一种介孔Me/UIO-66-ZrMOF材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种介孔me/uio-66-zrmof材料及其制备方法和应用，属于纳米材料制备
技术领域：
。
背景技术：
：多孔材料因为它们在工业催化，吸附分离、离子交换、医药、光学、生物、传感、信息等诸多领域中的巨大影响，一直吸引着众多研究者的目光。多孔材料的合理设计和可控性是其特殊应用的关键，但在实际制备中具有挑战性。传统的多孔固体，如沸石、活性炭、介孔氧化硅等，其结构和功能在分子水平上的修饰和调整相对困难。而新开发的金属有机骨架(mofs)，由有机连接物和无机节点组成，更易调控和修饰。到目前为止，相关研究主要集中在微孔mofs上，微孔mofs的小孔径有利于小分子的吸附和分离，但限制了小分子的扩散，也阻碍了大分子进入mof通道，在某些情况下极大地限制了其应用。因此，设计和制备具有更大孔径的mof材料是势在必行的。目前，增大mofs材料孔径主要有两种方法：1.使用更大的金属簇或配体构建mofs（金属簇和/或有机配体）；2.制备有晶体缺陷的大孔洞mof材料。前者广泛采用配体延伸策略，但由此得到的周期性纳米结构的mofs的孔径依然局限于10nm以内，并且随着空隙尺寸的增大，骨架会变得不稳定，配体延伸时也会导致结构的相互渗透而大大减小孔径。后者可以采用更廉价的配体，其关键在于制备方法，但在许多情况下无法进行。除了上述两种方法外，研究者们还探索了模板法来制备稳定的分级孔隙型mofs(h-mofs)，利用特定结构模板的空间限制作用，使得材料在模板空间内填充、结晶，引导和限定颗粒单元按照特定的结构进行排列、组装，将限定的空间结构复制到产物中。其主要分为软模板法和硬模板法，软模板法采用棒状胶束、微乳液等为模板，在孔道中引导材料的生长；硬模板法采用预制的刚性模板，如多孔聚碳酸酯膜、分子筛、氧化铝模板等。尽管硬模板法制备方法简单、可行性强，但该方法需要通过煅烧、酸性蚀刻剂来去除模板，会使mofs难以保持稳定。纤维素酶催化纤维素水解为可溶性糖已成为最重要的催化剂之一，因为它在食品生物转化农业，纸浆和造纸以及纺织应用中的广泛工业应用。在生物炼制工业中，生物乙醇生产过程纤维素酶花费了总水解成本的50％左右，循环性差。因此，一种具有成本效益的实用流程，以确保纤维素酶的回收其重用至关重要。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种介孔me/uio-66-zrmof材料及其制备方法和应用。本发明中制备得到的介孔me/uio-66-zrmof材料能够用于纤维素酶的固定化，得到的固定化酶cellulase@me/uio-66-zr，提高了纤维素溶解的稳定性和重复使用性，并且介孔me/uio-66-zrmof材料在加快大分子底物扩散的同时，还克服了游离纤维素酶在ph稳定性、热稳定性、贮藏稳定性等方面的不足。为达到上述技术目的，本发明采取的技术方案如下：本发明首先提供了一种介孔me/uio-66-zrmof材料（介孔uio-66-zr金属有机框架材料），所述介孔me/uio-66-zrmof材料颗粒均匀，呈明显的正六边形；所述介孔me/uio-66-zrmof材料的孔径为40nm。本发明还提供上述了介孔me/uio-66-zrmof材料的制备方法，具体步骤如下：称取氯化锆、对苯二甲酸分别溶于dmf（二甲基甲酰胺）中，在得到的含对苯二甲酸的dmf溶液中依次加入葡聚糖1500和含氯化锆的dmf溶液，超声30min充分混合，将混合后的溶液油浴反应，反应结束后离心、洗涤、干燥，接着煅烧，煅烧后的产物后用甲醇活化，得到介孔me/uio-66-zrmof材料，室温干燥后保存。进一步的，所述氯化锆、对苯二甲酸、葡聚糖1500的用量为0.163g:0.1163g:2mg；所述dmf的量均为10ml。进一步的，所述油浴反应的条件为：反应温度70-120℃，反应时间24h。优选的，所述油浴反应的条件为：反应温度80℃。进一步的，所述煅烧条件为：煅烧温度325℃，煅烧时间2h。