本发明属于动物实验造模方法领域，涉及一种构建长qt综合征动物模型的多肽和动物实验用动物模型的建立方法，特别涉及一种长qt综合征的动物造模。
背景技术：
长qt综合征(longq-tsyndrome，lqts)，指心电图显示qt间期延长导致心室复极延迟，是猝死，晕厥发生的主要原因，然而心脏结构却没有明显异常，根据有无继发因素将其分为先天遗传性和后天获得性两大类。研究表明，na+，k+，ca2+离子通道或钙调蛋白(calmodulin，cam)的基因突变都会导致长qt综合征的发生。
cam通过与ca2+结合被激活来调节心脏cav1.2通道的开放和关闭，cam发生基因突变以后可通过减弱cav1.2通道ca2+依赖性失活(cdi)而导致动作电位时程延长，心室复极化减弱，qt间期延长。目前cam第141位氨基酸e141g是已发现的一种关键的错义突变体。它是第一个被发现的既影响cav1.2钙通道的调节，又影响成年人nav1.5钠通道调节的突变体。发明人设计了一种多肽来构建lqts鼠模型。
多肽药物是由氨基酸通过肽键连接，也是蛋白质的水解后的中间产物，其中寡肽是由2-10个氨基酸组成，多肽是由10-50个氨基酸组成。肽类药物具有活性高、疗效稳定、不良反应小、用量少等特点，在临床实践中被广泛应用。多肽药物能改善细胞氧化损伤，减轻组织炎症，抑制细胞内钙超载，降低心肌细胞凋亡率，抑制细胞自噬，抵抗心肌缺血再灌注损伤等。因此，越来越多的多肽被用于治疗疾病。然而，由于细胞膜天然屏障的作用，生物大分子在大量实际应用中受到限制，难以在细胞中发挥作用。针对上述问题，本领域研究人员通过利用穿膜肽来解决这个问题，穿膜肽是一种强细胞膜穿透的小分子肽，可携带多种大分子物质进入细胞。
在1988年，green和他的同事发现了tat反式激活蛋白可以通过细胞膜单独进入细胞。1994年，fawell等报道了tat蛋白可以将外源性蛋白转入细胞，其发生转导作用的主要部分是tat蛋白的第47～57个氨基酸，称为tat蛋白转导结构，也称为细胞穿膜肽。它很快就被用于药物靶向给药的研究。在本发明的实施例中，利用细胞穿膜肽tat蛋白(genbank：af525447，a.a.47-57，grkkrrqrrrg)设计多肽，使其进入动物心肌细胞并发挥作用。
本发明提供一种多肽，可穿透心肌细胞膜、具有延长qt间期作用且能稳定存在于动物体内，对研究钙调蛋白基因突变影响cav1.2钙通道的机制具有重要作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种建立长qt综合征动物模型的方法，通过本发明提供的方法构建长qt综合征动物模型，通过给予本发明所述多肽cm4改变cav1.2钙通道的调节作用，使得动作电位延长，心电图显示qt间期延长，实现相应的动物模型造模的目的。本发明构建长qt综合征动物模型为进一步研究其他钙调蛋白突变体或者离子通道突变所导致心血管系统疾病的机制奠定基础，在cam突变体导致的长qt综合征的研究中提供帮助。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案。
一种构建长qt综合征动物模型的多肽，该多肽的氨基酸序列为：grkkrrqrrrgevdemireadidgdgqvnyegfvqmm，命名为cm4。
所述构建长qt综合征动物模型的多肽，cm4多肽前11个氨基酸grkkrrqrrrg是穿膜肽，能携带后面26个氨基酸穿透细胞膜，后26个氨基酸evdemireadidgdgqvnyegfvqmm发挥作用的主体。
所述构建长qt综合征动物模型的多肽来源于具致病作用的cam突变体，用于制备cam突变所导致的疾病模型。
一种生物活性片段或衍生物，包含所述的多肽序列为核心序列，包括共价连接的化合物以及由核心序列组成的多聚体混合。
一种多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列能编码cm4多肽序列以所述的多肽活性片段及其衍生物。
所述构建长qt综合征动物模型的多肽，可穿透心肌细胞膜、具有延长qt间期作用且能稳定存在于动物体内。
所述构建长qt综合征动物模型的多肽通过固相合成法制备。
所述构建长qt综合征动物模型的多肽及所述的生物活性片段或衍生物在制备长qt综合征动物造模中的用途。
进一步地，所述长qt综合征动物造模的方法为将多肽cm4给予动物，获得长qt综合征动物模型。
所述动物为小鼠、豚鼠、大鼠、家兔及犬实验动物。
