本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种青霉素g酰基转移酶高产菌株及该菌株的选育及利用其发酵生产青霉素g酰基转移酶的方法。
背景技术：
：青霉素g酰基转移酶是应用于酶法阿莫西林生产中的关键酶，其以6-apa和d-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐为基本原来，经缩合反应生成阿莫西林，从而获得β-内酰胺抗生素。国内外文献表明，天然菌株的青霉素g酰基转移酶的酶活性普遍偏低，几乎没有工业应用价值，目前报道的各类天然的菌株最高活力在40u/ml，仍有很大的提升空间。青霉素g酰基转移酶在医药中间体的生产、多肽的合成中，都发挥了关键作用，具有广泛的市场需求和发展前景，是工业上非常重要的生物催化剂，是一种重要的医药工业用酶。生物酶具有反应专一性、高效性和温和性等特点，在化工医药、轻工食品、环境保护等领域发挥着巨大作用，已经成为工业生产的主力军。菌种性能的提高主要通过人工诱导和自然选育，随着基因工程的发展，科研工作者已将工作重点集中在构建基因工程菌以提高青霉素g酰基转移酶的表达活性。在1987年科学界报道了青霉素g酰基转移酶全基因序列，包括信号肽、α亚基、连接肽和β亚基序列，科学家将该酶基因序列，利用dna重组技术将编码青霉素g酰基转移酶的基因转移到合适的宿主菌中构建高产和分泌型产生菌，可以弥补原产生菌的生产缺陷。若同时采用高密度培养技术，还可以提高分泌产物青霉素g酰基转移酶的生产率和酶活力。目前工业生产青霉素g酰基转移酶工程菌大都为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，二者均已经获得了美国食品药物管理局(fda)的资格认定。其中大肠杆菌表达系统不能直接将目的蛋白分泌到胞外，后期破胞，提取、纯化工艺较为繁琐。而传统的枯草芽孢杆菌表达系统表达青霉素g酰基转移酶时需要苯乙酸诱导或变温诱导，这增加了发酵过程的控制难度和风险。黄鹤等在《重组青霉素g酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化》中报道了构建分泌表达青霉素g酰基转移酶的基因工程枯草芽孢杆菌菌株，表达量由3-6u/ml提高到35-40u/ml。杨昇等在《expressionandpurificationofextracellularpenicillingacylaseinbacillussubtilis》中报道了利用枯草芽孢杆菌表达系统表达了基因来源为巨大芽孢杆菌的青霉素g酰化酶，优化条件后酶活力达到了40u/ml。2012年发表的响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素g酰化酶(《浙江理工大学学报》，第29卷，第6期，2012年11月)中报道了利用枯草芽孢杆菌作为产生菌，克服了现有技术的缺点，按照最佳优化培养条件对该菌种进行15l发酵罐扩大培养，并研究了流加补料对产酶的影响，最终确定在对数增长期进行流加补充培养基与水的发酵工艺，发酵40h发酵液中青霉素g酰基转移酶的酶活达到60u/ml。随着酶提取和纯化技术的发展，技术更为先进的大肠杆菌表达系统开始逐渐取代传统枯草芽孢杆菌系统，大肠杆菌表达系统是目前工业化生产中最常用的细菌表达系统之一，根据相关报道记载，行业内青霉素g酰基转移酶的酶活普遍在80-100u/ml左右。由于基因工程菌的广泛应用，经过基因技术改良的原始菌种已经广泛应用到国内青霉素g酰基转移酶产业，目前国内菌种性能及发酵水平的差异主要表现在经过人工选育的产生菌菌体性能的比较。因此，通过对现有基因工程菌进行选育和筛选，对比各形态菌株的性能，从而获得生长健壮、性能优良、更适用于生产的高产菌株，并根据菌种的特性，确定最适宜的培养条件和发酵工艺参数，从而提高青霉素g酰基转移酶的发酵水平，提高发酵单位成为目前研究的重点。技术实现要素：针对以上技术情况，本发明提供了一种提高青霉素g酰基转移酶产量的菌种选育及发酵的方法，本发明方法可以提高青霉素g酰基转移酶发酵单位、提高生产率、降低生产成本。本发明所述提高青霉素g酰基转移酶产量的选育及发酵的方法包括如下步骤：(1)青霉素g酰基转移酶产生菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；(2)将步骤(1)中所述稀释液于培养基上恒温培养过夜；(3)将步骤(2)中符合菌落形态标准的菌落，接种于摇瓶培养基中恒温培养；(4)将步骤(3)中符合菌丝形态和od600值标准的摇瓶，并低温保存；(5)将步骤(4)中的菌丝接种于种子瓶培养基中恒温培养，控制种子瓶od600值标准，然后再次接入种子瓶培养基中，相同条件下进行扩大培养；(6)制备发酵罐培养基，并配制补料瓶溶液，进行发酵扩大培养，适时补充料瓶溶液，并补入诱导剂。