靶核酸的检查方法及检查装置与流程

本发明涉及从包含作为目标的核酸(以下有时称为靶核酸)的被检体中检测靶核酸的方法及用于执行该方法的试剂盒。更详细地说，涉及将阳性对照核酸混合至包含靶核酸的被检体用容器内并检测被检体中的靶核酸的方法及用于该方法的试剂盒。

背景技术：

在感染症的诊断、农作物的核酸检查、基因诊断等各种领域中广泛利用涉及核酸的扩增及检测的技术。使用了各种各样的方法作为进行核酸的扩增或检测的方法。

作为核酸的扩增法，除了有代表性的利用聚合酶链反应(以下有时称为pcr)的pcr法之外，还已知有转录-反转录协同反应(以下有时称为trc)法、转录介导扩增(以下有时称为tma)法、依赖核酸序列的扩增(以下有时称为nasba)法、环介导等温扩增(以下有时称为lamp)法、smart扩增工艺(以下有时称为map)法、等温嵌合引物启动核酸扩增(以下有时称为ican)法等。

例如，作为使用pcr法的对感染症的诊断，可以例举对葡萄膜炎的诊断。葡萄膜炎是在眼内发生炎症的疾病的总称，在重症例中，有较高概率引发失明等视觉障碍。葡萄膜炎被分为非感染性葡萄膜炎与由病原体引起的感染性葡萄膜炎。利用免疫抑制剂对非感染性葡萄膜炎进行药物治疗，但对于感染性葡萄膜炎，需要利用与作为感染原因的病原体相对应的药剂进行治疗。

但是，有时仅凭临床表现对感染性葡萄膜炎与非感染性葡萄膜炎进行辨别较为困难，存在因诊断的延迟或不适当的治疗而使症状加重的病例。因此，为了选择合适的治疗方法及防止症状加重，尽早地进行对葡萄膜炎中的病原体的存在及病原体的鉴定至关重要。

作为成为感染性葡萄膜炎的原因的病原体，可以例举病毒、细菌、真菌、原虫等，其中以病毒为原因的感染性葡萄膜炎的发病频率最高。作为成为原因的病毒，可以例举单纯疱疹病毒(hsv)1型及2型、水痘带状疱疹病毒(vzv)、巨细胞病毒(cmv)等疱疹病毒、以及人类t细胞白血病病毒(htlv-1)等。在进行感染性葡萄膜炎的诊断或治疗时，感染体的鉴定为重要的信息。因此，为了鉴定眼内局部中的感染病毒，需要将从前房采集的前房水或从眼内采集的玻璃体等作为被检体使用。

前房是位于角膜与晶状体之间的空间，为了对病原体进行鉴定，将充满该空间的前房水作为被检体，进行基于pcr的基因检查。但是，前房水的采集量通常为100μl以下，有时被检体量不够检测多种病原体。

进而，在感染性葡萄膜炎中，成为原因的病原体主要可以例举如下9个种类：单纯疱疹病毒1型(hsv-1)及2型(hsv-2)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(ebv)、人类疱疹病毒6型(hhv-6)、巨细胞病毒(cmv)、人类t细胞白血病病毒(htlv-1)、作为细菌的梅毒螺旋体、以及作为原虫的弓形虫。

为了单独地对这些病原体进行检测，需要对每个病原体分别制备pcr试剂及pcr引物等，但是若检测对象的数量变多，则发生试剂的放入错误等人为错误的可能性变高，还存在给出错误的检测结果的危险。

除了人为错误之外，还存在由于以前进行的核酸扩增反应的扩增产物混入新进行的核酸扩增反应的容器内(污染)，从而产生假阳性等的情况。作为防止这种污染的方法，公开有dutp/udg污染去除法(非专利文献1)、对dutp/udg污染去除法进行改良而得的方法(专利文献1)。

此外，在进行核酸的扩增及检测时，存在实际上是阳性但却由于某些原因而出现阴性的结果(假阴性)的情况。像这样的假阴性的结果导致本应检测出的核酸未被检测出，因此还提出有尽可能防止假阴性的方法(例如专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2004-507248号公报

专利文献2：国际公开wo2016/059798号公报

非专利文献1：《gene(基因)》，第93(1)期，第125-128页(1990年)

技术实现要素：

发明要解决的技术问题

本发明的目的在于，提供一种以微量的被检体也能够同时且迅速地检测多种病原体的检测方法以及用于执行该方法的试剂盒。进而，本发明的目的在于，提供一种检测方法及用于执行该方法的试剂盒，能够通过采用简便的检测工序，避免病原体的检测操作中的人为错误，从而降低假阴性的概率。

用于解决上述技术问题的方案

即，本发明涉及包括下述(1)～(5)的工序的靶核酸的检查方法。

(1)工序(1)：将包含靶核酸的被检体与阳性对照核酸混合，得到所述被检体与阳性对照核酸的被检体混合物

(2)工序(2)：将所述被检体混合物与包含表面活性剂的pcr缓冲液混合，得到缓冲液混合物

(3)工序(3)：将所述缓冲液混合物的一部分添加到包含dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的pcr对照用固体组合物中

