用；所述泛菌、假芽孢杆菌、肠杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌在连作花生根际不能有效定殖、而在轮作花生根际存在；所述花生根腐病优选的包括尖孢镰刀菌引起的花生根腐病。
在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：将所述复合菌群和花生种子混拌施用；和/或，将所述复合菌群和腐熟有机肥混合后施用。
在本发明中，所述复合菌群和花生种子的质量比优选为(1：2)～(1：5)；所述复合菌群和腐熟有机肥的质量比为(1：10)～(1：15)；所述复合菌群和腐熟有机肥的复混料的施用方式优选的包括根区施肥、基施，施用量优选为50kg/亩～100kg/亩。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1花生根际关键菌群的获取
选取连作5年以上的花生实验田为供试土壤，近五年轮作玉米、大豆和花生的实验田为对照实验土壤，供试病原菌为花生根腐镰刀菌(f.oxysporum)accc36194。
采用抖根法收集根际土，采用平板涂布法分离花生根际细菌。
首先用小钢铲除去盆栽花生植株周边土壤，小心拔出花生，轻轻抖动根系以除去大块土壤，然后使用无菌毛刷收集花生根际表面土壤；取1g花生根际土于50ml无菌锥形瓶中，加入9ml无菌水，25℃，180r/min，震荡30min，桌面平置10min。吸取1ml上清液，用孔径为5μm的滤膜除去真菌制备10-1土壤细菌悬浮液，备用。随后稀释10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列梯度细菌悬液，分别取200μl的10-4、10-5、10-6浓度的土壤悬浮液均匀地涂布于na培养基上，每个浓度梯度重复3次，25℃黑暗培养2d。根据细菌形态、颜色、大小从适宜浓度梯度的平板上挑取单菌落，分别在连作轮作花生根际细菌平板中挑取80株细菌，每个单菌落利用接种针在na培养基中平板划线纯化3次，获得纯菌落，编号并保存。利用接种针挑取纯细菌落于nb培养基中，25℃，180r/min培养24h。采用dna提取试剂盒提取细菌的dna。将所提取的dna进行16srdna的pcr扩增。并利用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物片段长度，随后将pcr扩增产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将得到的细菌序列通过ncbi网站数据库进行比对，选取相似度最高的16srdna序列。运用mega软件进行系统发育分析，确定待鉴定的菌株在分类学上的地位。
采用平板可培养方法解析了部分花生根际细菌组成，连作花生和轮作花生根际各分离80株细菌。连作花生根际鉴定了51株细菌，轮作花生根际鉴定了69株细菌，得到连作和轮作花生根际可培养细菌组成(表1)。
表1平板涂布和划线法分离的花生根际细菌组成
另外，用无菌刀片从10-1处理的细菌平板中刮取表面细菌于1.5ml离心管中，采用fastdnaspinkitforsoil试剂盒提取平板细菌dna，并进行质检，随后送去生物公司进行高通量测序。解析了花生根际全部可培养细菌组成(表2)。
表2高通量测序鉴定的花生根际可培养细菌组成
注:r：轮作花生根际可培养细菌平板；c：连作花生根际可培养细菌平板。
根据表1和表2得出连作花生根际丢失菌株为泛菌(pantoeasp.)、假芽孢杆菌(fictibacillussp.)、肠杆菌(enterobactersp.)、类芽孢杆菌(paenibacillussp.)、芽袍八叠球菌(sporosarcinasp.)、芽孢杆菌(lysinibacillussp.)、绿脓杆菌(pseudomonassp.)。
实施例2：复合菌群研制及对病原菌的抑病实验
用nb培养基分别活化7株连作花生缺失菌株，3000g，离心5min，除去细菌发酵液)，添加无菌水调节细菌浓度，使其od600nm＝1，备用。菌株按照7种，2种菌株随机组合混合，7菌组合有1个处理；2菌组合有10个处理。保证每个处理中各菌株浓度相同。每个株菌吸取1ml于10ml无菌离心管中，通过添加无菌水保证每个处理中各菌株浓度相同，上下颠倒数次混合菌悬液，备用。
进一步，所述测定7株混合菌株组合致病性的方法为：
采用平板直接对峙的方法检测7菌组合、2菌组合细菌悬液直接对镰刀菌菌丝抑制作用，采用96孔板培养的方法检测7菌组合、2菌组合细菌悬液对镰刀菌孢子萌发的影响(表3)。
表3制备花生根际7株和2株细菌组合如下：
注：各菌组合中每种菌的有效活菌数相同。a：泛菌(pantoeasp.)、b:假芽孢杆菌(fictibacillussp.)、c:肠杆菌(enterobactersp.)、d:类芽孢杆菌(paenibacillussp.)、e:芽袍八叠球菌(sporosarcinasp.)、f:芽孢杆菌(lysinibacillussp.)、g:绿脓杆菌(pseudomonassp.)。