本发明方法中的所述青霉素g酰基转移酶产生菌菌种可以为任何来源，包括但不限于自我突变、诱导突变或市售等等。本发明方法中所述梯度稀释没有特别限制，本发明包括但不限于梯度稀释为从10-1到10-9。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(2)中，所述培养基为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、琼脂粉1.5％、ph值7.2-7.3。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(3)中摇瓶培养基或(5)中种子瓶培养基为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、ph值7.2-7.3。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中，所述补料瓶溶液为：50％甘油。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中，所述诱导剂为iptg溶液。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中，所述发酵罐培养基为：酵母浸膏5-20g/l、蛋白胨10-25g/l、硫酸铵2-8g/l、磷酸氢二钾5-15g/l、磷酸二氢钾2-8g/l、硫酸镁0.2-1.5g/l、甘油3-10g/l、葡萄糖0.1-1.0g/l、消沫剂0.01-0.06g/l、ph值7-8。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(3)中，所述菌落形态符合标准的菌落为：颜色均匀单一，最优为白色；菌落直径为1-2mm，单菌落最优为凸起状。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(4)中，所述菌丝形态和od600值符合标准的摇瓶，其中所述菌丝形态为菌丝长短、粗细均匀，以细长菌丝为主。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(4)中低温保存时保存的温度为-70℃以下。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(4)或(5)中所述od600值为0.6-0.8。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(2)(3)或(5)中，所述恒温培养的温度为28℃。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中进一步包括：所述发酵的温度为28℃，ph值为7.0，罐压为0.05mpa，初始空气流量为8l/min，转速为150rpm。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中进一步包括：发酵的温度为28℃，ph值为7.0，罐压为0.05mpa，初始空气流量为8l/min，转速为150rpm；发酵过程中保持制do值为30-50％。本发明中作为示例性的说明，例如当do值下降时，通过调节空气流量和转速，维持do值不低于45％，转速最高500rpm，待do值反弹时，开始加补料瓶溶液，控制do值为30-50％，当od600值为10-30，一次性补入iptg溶液进行诱导；发酵周期设置为50h～70h左右。本发明方法中，作为实施方案之一，本发明方法包括：1.菌种接种：步骤(1)：将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的冷冻甘油管解冻，并用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液。步骤(2)：将步骤(1)中所述稀释液，通过平板划线法，接种于双碟培养基上，放置于恒温培养箱中，培养过夜。2.菌种选育步骤(3)：选择步骤(2)中所述双碟培养基中菌落形态符合标准的菌落，接种于摇瓶培养基中，调整转速，恒温培养。