(4)工序(4)：将所述缓冲液混合物的一部分添加到包含dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物中

(5)工序(5)：对所述工序(3)及(4)的结果所生成的pcr产物进行检测

本发明还涉及包含下述(1)～(4)的靶核酸的检查用试剂盒。

(1)具备阳性对照核酸的被检体采集容器

(2)具备包含表面活性剂的pcr缓冲液的pcr反应液容器

(3)具备包含dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的pcr对照用固体组合物的pcr反应对照容器

(4)至少1个以上的pcr反应容器，该pcr反应容器具备包含dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物

发明效果

根据本发明，能够提供一种即使是以包含靶核酸的微量的被检体(例如前房水)，也能够同时且迅速地检测多种病原体的检测方法以及用于执行该方法的试剂盒。进而，根据本发明，能够提供一种检测方法及用于执行该方法的试剂盒，能够利用简便的检测工序，避免病原体的检测操作中的人为错误，特别是降低假阳性的频率。

附图说明

图1是示出本发明的一实施方式的示意图。

图2是示出使用本发明的方法和试剂盒以及定量pcr(qpcr)法对疑似存在病原体的97例的人类前房水或玻璃体进行分析而得的结果的图。

图3是示出在图2中使用本发明的方法及试剂盒得到的cq值以及利用定量pcr(qpcr)法得到的定量值(拷贝/ml)的相关性的图。

图4是示出使用本发明的方法和试剂盒以及定量pcr(qpcr)法对被诊断为非感染性葡萄膜炎的52例的人类前房水或玻璃体进行分析而得的结果的图。

具体实施方式

本发明的方法包括将包含靶核酸的被检体与阳性对照核酸混合从而得到所述被检体与阳性对照核酸的被检体混合物的工序(以下有时称为工序(1))。

本发明中的靶核酸是指从被检试样中进行检测或定量的对象的核酸，是指在后述的工序中通过使用了pcr引物对的核酸扩增反应所扩增的区域的核酸。

靶核酸能够根据疾病的诊断、疾病的发病风险的判定等目的而适当选择，例如可以例举如下的基因。

1.与疾病的原因或恶化相关联的基因等(也包括非编码区域)或其一部分或它们的转录产物

2.由于疾病的发病而异常表达的基因等(也包括非编码区域)或其一部分或它们的转录产物

3.与疾病的发病风险相关联的基因等(也包括非编码区域)或其一部分或它们的转录产物

作为上述基因等的具体例，可以例举可成为疾病的原因等的病毒、细菌、真菌、原虫的基因等。

病毒包括dna病毒及rna病毒。作为dna病毒，可以例举单纯疱疹病毒1型(以下有时称为hsv-1)及2型(以下有时称为hsv-2)、水痘带状疱疹病毒(以下有时称为vzv)、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(以下有时称为ebv)、人类疱疹病毒6型(以下有时称为hhv-6)、巨细胞病毒(以下有时称为cmv)等，此外作为rna病毒，可以例举人类t细胞白血病病毒(以下有时称为htlv-1)等，但并不限定于这些。作为细菌，以梅毒螺旋体等为检测对象，此外作为原虫，以弓形虫等为检测对象，但并不限定于这些。

另外，在本发明中，被检体包含上述靶核酸，采集被检体的生物种与靶核酸来源的生物种可以是异种，也可以是同种。作为是异种的情况的例子，可以例举出于确认哺乳动物是否感染病原微生物的目的，将该病原微生物的特定的核酸作为靶核酸，从哺乳动物中采集被检体的情况。作为是同种的情况的例子，可以例举出于确认哺乳动物是否患有疾病的目的，将与该疾病相关联的哺乳动物基因的特定的核酸作为靶核酸，从该哺乳动物中采集被检体的情况。

作为被检体的具体例，可以例举从眼组织得到的固态物、粘性物或液态物。例如，为了诊断葡萄膜炎中的病原体的感染，优选使用前房水或玻璃体。前房水的采集量一般为50～100μl左右。在本发明中，能够使用12～20μl的前房水或者玻璃体来检测微生物的感染，但根据作为测量对象的微生物的数目，即使小于12μl也可检测。

在工序(1)中混合的阳性对照核酸成为靶核酸的阳性对照物。通过在工序(1)中将被检体与阳性对照物混合并进行后述的各工序，能够确认pcr引物对实现了与目的一致的功能从而正确地进行了核酸扩增反应，以及确认靶核酸用探针实现了与目的一致的功能。

阳性对照核酸可以是预先从被检体来源的生物种、或者靶核酸来源的生物种中提取、扩增而得的核酸，也可以是另外从不同的生物种中提取的核酸。且阳性对照核酸还可以是人工合成的核酸。