①菌株组合对镰刀菌菌丝生长的影响：取10μl待测菌液接种于na培养基上，每个平板接3处。25℃，黑暗共培养48h，对照组添加无菌水。预培养24h后，在培养基中间添加一个直径为5mm镰刀菌菌饼。25℃，黑暗共培养7d，测定真菌生长直径。
②不同菌株组合对镰刀菌孢子萌发的影响：取上述稀释好的不同组合的混合细菌悬液100μl于无菌96孔中，另外添加100μl镰刀菌孢子悬液，对照组添加无菌水，共培养24h，显微镜下观察孢子萌发情况，计算抑菌率和孢子萌发率(表4)。由表4可以看出随着菌群组合增多，对病菌的抑制能力逐渐增强，其中7株混合菌群对病原菌抑制效果最好。
表4花生根际7株和2株细菌组合的抑病性
注：抑菌率＝(处理-空白对照)/空白对照×100％；孢子萌发率＝发芽孢子数/总孢子×100％
进一步，所述测定花生根际7株细菌组合和连作花生细菌的致病性的方法为：
用nb培养基分别活化花生根际7株菌株，25℃，黑暗培养24h，3000g离心5min，丢弃细菌发酵液，添加无菌水调节不同细菌浓度，使其od600nm＝1。每个菌株分别取200μl于2ml无菌试管中，上下颠倒数次使其充分混合，备用。称取连作花生根际土壤样品5g，放入盛有45ml无菌水的三角瓶中，25℃振荡30min。平放桌面静置10min，吸取5ml土壤悬液的上清液，用孔径为5μm的滤膜除去真菌，制备浓度为10-1土壤细菌悬浮液，备用。
准备na培养基，一侧放入2cm×4cm灭菌的滤纸，展平，在其表面接种200μl10-1的土壤菌悬液，25℃，黑暗培养48h。在滤纸表面再添加100μl花生根际7株菌混合液，在另一侧添加5mm镰刀菌菌饼。对照组添加无菌水。25℃，黑暗共培养7d，观测真菌生长直径(表5)。由表5可以看出在连作花生根际中回补本发明菌群组合可显著提升对病原菌的抑制能力，抑制率提升了82.4％。
表5花生根际7株细菌组合和连作花生根际细菌的抑菌率
注：b：连作花生根际细菌；b+f：连作花生根际细菌+7株花生根际细菌组合。抑菌率＝(处理-空白对照)/空白对照×100％
实施例3：复合菌群温室活体防治实验
首先利用0.1％氯化汞溶液消毒花生种子，将无菌的花生种子播种在无菌蛭石中育苗3d，随后将花生幼苗从无菌蛭石中拔出，无菌水冲洗干净，挑选长势一致的花生于装有无菌蛭石的花盆中。置于人工光照培养箱中生长10d，每天根据蛭石表面湿度补充等量无菌水。
挑取镰刀菌菌丝接种于pdb培养基中，180rmin-1，25℃，黑暗培养72h。利用4层无菌擦镜纸过滤培养好的镰刀菌菌悬液获得孢子悬液，无菌水稀释浓度为1×108个ml-1，备用。同时利用nb培养基分别培养7株花生根际菌株，180rmin-1，25℃，黑暗培养48h，3000g，离心5min，无菌水稀释菌液浓度为od600nm＝1，每个菌株吸取20ml于500ml无菌烧杯中，共140ml，混匀备用。
实验设为3个处理：b+f处理；f处理；ck处理。花生移栽培养10d后，在b+f处理中每株花生添加10ml7株连作丢失菌株混合液和10ml镰刀菌孢子悬液，在f处理中每株花生添加10ml无菌水和10ml镰刀菌孢子悬液，在ck处理中每株花生添加20ml无菌水。继续置于人工培养箱中培养10d后，收集植株样品，测定根腐病发病情况(表6)。由表6可以看出在接种病原菌处理上若回补本发明菌群组合物(b+f)可显著抑制了病害的发生，与仅接种病原菌处理(f)相比发病率降低了87.5％。
表6花生根际7株细菌组合进行灌根应用室内花生发病率
注：ck：无菌水处理；b+f：7株花生根际细菌组合+镰刀菌孢子悬液；f：镰刀菌孢子悬液。发病率＝(染病株数/调查总株数)×100％
实施例4：复合菌群大田活体防治实验
田间试验选择连作5年以上花生地土壤。实验在花生收获后开始布置，共设置3个处理，ck共4个重复，7菌组合共4个重复，2菌组合有8个处理，每个处理有2个重复，一个重复6穴花生(表7)。每个重复是起垄隔开的，两穴之间相隔15cm。
表7制备花生根际7株和2株细菌组合
注：各菌组合中每种菌的有效活菌数相同。a：泛菌(pantoeasp.)、b:假芽孢杆菌(fictibacillussp.)、c:肠杆菌(enterobactersp.)、d:类芽孢杆菌(paenibacillussp.)、e:芽袍八叠球菌(sporosarcinasp.)、f:芽孢杆菌(lysinibacillussp.)、g:绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)。
首先在nb培养基中分别培养7株菌，无菌水调节其od600nm＝1，每个菌株分别吸取5ml于100ml无菌离心管中，不同处理中各菌株等比例浓度混合，保菌液终浓度相同。挑选生长一致的花生种子浸泡在每个处理中，12h后播种在田间小区，花生生长30d后，收集植株样品，测定根腐病发病情况(表8)。由表8可以看出随着菌群组合增多，对植物根病防治效果逐渐增强，其中7株混合菌群防治效果最好。
表8测定花生根际7株和2株细菌组合的对花生根腐病的防治情况
注：发病率＝(染病株数/调查总株数)×100％；病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。