本发明中还提供了上述介孔me/uio-66-zrmof材料在纤维素酶的固定化中的应用，所述应用包括如下步骤：称取10mg介孔me/uio-66-zrmof材料分散在醋酸缓冲溶液中，然后加入纤维素酶进行固定化反应，反应完毕后离心、洗涤，得到介孔uio-66-zrmof材料固定化纤维素酶，记为cellulase@me-uio-66-zr，在4℃冰箱中保存备用。进一步的，所述me/uio-66-zr材料加入量为10mg；纤维素酶在醋酸缓冲溶液中的最终浓度为1mg/ml；所述醋酸缓冲溶液的ph为3.0-8.0，浓度为0.2mm；室温搅拌固定；所述固定化时间为1-12h。进一步的，所述醋酸缓冲溶液的ph为5.0；固定化时间为6h。本发明与现有技术相比较，有益效果包括如下几个方面：（1）本发明采用硬模板法制备介孔me/uio-66-zrmof材料，相较于利用晶体缺陷二步法制备h-mof模板来说，选用葡聚糖作为模板可一步法合成，方法简单易行，操作易控，反应条件温和。该方法不仅与反应前驱体具有良好的亲和性，且易去除，同时可保持目标多孔材料的结构完整性。（2）本发明制备的介孔me/uio-66-zrmof材料比表面大，通过煅烧移除模板葡聚糖后形成孔结构，孔径属介孔材料。微孔mofs的小孔径有利于小分子的吸附和分离，但限制了小分子的扩散，也阻碍了大分子进入mof通道，大孔材料因其孔道太大不适用于反应物或溶剂运输，在某些情况下极大地限制了其应用。本发明制备的介孔材料可使得大分子反应物和溶剂通过孔道扩散充分与底物混合，促进催化反应进行。（3）本发明对固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的酶学性质进行了考察，其在稳定性等方面有着明显的提高。纤维素酶作为多酶混合酶，属于大分子酶类，采用共沉淀或生物矿化法制备的固定化酶固载率低，而me/uio-66-zr孔道结构为纤维素酶提供了刚性屏蔽环境提高其固载率，同时允许大分子底物的进入，从而有效地减小外界不利环境对酶活力的影响和提高其循环稳定性。（4）本发明固定化纤维素酶吸附平衡时间为6h，纤维素酶的固载量为220mg/g，相较于微孔uio-66-zr固定化酶来说，cellulase@me/uio-66-zr固定化酶在循环8次后任保持60%的活性。附图说明图1为uio-66-zrmof材料（a）、葡聚糖1500@uio-66-zr（b）的xrd图。图2为葡聚糖1500@uio-66-zr（a）、介孔me/uio-66-zrmof材料（b）的红外光谱图。图3为葡聚糖1500（a）、葡聚糖1500@uio-66-zr（b）、介孔me/uio-66-zrmof材料(c)的热重图。图4为uio-66-zrmof材料比表面积分布图（a）和孔径分布图（b）。图5为介孔me/uio-66-zrmof材料比表面积分布图（a）和孔径分布图（b）。图6为介孔me/uio-66-zrmof材料的sem图。图7为不同温度合成的uio-66-zrmof材料和介孔me/uio-66-zrmof材料对纤维素酶固载量的影响图。图8为不同固定化时间对介孔me/uio-66-zrmof材料固载量的影响。图9为ph对游离纤维素酶和cellulase@me/uio-66-zr催化反应活性的影响结果图。图10为温度对游离纤维素酶和cellulase@me/uio-66-zr催化反应活性的影响结果图。图11为游离纤维素酶和cellulase@me/uio-66-zr的lineweaver-burk曲线图。图12为为游离纤维素酶和cellulase@me/uio-66-zr的ph稳定性验证的结果图。图13为游离纤维素酶和cellulase@me/uio-66-zr的热稳定性验证的结果图。图14为uio-66-zrmof材料及介孔me/uio-66-zrmof材料固定的纤维素酶循环稳定性图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明中，利用x射线衍射（xrd）、热重分析仪（tga）、傅里叶红外光谱仪和比表面测试仪（bet）等手段对介孔uio-66-zr进行表征。