上述阳性对照核酸优选为采集被检体的生物种中所包含的核酸，从达到上述效果的观点来看，更优选为管家基因。作为管家基因，可以例举tata-结合蛋白(以下有时称为tbp)基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下有时称为gapdh)基因、β-肌动蛋白基因、β2-微球蛋白基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(以下有时称为hprt1)、18srrna基因、5-氨基酮戊酸合酶(以下有时称为alas)基因、β珠蛋白(β-globin)基因、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(以下有时称为g6pd)基因、β-葡萄糖醛酸苷酶(以下有时称为gusb)基因、输入蛋白8(以下有时称为ipo8)基因、胆色素原脱氨基酶(以下有时称为pbgd)基因、磷酸甘油酸激酶1(以下有时称为pgk1)基因、肽基脯氨酰异构酶a(以下有时称为ppia)基因、核糖体蛋白l13a(以下有时称为rpl13a)基因、核糖体蛋白大p0(以下有时称为rplp0)基因、琥珀酸脱氢酶亚基a(以下有时称为sdha)基因、转铁蛋白受体(以下有时称为tfrc)基因、3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白zeta(以下有时称为ywhaz)基因等。

将在工序(1)中得到的被检体混合物与包含表面活性剂的pcr缓冲液混合，得到缓冲液混合物(以下有时称为工序(2))。可以认为，通过使包含前房水及玻璃体等靶核酸的被检体与包含表面活性剂的pcr缓冲液混合，可在pcr中促进靶核酸的溶解。作为pcr缓冲液中所包含的表面活性剂，能够选择阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂。优选为非离子表面活性剂，且在与被检体混合时，优选为0.05～5％(w/v)。

从靶核酸的溶解的观点来看，所述pcr缓冲液优选包含kcl、mgcl2及脱氧核糖核苷酸5'-三磷酸(dntp)混合物。另外，dntp混合物是指，预先以规定浓度将脱氧腺苷三磷酸(以下有时称为datp)、脱氧鸟苷三磷酸(以下有时称为dgtp)、脱氧胞苷三磷酸(以下有时称为dctp)、脱氧胸苷三磷酸(以下有时称为dttp)混合而得的水溶液。且从靶核酸的溶解的观点来看，所述pcr缓冲液优选为tris盐酸。关于dntp、mgcl2、kcl及缓冲液的浓度，能够根据被检体的种类、靶核酸、后述的工序中使用的pcr引物对进行适当设定。例如，在被检体为前房水或者玻璃体的情况下，优选mgcl2约1.5mm、kcl约35mm、dntp约200μm、tris盐酸约10mm。

所述pcr缓冲液包含以下物质：与吸附于dna聚合酶的源自生物的负电荷物质(例如某种糖及色素等)及吸附于dna的源自生物的正电荷物质(例如某种蛋白质等)这样的抑制pcr的物质结合，从而中和所述负电荷物质及正电荷物质的pcr抑制作用的物质。作为所述pcr缓冲液，能够使用基因扩增用试剂ampdirect(注册商标，岛津制作所)或ampdirectplus(注册商标，岛津制作所)。由于无需固相提取或液相提取这样的对dna进行纯化的处理而不需要废弃液体，因此从能够以更少量的试样进行pcr反应等的观点来看，优选使用这样的基因扩增用试剂。

将在工序(2)中得到的缓冲液混合物的一部分添加到包含dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的pcr对照用固体组合物中(以下有时称为工序(3))。

在工序(3)中使用的阳性对照核酸可以与在工序(1)中添加的阳性对照核酸相同，也可以不同，但从方法的简便性的观点来看，优选使用相同的核酸。在工序(3)中使用的阳性对照核酸的具体例可以例举与上述相同的核酸。

pcr反应对照核酸通过示出阳性的扩增曲线而成为示出正确地进行了分析的指标，即，成为示出被检体被正确地添加到后述的包含dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物中的指标。

pcr反应对照核酸可以是预先从被检体来源的生物种、或者靶核酸来源的生物种中提取、扩增而得的核酸，也可以是另外从不同的生物种中提取的核酸。且pcr反应对照核酸还可以是人工合成的核酸。

上述pcr对照核酸优选为采集被检体的生物种中所包含的核酸，从达到上述效果的观点来看，更优选为管家基因。虽然能够例示与上述阳性对照核酸相同的核酸作为管家基因，但从确认被检体被正确地添加到pcr反应用固体组合物中的观点来看，优选使用与阳性对照核酸不同的核酸。

从检测精度的观点来看，优选gapdh及tbp的组合作为阳性对照核酸与pcr反应对照核酸的组合。gapdh是作为管家基因在大量组织和细胞中共通地以一定量表达的基因，用作确认pcr的进展的阳性对照物。tbp是与被称为tata框的dna序列结合的基本转录因子，由于其反映细胞数，因此作为确认细胞被采集并包含于被检体中的pcr反应对照物使用。

本发明的阳性对照核酸对于被检试样中的靶核酸的定量(绝对定量或相对定量)也是有用的。在用于绝对定量的情况下，例如，通过基于已知浓度的阳性对照核酸的测量结果制成检量线，能够高精度地进行未知浓度的被检试样样品中的靶核酸的定量。此外，在用于相对定量的情况下，例如，在阳性对照核酸样品与被检试样样品之间对达到一定浓度为止所需的循环数进行比较并基于通过1次循环扩增为2倍的pcr原理，也能够计算相对浓度差。

将在工序(2)中得到的缓冲液混合物的一部分添加到另外准备的包含dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物中(以下有时称为工序(4))。

