本发明涉及蛋白质活性研究领域，特别涉及一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法。
背景技术：
纤维连接蛋白(fn)是一类细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)蛋白，在细胞与细胞、细胞与基膜间起到桥联作用，维持细胞的正常形态和功能，它可以与肝素、肌动蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、dna和细胞结合。其重要作用是促进细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。
对于经常需要使用的纤连蛋白，一般将纤连蛋白放在-20度保存，为了避免纤连蛋白反复冻融，一般的做法是在纤连蛋白中加入一定量的甘油，但仅仅加入甘油，可以避免纤连蛋白反复冻融，但不能有效的防止纤连蛋白的降解。且由于保护剂的成分比较多，加入的量不同对纤连蛋白的影响也不一样，所以需要一种方法来保护纤连蛋白稳定性和生物学活性。
常用的蛋白保护剂有甘油、甘露醇、聚乙二醇、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、牛血清白蛋白等。在实际操作中很难用单一保护剂实现对纤连蛋白的有效保护，因此，为了增强保护效果，通常需要将保护剂进行搭配使用。所以需要开发更优的纤连蛋白保护剂。
现有的蛋白酶抑制剂虽然可以防止蛋白降解，但有细胞毒作用，影响纤连蛋白储存液在体外细胞实验中的应用。
lbl技术一般是先将表面带电荷的基片浸入含有带相反电荷的聚电解质溶液中，静置一段时间后取出清洗去掉吸附不牢的聚电解质，完成表面物质吸附过程。采用该法在常温下即可制备各种吸附膜层，且稳定性较好，是一种构筑复合有机/无机涂层的有效方法。lbl自组装膜可以负载多种生物分子，如多糖、蛋白质和酶等。商业纯钛(ti)及其合金具有优良的抗腐蚀性能以及良好的生物相容性，并且已经广泛应用于整形材料、牙修复材料和心血管植入材料等领域，比如人工关节，牙植入物和心脏瓣环，无细胞毒性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：纤连蛋白的储存防降解方法妨碍纤连蛋白在细胞实验中的蛋白活性研究应用，尤其是蛋白储存液中毒性剂量的蛋白酶抑制剂对细胞的毒性作用影响纤连蛋白在细胞实验中的生物活性应用。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，具体步骤如下：
(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面；
(2)将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含蛋白酶抑制剂和蛋白保护剂；
(3)使用前离心去除储存液，pbs或tbs清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。
优选地，所述纤连蛋白固定于ti表面的方法如下：
(a)纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；
(b)另配制0.5m的naoh溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；
(c)配制2％氨丙基三乙氧基硅烷apte溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入apte溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强apte与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉a；
(d)用edc/nhs/pbs体系配制浓度为150μg/ml的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液ph7.0；
(e)将硅烷化钛粉a重悬浸泡在纤连蛋白溶液中反应15min，0.01m的pbs洗掉未结合的纤连蛋白分子，离心后去除上清即可。
优选地，所述蛋白酶抑制剂为40～100mm的pmsf和1mm的pepstatina。
优选地，所述蛋白保护剂由如下原料组成：终浓度50～200mm的精氨酸、蛋白保护剂总重0.2～2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mledta，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为tris-nacl缓冲液，所述tris-nacl缓冲液为终浓度50mm的tris，终浓度100mm的nacl，ph8.0。
优选地，还包括如下步骤：
将硅烷化钛粉b浸泡在5～10μg/ml亮抑蛋白肽酶溶液中吸附固定15min，随后0.01m的pbs洗掉未结合的亮抑蛋白肽酶，将固定吸附有亮抑蛋白肽酶的钛粉加入储存液中，再与固定有纤连蛋白的固体粉末充分混合。
优选地，所述硅烷化钛粉b的粒径为硅烷化钛粉a粒径的100倍。
本发明获得的有益效果：
纯钛粉表面活化后可以有效负载纤连蛋白，并保持其生物活性，储存液中高浓度的蛋白酶抑制剂及蛋白保护剂可有效防止蛋白降解，较好的维持存储过程中纤连蛋白的生物学活性。使用时，可通过固液分离的方法提取纤连蛋白而去除有害蛋白保护成分如毒性剂量的pmsf或edta或其他干扰实验的保护成分，简单高效的完成纤连蛋白提取使用，并不影响其在细胞实验中的活性应用及研究。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：按如下方法保存和使用纤连蛋白：
(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面，具体方法如下：
(a)将粒径为0.2mm的10g纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；
(b)另配制0.5m的naoh溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；