对本发明得到的固定化酶通过以下的方式对其性质进行验证：（1）酶的固载量测定：取6个ep管进行编号，用去离子水将250μg/ml的标准bsa溶液稀释至0-250μg/ml的溶液，用蛋白质试剂盒测定蛋白质含量，再将试剂盒中的溶液a和溶液b按照50:1的比例配置显色反应所需的工作液。取20μl配置好的标准溶液加入400μl工作液，摇匀，37℃水浴反应30min后用流水迅速冷却，10min内在紫外分光光度计562nm波长处测定其吸光度值，以x轴为吸光度值，y轴为蛋白浓度，绘制蛋白标准曲线，其线性回归方程为：y=1.3112x-0.0061,r2=0.9975。分别取20μl去醋酸缓冲溶液、纤维素酶溶液和固定纤维素酶时离心的一次及二次上清液加入到4个编好号的ep管中，分别加400μl工作液混合均匀后37℃下反应30min，冷却后测吸光度值，根据蛋白标准曲线的线性回归方程可以求出蛋白浓度，进一步可以求出纤维素酶的固载量。蛋白固载量（mg/g）=（2）相对酶活力的测定dns试剂的配制：称取6.5g3,5-二硝基水杨酸，加入适量去离子水于500ml烧杯中，置于热水中搅拌，再加入325ml2mol/l的naoh溶液，然后迅速加入45g丙三醇，快速搅拌，充分溶解后转入1l的棕色容量瓶中，定容到1l，摇匀后放置在阴凉处避光保存一周后使用。葡萄糖溶液（1g/l）的配制：取50mg的葡萄糖在100℃烘箱中烘干至恒重，用适量的去离子水溶解，定容到50ml。取9支编好号的10ml比色管，用配好的1g/l标准葡萄糖溶液和去离子水配制0-0.5g/l浓度不等的葡萄糖溶液。向各比色管中分别加入2mldns试剂摇匀，在沸水中显色反应10min后取出，流水冷却后定容到10ml，20min后用紫外分光光度计在540nm波长处测定，以0号样为对照，得到不同浓度葡萄糖溶液的吸光度值，用y轴表示，葡萄糖浓度用x轴表示，绘制葡萄糖标准曲线。标准曲线方程为y=2.5693x-0.14444，r2=0.9988。底物cmc溶液（1%，w/v）的配制：称取1gcmc，加入适量缓冲溶液（ph5.0）在温水浴中搅拌均匀后定容至100ml。游离酶活力：分别移取0.9mlcmc溶液（1%，w/v）于两支1.5mlep管中，预热10min，一支加入0.1ml一定浓度的纤维素酶溶液，另一支加入0.1ml缓冲溶液作为空白样，摇匀后50℃水浴反应10min，取出分别移取50μl转入1.5mlep管中，立即加入450μldns，充分摇匀后置于提前预备好的沸水中10min，完毕，迅速用流水冷却后定容到1ml，20min后进行测定。实施例1：uio-66-zr、葡聚糖1500@uio-66-zr及介孔me/uio-66-zrmof材料的制备uio-66-zrmof材料制备：称取0.163g氯化锆、0.116g对苯二甲酸分别溶于10mldmf中，在含对苯二甲酸的dmf溶液中加入氯化锆溶液，超声30min充分混合。然后置于80℃油浴中保持24h，自然冷却后，用dmf、甲醇各洗涤3次，置于60℃真空干燥，干燥完后样品，研磨均匀，储存备用。葡聚糖1500@uio-66-zr制备：称取0.163g氯化锆、0.116g对苯二甲酸分别溶于10mldmf中，在含对苯二甲酸的dmf溶液中依次加入2mg葡聚糖1500和氯化锆溶液，超声30min充分混合。然后置于80℃油浴中保持24h，自然冷却后，用dmf、甲醇各洗涤3次，置于60℃真空干燥，干燥完后样品，研磨均匀。介孔me/uio-66-zrmof材料制备：取上述葡聚糖1500@uio-66-zr材料置于325℃管式炉煅烧2h。取其样品于10ml甲醇中活化三天，得到介孔me/uio-66-zrmof材料，储存备用。图1为uio-66-zr和葡聚糖1500@uio-66-zrxrd谱图，图中a为uio-66-zr，b为葡聚糖1500@uio-66-zr。本发明合成的uio-66-zr呈结晶态，由图1(a)可知，2θ在5°~10°有两个特征峰，在26°区域存在一个特征峰，说明合成材料结晶度较好。加入葡聚糖1500后图1(b)，晶型也没有发生改变。