通过上述工序(4)启动pcr，扩增靶核酸。所述dna聚合酶是源自嗜热性细菌的耐热性dna聚合酶，例如可以例举taq、tth、kod、pfu及它们的突变体。从避免dna聚合酶引起的非特异性扩增的观点来看，也可以使用热启动dna聚合酶。作为热启动dna聚合酶，可以例举结合有抗dna聚合酶抗体的dna聚合酶或酶活性部位进行热敏感性化学修饰而得的dna聚合酶，优选结合有抗dna聚合酶抗体的dna聚合酶。

从能够同时检测多种靶核酸的观点来看，优选如下方法：准备2个以上包含1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物，将在所述工序(2)中得到的缓冲液混合物的一部分添加到各pcr反应用固体组合物中。例如，将在所述工序(2)中得到的缓冲液混合物添加到包含pcr引物对的多个pcr反应用固体组合物中来进行pcr，由此能够同时检测多种靶核酸。

作为在工序(4)中使用的pcr引物对的例子，可以例举用于对单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或2型(hsv-2)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(ebv)、人类疱疹病毒6型(hhv-6)、巨细胞病毒(cmv)、人类t细胞白血病病毒(htlv-1)、梅毒螺旋体或者弓形虫的靶基因区域进行扩增的pcr引物对。

这些pcr引物对能够将两种以上组合并加入pcr反应用固体组合物中。由此，能够用1个pcr反应用固体组合物检测两种以上的靶核酸。从检测的迅速性的观点来看，优选使用组合了2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物。

作为节约被检体量并同时扩增多个靶基因的方法，提出有多重pcr(multiplexpcr)(sugitas等人，《brjophthalmol(英国眼科学杂志)》，2008；92：928-932以及sugitas等人，《ophthalmology(眼科学)》，2013；120：1761-1768)。多重pcr是通过在一个pcr反应系统中使用多个pcr引物对，从而同时扩增多个基因区域的方法。在该方法中，除了能够节约被检体量之外，还具有能够同时检测多种病原微生物的优点。然而，在实施pcr之前，需要从被检体中提取核酸。此外，在多重pcr中，需要研究所使用的引物的设定条件及反应条件，以使各pcr引物对的对靶基因区域的扩增在一个pcr反应系统中良好地推进。

作为pcr引物对的例子，可以例举(i)hsv-1检测用引物对及vzv检测用引物对、(ii)hsv-2检测用引物对及hhv-6检测用引物对、(iii)ebv检测用引物对及cmv检测用引物对、以及(iv)htlv-1检测用引物对及梅毒螺旋体检测用引物对的组合。此外，为了同时检测3种病原微生物，也可以加入3种以上的pcr引物对。各引物的碱基序列能够基于靶核酸的序列数据库(genbank等)的碱基序列信息适当地设计。

在上述工序(3)及(4)中使用的pcr对照用固体组合物及pcr反应用固体组合物通常通过冷冻干燥来制备，但只要可维持这些固体组合物中所包含的酶等的活性，就不限定于冷冻干燥。通过制成固体组合物，只要添加在所述工序(2)中得到的缓冲液混合物，就能够启动pcr，因此测量操作简便。此外，使用前的保管也变得简单。

从检测精度的观点来看，所述工序(3)及(4)中的pcr对照用固体组合物及pcr反应用固体组合物优选包含寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针被用于对pcr扩增产物进行荧光检测的1种或2种以上的荧光色素标记。在pcr反应用固体组合物包含1种pcr引物对的情况下，用于如后述那样的实时测量的荧光色素可以是1种，但在包含2种以上的pcr引物对的情况下，需要两种以上不同的荧光色素。作为该荧光色素的例子，可以例举6-羧基荧光素(以下有时称为fam)、6-羧基-x-罗丹明(以下有时称为rox)、花青类色素(以下有时称为cy5)及4，7，2'，4'，5'，7'-六氯-6-羧基荧光素(以下有时称为hex)。寡核苷酸探针的碱基序列能够基于pcr扩增产物的序列数据库(genbank等)的碱基序列信息适当地设计。

若在上述pcr反应用固体组合物中添加缓冲液混合物，则pcr反应用固体组合物溶解，通过进行热循环来推进pcr。pcr条件(温度、时间及循环数)的设定可根据靶核酸的种类等适当设定。只要推进pcr且靶核酸加入缓冲液混合物，就可在后述的对pcr产物进行检测的工序中得到阳性的结果，从而进行疾病的诊断、疾病的发病风险的判定等。

对在所述工序(3)及(4)的结果所生成的pcr产物进行检测(以下有时称为工序(5))。对pcr产物进行检测的方法例如可以例举使用了琼脂糖凝胶的电泳法、利用热熔解曲线的检测、荧光检测等方法。此外，从检测的迅速性的观点来看，优选被称为实时测量的检测方法。

pcr产物的实时测量也被称为实时pcr。在实时pcr中，通常利用荧光检测pcr扩增产物。在荧光检测方法中，有使用嵌入性荧光色素的方法及使用荧光标记探针的方法。作为嵌入性荧光色素的例子，可以例举sybr(注册商标)greeni。嵌入性荧光色素与通过pcr合成的双链dna结合，通过激发光的照射发出荧光。通过测量该荧光强度，能够测量pcr扩增产物的生成量。