步骤(4)：选择步骤(3)中，菌丝形态和od600值符合标准的摇瓶，将其中菌丝保存于甘油管中，并置于-70℃以下环境中保存。步骤(5)：制备种子瓶培养基，将步骤(4)中保存在甘油管中的菌丝接种于种子瓶内，调整转速，恒温培养，控制种子瓶od600值，镜检瓶内菌丝形态。然后再次接入种子瓶中，相同条件下进行扩大培养。3.发酵罐扩大培养步骤(6)：制备发酵罐培养基，并配制补料瓶溶液，进行发酵罐扩大培养，控制发酵工艺参数，适时补料，并补入诱导剂。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中，所述诱导剂为iptg；作为实施方案之一，所述诱导剂为iptg的无菌水溶液。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(4)中，所述菌丝形态和od600值符合标准的摇瓶，其中菌丝形态为菌丝长短、粗细均匀、以细长菌丝为主；其中od600值最优为0.4-1.0。本发明方法中，作为本发明实施方案之一，步骤(3)中，转速为240rpm，恒温培养为28℃，控制摇瓶od600值为0.4-1.0。本发明方法中，作为本发明实施方案之一，步骤(5)中，转速为240rpm，恒温培养为28℃，控制种子瓶的指标od600值为0.4-1.0，优选为0.6-0.8。本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(4)、(5)中，所述菌丝形态为外观为白色，菌丝均匀，以细长丝为主。本发明还提供一种青霉素g酰基转移酶高产菌株，所述菌株单菌落外观为白色，凸起状，菌落直径为1-2mm。作为实施方案之一，所述菌株菌丝形态外观为白色，菌丝长短、粗细均匀，以细长丝为主。通过本方法可获得酶活可达到200u/ml以上的青霉素g酰基转移酶，相对于现有技术，本方法提高了发酵单位，极大的提高了劳动生产率。相比于现有文献记载和现有工艺，本发明在菌种选育和发酵控制方面做出了创新，显著提高了发酵单位。在菌种选育方面，本发明通过对各形态的菌种进行培养和筛选，通过数据比对，通过本方法得到的菌种，稳定性和基因表达都明显提升。在发酵控制方面，本方法在培养温度和生长周期的控制方面都做出了创新。大肠杆菌最适合生长的温度在37-39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生产包涵体，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。但培养温度也有一个下限，一般为8-10℃，在此温度下，大肠杆菌将停止生产，蛋白也基本上停止表达。降低培养温度有3个优势：1、低温下培养基中的氧气溶解性更高，在高密度培养时，能有效防止菌体厌氧生产，防止对菌体生产和外源蛋白表达有抑制作用的乙酸产生。2、低温培养时，次级代谢物的半衰期更长，质粒稳定性也可能会增加。3、降低培养温度能降低可溶蛋白降解速率，提高可溶蛋白的稳定性。大肠杆菌青霉素g酰基转移酶表达受温度调控，当在30℃或以下培养酶活明显高于37℃培养，作为实施方案之一，本发明所选温度为28℃。本发明采用高密度培养技术提高菌体发酵密度，最终提高产物的比生产率，不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本。利用基因重组技术构建的重组大肠杆菌的发酵工艺不同于传统发酵工艺，除了培养基、培养方式、发酵条件控制等因素外，重组大肠杆菌的高密度培养还与表达系统和诱导条件有关。本发明在发酵控制方面严格根据od600值，od600值是体现菌浓度的关键指标。在摇瓶和种子瓶培养时，控制摇瓶od600值为0.4-1.0右，保持菌种处于对数生长期。在此阶段可使菌种进行初步扩培，还可以观察菌种的生长状况，剔除生长畸形的菌种，保证菌种稳定性。在发酵罐扩培中，通过do值和空气流量控制菌浓度，在od600达到一定数值，即菌浓度达到一定数量后，一次性补入诱导剂，刺激菌体产生次级代谢物即青霉素g酰基转移酶。此外，诱导时机和诱导剂量对青霉素g酰基转移酶的产量有不小的影响，流加营养物质也有可能显著提高可溶蛋白的表达量。本发明在选择在培养后期，即do值反弹时及时补加营养物质(即甘油)。do值下降说明菌种生长开始迟缓，代谢产物开始增加，当菌种数量增长和代谢产物增长达到相对平衡时，即od600达到25-27％时，一次性补入诱导剂，刺激菌体产生代谢物，增加青霉素g酰基转移酶的产量。具体实施方式本发明通过以下实施例进一步阐述，但本发明并不受限于此。