(c)配制2wt％氨丙基三乙氧基硅烷(apte)溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入apte溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强apte与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉a；
(d)用edc/nhs/pbs体系配制浓度为150μg/ml的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液ph7.0；
(e)将1g硅烷化钛粉a重悬浸泡在5ml纤连蛋白溶液中反应15min，0.01m的pbs洗掉未结合的纤连蛋白分子，离心后去除上清即可。
(2)按1g：100ml将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含终浓度40mm的pmsf和终浓度1mm的pepstatina及蛋白保护剂；所述蛋白保护剂由如下原料组成：终浓度50mm的精氨酸、蛋白保护剂总重0.2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mledta，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为tris-nacl缓冲液，所述tris-nacl缓冲液为终浓度50mm的tris，终浓度100mm的nacl，ph8.0。由于pmsf及pepstatina在低浓度水溶液中易失效，因此采用接近或等同储存浓度的高浓度对蛋白进行长期保护，防止蛋白酶降解，由于后续会去除储存液，所以高浓度的蛋白抑制剂也不会对细胞实验产生毒性影响。
(3)使用前离心去除储存液，pbs或tbs清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。
实施例2：按如下方法保存和使用纤连蛋白：
(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面，具体方法如下：
(a)粒径为0.8mm的10g纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；
(b)另配制0.5m的naoh溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；
(c)配制2wt％氨丙基三乙氧基硅烷溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入apte溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强apte与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉a；
(d)用edc/nhs/pbs体系配制浓度为150μg/ml的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液ph7.0；
(e)将1g硅烷化钛粉a重悬浸泡在5ml纤连蛋白溶液中反应15min，0.01m的pbs洗掉未结合的纤连蛋白分子，离心后去除上清即可。
(2)将1g硅烷化钛粉b浸泡在2ml，10μg/ml亮抑蛋白肽酶溶液中吸附固定15min，随后0.01m的pbs洗掉未结合的亮抑蛋白肽酶，将固定吸附有亮抑蛋白肽酶的钛粉加入储存液中，比例为1g：500ml。
(3)再按1g：50ml将固定有纤连蛋白的固体粉末加入上述储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含终浓度100mm的pmsf和终浓度1mm的pepstatina及蛋白保护剂；所述蛋白保护剂由如下原料组成：终浓度200mm的精氨酸、蛋白保护剂总重2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mledta，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为tris-nacl缓冲液，所述tris-nacl缓冲液为终浓度50mm的tris，终浓度100mm的nacl，ph8.0。
(4)使用前离心去除储存液，pbs或tbs清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。
实施例3：按如下方法保存和使用纤连蛋白：
(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面，具体方法如下：
(a)粒径为0.5mm的10g纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；
(b)另配制0.5m的naoh溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；
(c)配制2wt％apte溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入apte溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强apte与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉a；
(d)用edc/nhs/pbs体系配制浓度为150μg/ml的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液ph7.0；
(e)将1g硅烷化钛粉a重悬浸泡在5ml纤连蛋白溶液中反应15min，0.01m的pbs洗掉未结合的纤连蛋白分子，离心后去除上清即可。
(2)将1g硅烷化钛粉b浸泡在2ml，7.5μg/ml亮抑蛋白肽酶溶液中吸附固定15min，随后0.01m的pbs洗掉未结合的亮抑蛋白肽酶，将固定吸附有亮抑蛋白肽酶的钛粉加入储存液中，加入比例为1g：1l。所述硅烷化钛粉b的粒径为硅烷化钛粉a粒径的100倍。