作为荧光标记探针，可以例举水解探针、分子信标(molecularbeacon)、环状探针(cyclingprobe)等。水解探针是5'末端用荧光色素修饰且3'末端用淬灭剂物质修饰的寡核苷酸。水解探针在pcr的退火步骤中与模板dna特异性地杂交，但由于在探针上存在淬灭剂，因此即便照射激发光也可抑制荧光的产生。在此后的延伸反应步骤中，例如，若由于taqdna聚合酶所具有的5'→3’核酸外切酶活性而使与模板dna杂交的水解探针被分解，则荧光色素从探针游离，淬灭剂对荧光产生的抑制被解除而发出荧光。通过测量该荧光强度，能够测量扩增产物的生成量。

作为所述荧光色素的例子，可以例举与上述荧光色素同样的荧光色素。作为所述淬灭剂的例子，可以例举tamra(注册商标)、blackholequencher(bhq、注册商标)1、bhq2、mgb-eclipse(注册商标)及dabcyl等。为了区别并检测2种以上的靶核酸，从检测精度的观点出发，优选使用分别被不同的荧光色素标记的2种以上的寡核苷酸探针(例如水解探针)进行pcr。

在pcr产物的实时测量的情况下，通过用与所使用的荧光色素相对应的荧光过滤器监视pcr产物的扩增曲线，能够实时地确认pcr的推进状况。在荧光强度根据pcr循环数增加的情况下，判定为被检体中的靶核酸的存在为阳性，另一方面，在pcr中荧光强度不增加的情况下判定为阴性。此时，只要上述阳性对照核酸的荧光强度根据pcr循环数增加，则判断为，被检体一定包含在缓冲液混合物中，被用于工序(4)。此外，只要上述pcr反应对照核酸的荧光强度根据pcr循环数增加，则能够判断为被检体一定被用于工序(4)，并且dna聚合酶及pcr引物对正常工作。因此，提高了靶核酸的存在为阴性的判定的可靠性。

为了有效地进行上述方法，本发明还提供包含下述(1)～(4)的靶核酸的检查用试剂盒。

(1)具备阳性对照核酸的被检体采集容器

(2)具备包含表面活性剂的pcr缓冲液的pcr反应液容器

(3)具备包含dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的pcr对照用固体组合物的pcr反应对照容器

(4)至少1个以上的pcr反应容器，该pcr反应容器具备包含dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物

上述检查用试剂盒在采集极少量的被检体并按照上述的各工序对多种靶核酸进行检查的情况下，能够高效地进行检查。

本发明的检查用试剂盒至少包含1个具备阳性对照核酸的被检体采集容器。所含的阳性对照核酸如上所述。对于被检体检测容器的形状、大小等没有特别限制，优选处理简便且耐化学性优异的材质。且优选可视性优异的材质。

通过将必要量的包含靶核酸的被检体滴加至上述被检体采集容器中，可以得到被检体与阳性对照核酸的被检体混合物。从能够利用少量的被检体检查靶核酸，并且抑制人为错误的观点来看，被检体采集容器优选为一个。

本发明的检查用试剂盒至少包含一个具备含有表面活性剂的pcr缓冲液的pcr反应液容器。表面活性剂及pcr缓冲液如上所述。

通过将必要量的在所述被检体采集容器中得到的被检体混合物滴加至pcr反应容器，能够得到缓冲液混合物。从抑制操作的繁杂程度的观点来看，pcr反应容器优选为一个。

本发明的检查用试剂盒至少包含一个pcr反应对照容器，所述pcr反应对照容器具备包含dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的pcr对照用固体组合物。采集在所述pcr反应液容器中得到的缓冲液混合物的一部分，向所述pcr反应对照容器中滴加必要量，如上所述地进行热循环，由此在pcr反应对照容器内推进pcr反应，进行对阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的扩增。

pcr反应对照用固体组合物中所包含的dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸如上所述。此外，对于pcr反应对照用固体组合物也如上所述。

pcr反应对照容器可以是1个，也可以是2个以上。从操作的简便性的观点来看，pcr反应对照容器优选为1个。另一方面，从使pcr反应的结果的准确度更高的观点来看，pcr反应对照容器优选为2个以上。可根据靶核酸的种类的数目、被检体的量等适当设定pcr反应对照容器的数目。此外，上述pcr反应对照容器也可以包含如下pcr对照用固体组合物：包含被用于对上述pcr扩增产物进行荧光检测的1种或2种以上的荧光色素标记的寡核苷酸探针的pcr对照用固体组合物。