图2为葡聚糖1500@uio-66-zr及介孔me/uio-66-zrmof材料红外光谱图，图中(a)为葡聚糖1500@uio-66-zrftir谱图，从图中可以明显的看出，在1660cm-1处的特征峰为羧基中碳氧双键c=o的振动吸收，1397cm-1处为coo-的伸缩振动而引起的吸收峰，由此可知合成葡聚糖1500@uio-66-zr中含有对苯二甲酸上的羧基。746cm-1产生的振动峰与zr-o一致，说明葡聚糖1500@uio-66-zr中含有锆离子；1158cm-1处吸收峰为葡聚糖环上碳氧（c-o）吸收峰。图2(b)为me/uio-66-zrftir谱图，图中1660cm-1、1158cm-1处吸收峰消失，说明葡聚糖1500已煅烧完。图3为葡聚糖1500、葡聚糖1500@uio-66-zr、介孔me/uio-66-zrmof材料热重图，其中（a）为葡聚糖1500失重图，（b）、（c）为葡聚糖1500@uio-66-zr、介孔me/uio-66-zrmof材料失重图。从图中可以看出，325℃后葡聚糖1500基本失重，由此确定具体葡聚糖1500的煅烧温度；0~200℃间损失为水和有机溶剂，由图中（b）和(c)之间回滞环可确定，煅烧完后葡聚糖被除去；超过600摄氏度后，mof开始分解。图4为uio-66-zrmof材料比表面积分布图和孔径分布图，其中图4a为比表面积分布图，图4b为孔径分布图。由氮气吸脱附曲线图4（a）可以看出，uio-66-zrmof材料回滞环闭合点在0.2-0.4之间，孔径分布表明合成的uio-66-zrmof材料孔径为4nm。图5为介孔me/uio-66-zrmof材料比表面积分布图和孔径分布图，其中图5a为比表面积分布图，图5b为孔径分布图。由氮气吸脱附曲线图5（a）可以看出，介孔me/uio-66-zrmof材料回滞环闭合点在0.4-0.5之间，对比于介孔材料回滞环闭合点在0.4-0.8之间，说明成功合成介孔me/uio-66-zrmof材料。从孔径分布图5（b）中得出，本发明制得的介孔me/uio-66-zrmof材料的孔径为40nm。图6为me/uio-66-zrsem图，从图中可以看出合成材料颗粒均匀，呈明显的正六边形。实施例2：介孔me/uio-66-zrmof材料的制备称取0.163g氯化锆、0.116g对苯二甲酸分别溶于10mldmf中，在含对苯二甲酸的dmf溶液中依次加入2mg葡聚糖1500和氯化锆溶液，超声30min充分混合。然后置于70℃油浴中保持24h，自然冷却后，用dmf、甲醇各洗涤3次，置于60℃真空干燥，干燥完后样品，研磨均匀。然后置于325℃管式炉煅烧2h。取其样品于10ml甲醇中活化三天，得到介孔me/uio-66-zrmof材料，储存备用。实施例3：介孔me/uio-66-zrmof材料的制备称取0.163g氯化锆、0.116g对苯二甲酸分别溶于10mldmf中，在含对苯二甲酸的dmf溶液中依次加入2mg葡聚糖1500和氯化锆溶液，超声30min充分混合。然后置于120℃油浴中保持24h，自然冷却后，用dmf、甲醇各洗涤3次，置于60℃真空干燥，干燥完后样品，研磨均匀。然后置于325℃管式炉煅烧2h。取其样品于10ml甲醇中活化三天，得到介孔me/uio-66-zrmof材料，储存备用。实施例4：固定化酶cellulase@me-uio-66-zr的制备称取10mg介孔me/uio-66-zrmof材料，溶解于2.5mlph=5的醋酸缓冲溶液中，然后加入2.5mg纤维素酶，室温搅拌下固定化反应6h，反应完毕后在4℃下离心、洗涤，得到固定化酶cellulase@me/uio-66-zr，在4℃冰箱中保存备用。图7为不同温度合成uio-66-zrmof材料和介孔me/uio-66-zrmof材料对纤维素酶吸附量的影响图由图，选用80℃作为合成温度，80℃时介孔me/uio-66-zrmof材料的蛋白固载率可达到220mg/g，远高于uio-66-zr。图8为不同固定化时间对介孔me/uio-66-zrmof材料固载量的影响，由图可以看出，固定化时间6h已达到吸附饱和，所以选用6h为固定化时间。