(3)再按1g：25ml将固定有纤连蛋白的固体粉末加入上述储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含终浓度70mm的pmsf和终浓度1mm的pepstatina及蛋白保护剂；所述蛋白保护剂由如下原料组成：终浓度125mm的精氨酸、蛋白保护剂总重1.0wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mledta，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为tris-nacl缓冲液，所述tris-nacl缓冲液为终浓度50mm的tris，终浓度100mm的nacl，ph8.0。
(4)使用前离心去除储存液，重悬沉淀后采用筛网筛除大粒径的硅烷化钛粉b，将小粒径的硅烷化钛粉a离心取沉淀，pbs或tbs清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。吸附有亮抑蛋白肽酶的硅烷化钛粉b可重复应用于纤连蛋白的储存。
对照实施例1：其余均与实施例1相同，不同之处在于，不去除存储液，直接用含有2wt％甘油的tris-nacl缓冲液将纤连蛋白的固液混合储存物稀释至纤连蛋白浓度为0.1mg/ml后用于细胞实验。
从实施例1～3制备的储存物中分离提取负载有纤连蛋白的固体粉末，进行纤连蛋白定量和活性检测，采用间接elisa法进行检测，具体步骤如下：首先将样品用1％的bsa封闭30min后，用pbs清洗3遍后加入鼠抗人纤连蛋白单克隆抗体(一抗)，37℃下培养1h，清洗后再加入hrp标记的羊抗鼠igg多克隆抗体(二抗:1：100dilutioninpbs)，37摄氏度下再培养1h，pbs充分清洗5遍后，加入tmb底物避光显色10min，最后用1mh2so4终止显色，450nm处读取吸光度值。根据标准曲线获得钛粉表面纤连蛋白的负载浓度。
表1钛粉表面负载纤连蛋白的结果测定
表1结果表明纯钛粉经活化和烷基化后有效吸附了纤连蛋白。
纤连蛋白稳定性及生物学活性测定方法：
检测操作步骤如下：将实施例1和对照实施例1制备的储存混合物均放入37℃恒温箱中进行加速破坏，分别在第0、1、3、5、7天的时候离心提取沉淀，用促细胞贴壁实验测定的方法检测其生物学活性。根据钛粉表面纤连蛋白的负载浓度称取负载有纤连蛋白的硅烷化钛粉a，用含有2wt％甘油的tris-nacl缓冲液将硅烷化钛粉a重悬至纤连蛋白浓度为0.1mg/ml，作为样品用于后续的细胞实验，以0.1mg/ml的纤连蛋白溶液和对照实施例1作为对照。将配制好的样品进行37℃加速破坏实验，为期7天。
本申请所述的“促细胞贴壁实验测定”具体步骤为：纤连蛋白重要作用是促进细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。而细胞的黏连和粘附是细胞修复、细胞生长完成的必要条件，因此纤连蛋白具有促细胞修复的功效。本实验通过纤连蛋白促mdbk细胞的粘附试验，统计不同纤连蛋白浓度下各孔内细胞数，经四参数拟合得出纤连蛋白的半数有效量(ed50)。a.主要仪器：超净工作台、细胞培养箱。
b.试剂配制
完全细胞培养液：量取胎牛血清10ml，双抗1ml，加入dmem培养液90ml，4℃保存。
无血清培养基：量取双抗1ml，加入1640培养液99ml，4℃保存。
消化液：0.25％胰蛋白酶。
pbs缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌。
bsa封闭液：称取3g牛血清白蛋白加pbs溶解并定容至100ml。
细胞：mdbk细胞(牛肾细胞)在完全细胞培养液中呈单层、贴壁生长，每4～5天传代一次，1︰2消化传代，于完全培养液中生长繁殖。
c.试验操作
样品稀释及孵育：将纤连蛋白在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，每孔50μl不同稀释度的纤连蛋白样品，并设立阴性对照(不加纤连蛋白)，加入50μlpbs作为对照，4℃过夜孵育。
促细胞贴壁试验：孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μlbsa封闭，置于37℃温箱孵育1h；取出弃去板中液体，加入mdbk细胞悬液(用无血清培养基重悬)，细胞接种密度为1.0×105个/ml，每孔接种100μl，温箱孵育5h。
结果观察及计算：将孵育完成的细胞板用pbs洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果拟合曲线得出纤连蛋白的半数有效量(ed50)。
计算公式：y＝(a-d)/(1+(x/c)＾b)+d
ed50＝样品浓度/(2＾c)
试验结果如下表所示：
表2纤连蛋白降解破坏实验结果
表2结果显示，在37℃下，纤连蛋白会随时间的推移而逐渐降解失活，纤连蛋白的促细胞贴壁活性随时间推移逐渐降低，采用本申请的方法后储存过程中通过高浓度的蛋白酶抑制剂显著抑制了纤连蛋白的降解，0～7d的过程中活性缓慢降低，且去除存储液后负载纤连蛋白的钛粉对细胞无毒性，不影响纤连蛋白生物活性的发挥，在0d时，生物学活性与单纯fn溶液相同。而对照实施例1中的高浓度蛋白酶抑制剂具有细胞毒性，在纤连蛋白工作浓度下无法保证细胞的存活，也就无法测出纤连蛋白的ed50。单纯的fn溶液在高温下很容易降解，在0～7d的过程中，活性快速下降，生物学活性在7天后几乎损失殆尽，无法用于生物学研究或实验。因此，本蛋白保护技术可以有效的防止蛋白发生变性分解，保持蛋白的生物学活性，并在应用时脱离存储体系，不受存储体系的细胞毒性影响，有利于纤连蛋白活性的发挥。
综上所述，纯钛粉表面活化后可以有效负载纤连蛋白，并保持其生物活性，储存液中高浓度的蛋白酶抑制剂及蛋白保护剂可有效防止蛋白降解，较好的维持存储过程中纤连蛋白的生物学活性。使用时，可通过固液分离的方法提取纤连蛋白而去除有害蛋白保护成分如毒性剂量的pmsf或edta或其他干扰实验的保护成分，简单高效的完成纤连蛋白提取使用，并不影响其在细胞实验中的活性应用及研究。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。