本发明的检查用试剂盒至少包含一个以上的pcr反应容器，所述pcr反应容器具备包含dna聚合酶及一种或两种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物。采集在所述pcr反应液容器中得到的缓冲液混合物的一部分，向所述pcr反应容器中滴加必要量，如上所述地进行热循环，由此在pcr反应容器内推进pcr反应，如果靶核酸存在于被检体中，则会进行靶核酸的扩增。

pcr反应用固体组合物中所包含的dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对如上所述。此外，对于pcr反应用固体组合物也如上所述。

pcr反应容器可根据靶核酸的种类的数目、pcr反应用固体组合物中所包含的pcr引物对的种类的数目适当设定。

此外，上述pcr反应容器也可以包含如下pcr反应用固体组合物：包含被用于对上述pcr扩增产物进行荧光检测的1种或2种以上的荧光色素标记的寡核苷酸探针的pcr反应用固体组合物。从能够削减被检体的量的观点来看，优选使用含有多个pcr引物对及/或2种以上的荧光色素的pcr反应用固体组合物。

利用上述检查用试剂盒得到的pcr产物被提供至电泳法、利用热熔解曲线进行的检测、荧光检测等分析方法中，进而被分析。

上述被检体采集容器、pcr反应液容器、pcr反应对照容器及pcr反应容器的材质、形状、容量等可以彼此不同，也可以相同。对于材质，优选处理简便且耐化学性优异的材质。且优选可视性优异的材质。作为这些材质的例子，可以例举玻璃、聚丙烯等。

例如从处理性的观点来看，形状、容量等优选全部相同，但从抑制被检体或各混合物的漏添加等人为错误的观点来看，优选能够通过颜色、符号、编号等识别各容器。作为用于各容器的仪器，可例举连结有多个管的管条，优选为连结有微孔的管条。容器数量通常为2～12，优选为2～10，更优选为2～8。

实施例

接下来，例举实施例对本发明进行详细说明，但本发明的范围不受这些实施例限定。

【实施例1】

〔97例的感染性葡萄膜炎阳性被检体的分析〕

将20μl从疑似感染性葡萄膜炎的97例患者得到的被检体的前房水或者玻璃体采集至包含tbp作为阳性对照核酸的被检体采集容器，得到被检体混合物。将得到的被检体混合物在pcr反应容器内与180μl的pcr缓冲液混合，得到缓冲液混合物。混合后的pcr缓冲液的组成为0.05％(w/v)非离子性表面活性剂、1.5mm的mgcl2、35mm的kcl及各200μm的dntp(datp、dgtp、dctp及dttp)。将得到的缓冲液混合物20μl分别注入具备pcr反应对照用固体组合物的pcr反应对照容器、及具备pcr反应用固体组合物的各pcr反应容器，所述pcr反应对照用固体组合物包含作为阳性对照核酸的gapdh、作为pcr反应对照核酸的tbp及dna聚合酶，所述pcr反应用固体组合物包含下述的pcr引物对与dna聚合酶。pcr反应对照固体组合物及pcr反应用固体组合物还包含被用于在各容器中对不同的pcr扩增产物进行荧光检测的荧光色素标记的寡核苷酸探针。

pcr反应容器内的pcr引物对的组合如下所示。

(i)hsv-1检测用引物对及vzv检测用引物对

(ii)hsv-2检测用引物对及hhv-6检测用引物对

(iii)ebv检测用引物对及cmv检测用引物对

(iv)htlv-1检测用引物对及梅毒螺旋体检测用引物对

(v)弓形虫检测用引物对

对于包含利用缓冲液混合物溶解后的pcr反应对照用固体组合物及pcr反应用固体组合物的各容器，使用实时pcr装置(appliedbiosystems7500fastdxreal-timepcr装置)，利用水解探针法监视pcr反应。作为pcr条件，进行95℃/10秒钟的初期改性，接着进行45次循环的95℃/5秒钟-60℃/20秒钟的pcr。基于cq值(扩增曲线与阈值线(thresholdline)相交的循环数)判断作为靶核酸的病原微生物的存在(阳性)或非存在(阴性)。此外，作为对照，从各被检体纯化出dna后，利用实时pcr(qpcr)法对拷贝数进行定量。

对于利用本发明的方法测量的病原体，将其与实时pcr(qpcr)法进行比较的结果示出在图2。此外，利用实时pcr(qpcr)法的定量值与利用本发明的方法测量的cq值的相关性如图3所示。

根据图2的结果，能够由实时pcr(qpcr)法进行定量的97例的阳性被检体即使在使用本发明的方法进行测量的情况下，也全部为阳性。此外，图3的结果示出，定量值与cq值之间存在相关性。图3的结果示出，鉴定出cmv、vzv、hsv-1、hsv-2、htlv-1、ebv、梅毒螺旋体及弓形虫。此外，图3的结果示出，定量值与cq值之间存在相关性。

【实施例2】

〔被诊断为非感染性葡萄膜炎的被检体的分析〕

对于从被诊断为非感染性葡萄膜炎的患者得到的52例被检体，使用实时pcr(qpcr)法及本发明的方法测量而得的结果如图4所示。在实时pcr(qpcr)法中在全部的被检体中均为阴性，在本发明的方法中也全部为阴性。即，表示根据两种方法得到的测量结果一致。

[方案]