所述给予cm4的方式是心脏体外灌流或腹腔注射、皮下注射及静脉注射。
所述多肽cm4的剂型和剂量为任何药物治疗学上可接受的剂型和剂量。
所述给予cm4的方式是心脏体外灌流或腹腔注射、皮下注射及静脉注射。
所述心脏体外灌流cm4浓度10μm，腹腔注射cm4的量为21mg/kg。
所述心脏体外灌流，是将cm4溶解于k-h液中进行的；所述腹腔注射，是将cm4溶解于生理盐水中进行的。
心脏体外灌流包括以下步骤：采用pulldown实验，在[ca2+]为0、100nm、10μm和2mm条件下，检测cm4与心肌cav1.2钙通道c末端的结合作用。
所述建立长qt综合征动物模型的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、心脏主动脉原位插管：迅速分离摘除心脏并安装在langendorff灌流装置上。平衡稳定15min，然后单独用k-h溶液或含cm4或含cm4-r的k-h溶液连续灌流60min。记录豚鼠离体心脏的心电图，统计qt(qtc)间期。利用bazett公式(qtc[ms]＝qt[ms]/(rr[s])1/2)对qt间期进行校正。
步骤2、小鼠给予多肽cm4三周后在体监测小鼠心电图，统计qt(qtc)间期。利用bazett公式(qtc[ms]＝qt[ms]/(rr[s])1/2)对qt间期进行校正。
实验开始之前，已向伦理委员会申请动物实验同意书，本发明的主要目的是造动物模型，在造动物模型的实验过程中涉及动物伦理，所以需要向伦理委员会申请同意书，为论理科学研究的基础先决条件保障。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
(1)本发明提供的长qt综合征小鼠模型或豚鼠离体心脏模型是在动物培养过程中腹腔或心脏离体灌流给予cm4，实现心电图qt间期延长。本发明提供的模型建立方法简单可靠，方便科研人员建立长qt综合征小鼠或豚鼠离体心脏模型，并进行相关的实验研究。造模的过程简单有效，同时还可以设置相应的对照组，对比分析氨基酸突变前后心电图的变化。本发明通过给予cm4诱导小鼠和豚鼠离体心脏qt间期延长，cm4易于获得，纯度高，且可透过细胞膜进入细胞发挥作用，调节心肌钙通道的活性，具有造模效率高，成本低，方便进行相关实验的研究。
(2)本发明的动物模型建立方法克服了现有技术的成本昂贵、耗时长的缺点，具有可控性，操作简单，成本低，快速的提供大量的适合相关研究的应用的动物模型。
(3)本发明的动物模型的建立方法的研究方式属于完全创新型研究，和目前国内外的转基因小鼠相比，具有可控性，操作简单，成本低，快速的提供大量的适合相关研究的应用的动物模型的特点，并进行在体和离体的实验研究，从而了解其可能的发病机制，为进一步研究其他钙调蛋白突变体或者离子通道突变所导致心血管系统疾病的机制奠定基础。
附图说明
图1是hplc检测多肽cm4纯度。
图2是不同组豚鼠离体心脏的代表性心电图，其中a：control组0.9％nacl灌流心电图，n＝4。b：cm4组灌流心电图，n＝9。c：cm4-r组灌流心电图，n＝6。心电监测时间：60min。
图3是cm4对豚鼠离体健康心脏qtc间期的影响，其中，control组，n＝4；cm4模型组，n＝9；cm4-r治疗对照组，n＝6；数据用mean±sem表示，*p<0.05，vs.control组。
图4是多肽cm4与ct1结合作用，其中a：cm4与ct1的结合。cm4(0.1-10μm)，[ca2+]≈free，100nm，10μm和2mm；b：cm4与ct1结合的多肽浓度依赖性和钙离子浓度依赖性(n＝4)。
图5是不同组小鼠的代表性心电图，其中a：control组0.9％nacl灌流心电图，n＝14；b：cm4组灌流心电图，n＝6；c：cm4-r组灌流心电图，n＝7。心电监测时间：60min。
图6是cm4对小鼠心电图qtc间期的影响，其中，control组，n＝14；cm4模型组，n＝6；cm4-r治疗组，n＝7；数据用mean±sem表示，**p<0.01，vs.control组。
具体实施方式
下面结合实验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范畴。
实施例1固相合成法合成多肽cm4
多肽cm4：吉尔生化上海有限公司，lotno:p171026-cq614360。其氨基酸序列如下：grkkrrqrrrgevdemireadidgdgqvnyegfvqmm，mw：4498.99。