实施例5：固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的酶学性能（1）游离纤维素酶及固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的最适催化反应phph是影响酶活的一个重要因素，酶的构象易受ph变化而产生重大改变，从而引起酶活力损失；同时一些底物的溶解状态和ph变化也紧密相关。如图9所示，游离酶和固定化酶的最佳反应ph分别为5.0和6.0，固定化酶的最适ph发生偏移。（2）游离纤维素酶及固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的最适催化反应温度温度是影响酶催化反应活性的另一个重要因素。因此，本发明探究了游离纤维素酶及固定化酶cellulase@me/uio-66-zr在不同温度体系下的催化反应活性。如图10所示，游离纤维素酶的最佳反应温度为50℃，固定化酶的最佳反应温度为60℃，比游离酶高出10℃，从而可以证明介孔me/uio-66-zrmof材料在一定程度上保护酶的性能。（3）游离纤维素酶及固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的动力学常数本实施例配制3-8mg/ml浓度的底物羧甲基纤维素钠，测定游离纤维素酶及固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的酶活，利用lineweaver-burk法得到图11，进一步求出其两者的km值及vm。表1.游离纤维素酶和固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的动力学常数km(mg·ml-1)vm(min·ml·mg-1)kcat（min-1）kcat/km游离酶0.7560.4542.273.003固定化酶1.330.8504.253.195从表1中可以看出，游离纤维素酶和固定化cellulase@me/uio-66-zr的km分别为0.756mg·ml-1和1.33mg·ml-1，固定化后纤维素酶与底物的亲和力有所降低，造成这一现象的原因可能是固定化载体对纤维素酶活性位点的空间阻碍。尽管固定化纤维素酶对底物的亲和力较低，但其最大酶活性仍高于游离纤维素酶。（4）游离纤维素酶及固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的ph稳定性本实施例考察游离纤维素酶及其固定化酶cellulase@me/uio-66-zr在ph3.0-8.0体系下培养0.5h后，在最佳反应ph下检测其酶活力保留情况。如图12所示，游离酶、固定化酶在ph=5的条件下最稳定，在ph=7条件下，固定化酶任保持90%的活性，而游离酶只有65%的酶活。（5）游离纤维素酶及固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的热稳定性本实施例将游离纤维素酶及其固定化酶cellulase@me/uio-66-zr在30-80℃下培养0.5h后，测其相对酶活力。如图13所示，游离酶和固定化酶分别在50℃和60℃的条件下酶活最为稳定，80℃时，固定化酶任可保持80%的活性，而游离酶只有40%左右酶活。由此可知，固定化酶的热稳定性得到显著增强，这说明me/uio-66-zr孔道网络可为包埋于其中的酶分子提供稳定的刚性屏蔽空间，从而减小了高温引起酶变性失活。（6）uio-66-zr及me/uio-66-zr所固定的纤维素酶的循环稳定性本实例对比了使用uio-66-zrmof材料及介孔me/uio-66-zrmof材料固定的纤维素酶循环稳定性。如图14所示，cellulase@me/uio-66-zr在循环8次后具有60%左右酶活性，而uio-66-zr在循环6次后酶活性不足20%。这是因为介孔me/uio-66-zrmof材料有助于纤维素等大分子底物的进入，使得酶与底物充分接触，从而增加了固定化酶cellulase@me/uio-66-zr的循环稳定性，增加了固定化纤维素酶重复使用性。所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。当前第1页12