本领域技术人员可以理解，上述示例性的实施方式是以下的方案的具体例。

[1]包括下述(1)～(5)的工序的靶核酸的检查方法。

(1)工序(1)：将包含靶核酸的被检体与阳性对照核酸混合，得到所述被检体与阳性对照核酸的被检体混合物

(2)工序(2)：将所述被检体混合物与包含表面活性剂的pcr缓冲液混合，得到缓冲液混合物

(3)工序(3)：将所述缓冲液混合物的一部分添加到包含dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的pcr对照用固体组合物中

(4)工序(4)：将所述缓冲液混合物的一部分添加到包含dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物中

(5)工序(5)：对所述工序(3)及(4)的结果所生成的pcr产物进行检测

根据上述[1]的发明，即使是对包含靶核酸的微量的被检体(例如前房水)，也能够同时且迅速地检测多种病原体。进而，根据上述[1]的发明，能够提供一种检测方法，能够利用简便的检测工序，避免病原体的检测操作中的人为错误，特别是降低假阳性的频率。

[2]如上述[1]所记载的方法，其特征在于，所述被检体为前房水或玻璃体。

[3]如上述[1]或[2]所记载的方法，其特征在于，所述被检体的量为12～20μl。

[4]如上述[1]～[3]的任一项所记载的方法，其特征在于，所述被检体包含选自下组的至少一种病原体：单纯疱疹病毒1型(hsv-1)及2型(hsv-2)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(ebv)、人类疱疹病毒6型(hhv-6)、巨细胞病毒(cmv)、人类t细胞白血病病毒(htlv-1)、梅毒螺旋体及弓形虫。

根据上述[2]～[4]的发明，能够同时且迅速地检测作为感染性葡萄膜炎的原因的病原体。

[5]如上述[1]～[4]的任一项所记载的方法，其特征在于，在所述工序(1)中，阳性对照核酸是管家基因。

[6]如上述[5]所记载的方法，其特征在于，在所述工序(1)中，阳性对照核酸是tata-结合蛋白(tbp)。

根据上述发明[5]及[6]的发明，能够更加可靠地确认pcr引物对实现了与目的一致的功能从而正确地进行了核酸扩增反应，以及确认靶核酸用探针实现了与目的一致的功能。

[7]如所述[1]～[6]的任一项所记载的方法，其特征在于，表面活性剂是非离子性表面活性剂。

[8]如所述[1]～[7]的任一项所记载的方法，其特征在于，pcr缓冲液是包含kcl、mgcl2及dntp混合物(由datp、dgtp、dctp及dttp构成的混合物)的tris缓冲液。

[9]如所述[1]～[8]的任一项所记载的方法，其特征在于，pcr缓冲液包含以下物质：与吸附于dna聚合酶的源自生物的负电荷物质及吸附于dna的源自生物的正电荷物质这样的抑制pcr的物质结合，从而中和所述负电荷物质及正电荷物质的pcr抑制作用的物质。

根据上述[7]～[9]的发明，靶核酸的溶解变得更加容易，能够进一步降低被检体的使用量。

[10]如所述[1]～[9]的任一项所记载的方法，其特征在于，在所述工序(3)中，阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的至少任一方是管家基因。

[11]如所述[1]～[10]的任一项所记载的方法，其特征在于，在所述工序(3)中，阳性对照核酸与所述工序(1)的阳性对照核酸相同。

[12]如所述[1]～[11]的任一项所记载的方法，其特征在于，在所述工序(3)中阳性对照核酸是tata-结合蛋白(tbp)、pcr反应对照核酸是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)。

根据所述[10]～[12]的发明，能够进一步可靠地确认pcr引物对实现了与目的一致的功能从而正确地进行了核酸扩增反应，以及确认靶核酸用探针实现了与目的一致的功能。

[13]如所述[1]～[12]的任一项所记载的方法，其特征在于，pcr引物对是用于对单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或2型(hsv-2)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(ebv)、人类疱疹病毒6型(hhv-6)、巨细胞病毒(cmv)、人类t细胞白血病病毒(htlv-1)、梅毒螺旋体或者弓形虫进行检测的pcr引物对。

[14]如所述[1]～[13]的任一项所记载的方法，其特征在于，2种pcr引物对为如下组合。

(i)hsv-1检测用引物对及vzv检测用引物对

(ii)hsv-2检测用引物对及hhv-6检测用引物对

(iii)ebv检测用引物对及cmv检测用引物对

(iv)htlv-1检测用引物对及梅毒螺旋体检测用引物对

根据所述发明[13]及[14]，能够同时且迅速地检测作为感染性葡萄膜炎的原因的病原体。

[15]如所述[1]～[14]的任一项所记载的方法，其特征在于，在所述工序(3)及(4)中，pcr对照用固体组合物及pcr反应用固体组合物包含寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针被用于对pcr扩增产物进行荧光检测的1种或2种以上的荧光色素标记。

[16]如所述[15]所记载的方法，其特征在于，所述荧光色素是选自下组的至少一种荧光色素：fam(6-羧基荧光素)、rox(6-羧基-x-罗丹明)、cy5(花青类色素)及hex(4，7，2'，4'，5'，7'-六氯-6-羧基荧光素)。