利用hplc检测多肽的纯度，由图谱可知，多肽cm4的纯度为4119249/4463895＝92.28％，如图1和表1所示。图1为多肽cm4hplc检测图谱，通过图一可以看出多肽cm4纯度达到90％以上，纯度较高。
表1.cm4hplc检测相关参数。
实施例2langendorff灌流实验。
豚鼠注射肝素(150u/kg/ip)，戊巴比妥钠(40mg/kg/ip)麻醉。气管与人工呼吸机相连。主动脉在人工呼吸下原位插管。迅速摘除心脏并安装在灌流装置上。冠状动脉被krebs-henseleit(k-h)溶液逆行灌注(5.4mmglucose；116.0mmnacl；3.6mmkcl；23.0mmnahco3；1.16mmkh2po4；1.2mmcacl2；0.58mmmgso4；0.3mmpyruvate；2.8u·l-1insulin)，心脏保持在37℃恒温室中。在主动脉插管期间监测冠状动脉灌注压力，并将其调整到大约60-70mmhg的范围。将电极负极置于右心房，正极置于左心室(心尖)，利用生物实验系统记录心电图(qt间期)。本实验将雄性和雌性豚鼠离体心脏随机分为三组，观察cm4对qt间期的影响。分组：(1)control组：0.9％nacl；(2)cm4组：10μmcm4；(3)cm4-r组：10μmcm4-r。心脏平衡灌流15min，然后单独用k-h溶液或含cm4或cm4-r的k-h溶液灌流60min。利用记录到的心电图评估qt间期。利用bazett公式(qtcb[ms]＝qt[ms]/(r-r[s])1/2)对心率qt间期进行校正，结果如图2和3所示。
图2为三组离体心脏灌流心电图监测结果显示，control组(n＝4)心电图波形正常，心动周期规律，如图2a所示。然而，在cm4组(n＝9)中，当心脏单独灌流cm4时，心电图显示心脏发生心律失常和心动过缓，如图2b所示。单独灌流cm4-r(n＝6)未见心电图波形发生明显变化，与对照组基本一致，如图2c所示。以上结果提示cm4可引起豚鼠离体心脏发生心律失常，cm4-r可缓解这一症状。
图3为对三组离体心脏心电图qt间期的统计结果，表明cm4使豚鼠离体心脏qtc间期延长，并产生心律失常和心动过缓。
实施例3gstpull-down实验。
多肽cm4浓度为1μg/ul。gst-ct1(2-4ug)被固定在gs-4b上，在300μl体系中孵育4h，4℃，cm4浓度梯度(0.1，0.3，1.0，3.0，10.0μm)，体系钙离子浓度(0，100nm，10μm，2mm)。采用webmaxcv2.10软件计算[ca2+]。孵育结束后，用相对应的ca2+缓冲液轻柔地洗涤gst-4b-gst-ct1系统两次，最后一次将上清液弃干净。然后15μl5×sdsloadingbuffer洗脱处理。取上清液，15％sds-page电泳检测结合情况。采用考马斯亮蓝r(coomassiebrilliantbluer，cbb)染色和脱色，如图4所示。如图4为成功检测到cm4与ct1的结合情况([ca2+]≈free，100nm，10μm，2mm)，在分子量54和4kda处对应标记gst-ct1和cm4。cm4与ct1的结合具有多肽浓度和ca2+浓度依赖性。
实施例4整体动物模型实验。
小鼠随机分为三组：(1)control组：0.9％nacl；(2)cm4组：21mg/kgcm4；(3)cm4-r组：21mg/kgcm4-r。所有小鼠均于每日8:00和20:00进行两次腹腔注射。3周后，各组小鼠均用异氟烷麻醉(3％，吸入)。为了确定cm4对小鼠qt间期的影响，我们首先使用生物实验系统(成都泰盟软件有限公司，中国成都)检测心电图。两个心电电极按标准导联ii方向放置。计算qt间期，qtc的计算公式为：bazett公式(qtcb[ms]＝qt[ms]/(rr[s])1/2)，如图5和图6所示。
图5为小鼠给予多肽3周后监测心电图。结果显示，control组(0.9％nacl)心电图波形稳定，周期规律，如图5a所示。cm4组出现心律失常，如图5b所示。cm4-r组心电图无明显变化，与对照组基本一致，如图5c所示。以上结果表明cm4可引起小鼠心律失常。对小鼠心电图统计分析，与对照组相比，模型组qtc间期延长了111.89％，治疗组和治疗对照组无统计学差异，如图6所示。结果表明，cm4延长了qtc间期。
序列表
<110>中国医科大学
<120>一种构建长qt综合征动物模型的多肽
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