以下实施例中酶活力的采用hplc(高效液相色谱)方法检测分析条件：色谱柱：ods，c18，4.6mm×150mm×5um或等同流速：1.0ml/min波长：225nm柱温：35℃原理及方法酶活力单位定义：单位酶量每分钟生成1umol阿莫西林为一个单位，1u。检测原理：6-apa和d-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐在青霉素g酰基转移酶的催化作用下合成阿莫西林，用液相色谱仪检测阿莫西林的生成量，根据阿莫西林的生成量计算合成酶活。优化菌种后的结果实施例1将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的甘油冷冻管解冻，使用无菌水进行梯度稀释，稀释倍数从10-1到10-9。将梯度稀释的稀释液接种于双碟培养基中，置于恒温培养箱，温度为28℃，培养过夜。双碟培养基：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、琼脂粉1.5％，ph7.2-7.3。选择不同外观、同种外观不同直径的单菌落接入摇瓶中，培养好后，制备甘油冷冻管，并对制备的甘油冷冻管进行考察。表1：不同菌落外观制备的甘油冷冻管进罐的考察结果表2:同种外观，不同直径的单菌落制备的甘油冷冻管进罐的考察结果未优化菌种的工艺制备摇瓶培养基，摇瓶培养基的制备方法为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％，用液碱调ph7.2-7.3，分装于三角瓶中，放入蒸汽灭菌柜内灭菌。将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的甘油冷冻管进行发酵扩培。制备发酵罐培养基，发酵罐培养基为：酵母浸膏5-20g/l，蛋白胨10-25g/l，硫酸铵2-8g/l，磷酸氢二钾5-15g/l，磷酸二氢钾2-8g/l，硫酸镁0.2-1.5g/l，甘油3-10g/l，葡萄糖0.1-1.0g/l，消沫剂0.01-0.06g/l，用液碱调ph7-8。并配制补料瓶溶液(50％甘油)，控制发酵工艺，适时补料，并补入诱导剂，进行发酵罐扩培。控制发酵工艺为整个过程温度恒定在28℃，ph恒定为7.0，罐压控制在0.05mpa，初始通气量为8l/min，转速150rpm。当do下降至80％以下，空气流量提升至12l/min。当do下降到50％以下开始调转速，维持do≥45％，每次调整转速30-50rpm，转速最高≤500rpm。当do反弹上升时，补加甘油。选择控制do于10-70％，当od600≈5-50，一次性补入iptg溶液进行诱导，发酵周期设置为50-70h。放罐酶活在80-100u/ml。实施例2制备摇瓶培养基，摇瓶培养基的制备方法为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％，用液碱调ph7.2-7.3，分装于三角瓶中，放入蒸汽灭菌柜内灭菌。将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的甘油冷冻管进行发酵扩培。制备发酵罐培养基，发酵罐培养基为：酵母浸膏7g/l，蛋白胨12g/l，硫酸铵3g/l，磷酸氢二钾6g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁0.6g/l，甘油4g/l，葡萄糖0.3g/l，消沫剂0.02g/l，用液碱调ph7-8。并配制补料瓶溶液(50％甘油)，控制发酵工艺，适时补料，并补入诱导剂，进行发酵罐扩培。控制发酵工艺为整个过程温度恒定在28℃，ph恒定为7.0，罐压控制在0.05mpa，初始通气量为8l/min，转速150rpm。当do下降至80％以下，空气流量提升至12l/min。当do下降到50％以下开始调转速，维持do≥45％，每次调整转速30-50rpm，转速最高≤450rpm。当do反弹上升时，补加甘油。选择控制do于10-70％，当od600≈5-15，一次性补入iptg溶液进行诱导，发酵周期设置为55h。溶氧(do)放罐酶活＜30％40-80u/ml30-50％80-90u/ml＞50％50-80u/ml实施例3制备摇瓶培养基，摇瓶培养基的制备方法为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％，用液碱调ph7.2-7.3，分装于三角瓶中，放入蒸汽灭菌柜内灭菌。将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的甘油冷冻管进行发酵扩培。