根据所述发明[15]及[16]，可得到检测精度更高的结果。

[17]如所述[1]～[16]的任一项所记载的方法，其特征在于，在所述工序(3)及(4)中，pcr对照用固体组合物及pcr反应用固体组合物通过冷冻干燥制备而得。

根据上述发明[17]，检查靶核酸的操作变得简便，且使用前的保管也变得简单。

[18]如所述[1]～[17]的任一项所记载的方法，其特征在于，在所述工序(3)中，通过实时测量进行pcr产物的检测。

根据所述发明[18]，靶核酸的检测变得迅速。

[19]一种靶核酸的检查用试剂盒，包含下述(1)～(4)。

(1)具备阳性对照核酸的被检体采集容器

(2)具备包含表面活性剂的pcr缓冲液的pcr反应液容器

(3)具备包含dna聚合酶、阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的pcr对照用固体组合物的pcr反应对照容器

(4)至少1个以上的pcr反应容器，该pcr反应容器具备包含dna聚合酶及1种或2种以上的pcr引物对的pcr反应用固体组合物

根据上述发明[19]，能够提供一种检查用试剂盒，即使是以包含靶核酸的微量的被检体(例如前房水)，也能够同时且迅速地执行检测多种病原体的靶核酸的检查。进而，根据上述[19]的发明，能够提供一种检查用试剂盒能执行如下检测方法：能够利用简便的检测工序，避免病原体的检测操作中的人为错误，特别是降低假阳性的频率。

[20]如所述[19]所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述被检体采集容器所包含的阳性对照核酸是管家基因。

[21]如所述[19]或[20]所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述被检体采集容器所包含的阳性对照核酸是tata-结合蛋白(tbp)。

根据所述[20]及[21]的发明，能够提供一种检查试剂盒，其中，pcr引物对实现了与目的一致的功能而正确地进行核酸扩增反应，靶核酸用探针实现了与目的一致的功能。

[22]如所述[19]所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂是非离子表面活性剂。

[23]如所述[19]～[22]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述pcr缓冲液是包含kcl、mgcl2及dntp混合物(由datp、dgtp、dctp及dttp构成的混合物)的tris缓冲液。

[24]如所述[19]～[23]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述pcr缓冲液包含以下物质：与吸附于dna聚合酶的源自生物的负电荷物质及吸附于dna的源自生物的正电荷物质这样的抑制pcr的物质结合，从而中和所述负电荷物质及正电荷物质的pcr抑制作用的物质。

若使用上述[22]～[24]的发明的检查用试剂盒，则靶核酸的溶解变得更加容易，能够进一步降低被检体的使用量。

[25]如所述[19]～[24]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述pcr反应对照容器所包含的阳性对照核酸及pcr反应对照核酸的至少任一方是管家基因。

[26]如所述[19]～[25]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述pcr反应对照容器所包含的阳性对照核酸与所述被检体采集容器所包含的阳性对照核酸相同。

[27]如所述[19]～[26]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述pcr反应对照容器所包含的阳性对照核酸是tata-结合蛋白(tbp)、pcr反应对照核酸是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)。

通过使用所述[25]～[27]的发明的检查用试剂盒，能够进一步可靠地确认pcr引物对实现了与目的一致的功能从而正确地进行了核酸扩增反应，以及确认靶核酸用探针实现了与目的一致的功能。

[28]如所述[19]～[27]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，包含2～12个所述pcr反应容器。

通过使用所述[28]的发明的检查用试剂盒，能够同时且迅速地检查多种靶核酸。

[29]如所述[19]～[28]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述pcr引物对是用于对单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或2型(hsv-2)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(ebv)、人类疱疹病毒6型(hhv-6)、巨细胞病毒(cmv)、人类t细胞白血病病毒(htlv-1)、梅毒螺旋体或者弓形虫进行检测的pcr引物对。

[30]如所述[19]～[29]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述各管所包含的2种pcr引物对为如下组合。

(i)hsv-1检测用引物对及vzv检测用引物对

(ii)hsv-2检测用引物对及hhv-6检测用引物对

(iii)ebv检测用引物对及cmv检测用引物对

(iv)htlv-1检测用引物对及梅毒螺旋体检测用引物对

若使用所述发明[29]及[30]的检查用试剂盒，则能够同时且迅速地检测作为感染性葡萄膜炎的原因的病原体。

[31]如所述[19]～[30]的任一项所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述pcr对照用固体组合物及pcr反应用固体组合物包含寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针被用于对pcr扩增产物进行荧光检测的1种或2种以上的荧光色素标记。

[32]如所述[31]所记载的检查用试剂盒，其特征在于，所述荧光色素选自下组：fam(6-羧基荧光素)、rox(6-羧基-x-罗丹明)、cy5(花青类色素)及hex(4，7，2'，4'，5'，7'-六氯-6-羧基荧光素)。

若使用所述发明[31]及[32]的检查用试剂盒，可得到检测精度更高的结果。

[33]如所述[19]～[32]的任一项所记载的试剂盒，其特征在于，所述pcr对照用固体组合物及pcr反应用固体组合物通过冷冻干燥制备而得。

上述发明[33]的检查用试剂盒使检查靶核酸的操作变得简便，且使用前的保管也变得简单。