制备发酵罐培养基，发酵罐培养基为：酵母浸膏12g/l，蛋白胨18g/l，硫酸铵6g/l，磷酸氢二钾10g/l，磷酸二氢钾6g/l，硫酸镁1.2g/l，甘油8g/l，葡萄糖0.8g/l，消沫剂0.05g/l，用液碱调ph7-8。并配制补料瓶溶液(50％甘油)，控制发酵工艺，适时补料，并补入诱导剂，进行发酵罐扩培。控制发酵工艺为整个过程温度恒定在28℃，ph恒定为7.0，罐压控制在0.05mpa，初始通气量为8l/min，转速150rpm。当do下降至80％以下，空气流量提升至12l/min。当do下降到50％以下开始调转速，维持do≥45％，每次调整转速30-50rpm，转速最高≤500rpm。当do反弹上升时，补加甘油。选择控制do于10-70％，当od600≈15-25，一次性补入iptg溶液进行诱导，发酵周期设置为55h。优化后的工艺将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的甘油冷冻管解冻，使用无菌水进行梯度稀释，稀释倍数10-1～10-9。将梯度稀释的稀释液接种于双碟培养基中，置于恒温培养箱，温度为28℃，培养过夜。双碟培养基：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、琼脂粉1.5％，ph7.2-7.3。选择不同外观、不同直径的单菌落接入摇瓶中，培养好后，制备甘油冷冻管。对单菌落制备的甘油冷冻管进行考察。表1：白色凸起、直径为1-2mm的单菌落制备的甘油冷冻管进罐的考察结果菌落外观菌落直径放罐酶活标准白色凸起1-2mm100-200u/ml80-100u/ml实施例4制备摇瓶培养基，摇瓶培养基的制备方法为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％，用液碱调ph7.2-7.3，分装于三角瓶中，放入蒸汽灭菌柜内灭菌。将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的甘油冷冻管进行发酵扩培。制备发酵罐培养基，发酵罐培养基为：酵母浸膏7g/l，蛋白胨12g/l，硫酸铵3g/l，磷酸氢二钾6g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁0.6g/l，甘油4g/l，葡萄糖0.3g/l，消沫剂0.02g/l，用液碱调ph7-8。并配制补料瓶溶液(50％甘油)，控制发酵工艺，适时补料，并补入诱导剂，进行发酵罐扩培。控制发酵工艺为整个过程温度恒定在28℃，ph恒定为7.0，罐压控制在0.05mpa，初始通气量为8l/min，转速150rpm。当do下降至80％以下，空气流量提升至12l/min。当do下降到50％以下开始调转速，维持do≥45％，每次调整转速30-50rpm，转速最高≤450rpm。当do反弹上升时，补加甘油。选择控制do于10-70％，当od600≈5-15，一次性补入iptg溶液进行诱导，发酵周期设置为55h。溶氧(do)放罐酶活＜30％100-120u/ml30-50％130-200u/ml＞50％100-130u/ml实施例5制备摇瓶培养基，摇瓶培养基的制备方法为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％，用液碱调ph7.2-7.3，分装于三角瓶中，放入蒸汽灭菌柜内灭菌。将含有青霉素g酰基转移酶产生菌的甘油冷冻管进行发酵扩培。制备发酵罐培养基，发酵罐培养基为：酵母浸膏12g/l，蛋白胨18g/l，硫酸铵6g/l，磷酸氢二钾10g/l，磷酸二氢钾6g/l，硫酸镁1.2g/l，甘油8g/l，葡萄糖0.8g/l，消沫剂0.05g/l，用液碱调ph7-8。并配制补料瓶溶液(50％甘油)，控制发酵工艺，适时补料，并补入诱导剂，进行发酵罐扩培。控制发酵工艺为整个过程温度恒定在28℃，ph恒定为7.0，罐压控制在0.05mpa，初始通气量为8l/min，转速150rpm。当do下降至80％以下，空气流量提升至12l/min。当do下降到50％以下开始调转速，维持do≥45％，每次调整转速30-50rpm，转速最高≤500rpm。当do反弹上升时，补加甘油。选择控制do于10-70％，当od600≈15-25，一次性补入iptg溶液进行诱导，发酵周期设置为55h。溶氧(do)放罐酶活＜30％100-120u/ml30-50％130-200u/ml＞50％110-130u/ml当前第1页12