一种香菇L952菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法与流程

本发明属于香菇菌种的检测领域，具体涉及一种香菇l952菌种的indel标记指纹图谱及其构建方法。

背景技术：

香菇(lentinulaedodes(berk.)pegler)因具有较高的营养价值和药用价值，而备受消费者欢迎。中国是世界上最早进行香菇人工栽培的国家，栽培历史已有800多年，目前香菇是国内栽培最广、产量最高的菇种。据中国食用菌协会统计，2018年中国食用菌总产量为3842.04万吨，其中香菇总产量为1043.12万吨，占国内食用菌总产量的27.15％，占世界香菇总产量的90％以上。近年来香菇产业成为国内精准扶贫的重要抓手，据统计全国超过50％以上的国家级贫困县选择香菇作为重要产业，我国香菇栽培规模进一步扩大，但随着我国香菇产业的快速发展，香菇生产用种“同种异名，异种同名”的问题日益突出，这不仅损害了香菇育种者的知识产权更为生产者造成了极大地风险，为香菇产业进一步发展造成了隐患。为保障育种者的权益和降低生产者的风险，促进我国香菇产业健康、稳定和可持续发展，建立一种简便、快速、可靠的香菇菌种特异性鉴定技术迫在眉睫。

随着生物信息学的快速发展，dna测序技术的不断成熟，测序的通量在不断增加而成本在降低。dna分子标记技术能够从基因水平上检测香菇菌种的遗传特异性，香菇全基因组测序的完成为indel标记的开发提供了便利。indel分子标记是一种基于高通量测序技术的应用，降低了indel标记开发的成本，适用于香菇全基因组测序分子标记的开发。且indel标记具有数量丰富、准确性高、稳定性好、快捷简便等优点，不仅用于分子标记辅助育种，而且也可用于香菇菌株鉴定。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇l952菌种的indel标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。

本发明的一种香菇l952菌种的indel标记指纹图谱，该指纹图谱由7对indel标记组成，是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的indel标记引物，扩增带型好，重复性高，标记详细信息如表1。

表1indel标记引物信息列表

本发明还提供了一种香菇l952菌种的indel标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对indel标记引物，对香菇菌种进行indel标记扩增，将得到的带型与l952菌种的带型对照，与该带型一致即为香菇l952菌种；

其中香菇l952菌种的带型编号组合为：12(1+2)1(1+2)1(1+2)。

通过对收集的44个香菇品种的indel标记引物带型扩增，本发明确定了7对indel标记引物在44个香菇品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同indel等位位点的编号组合可有效识别l952菌种(图2-8)。通过dna分子量对照d2000bpdnaladder可确定各indel标记引物扩增的等位位点的相对分子量，存在l952菌种特异indel等位片段组合的菌种，即是香菇l952菌种，该菌种的编号组合为：12(1+2)1(1+2)1(1+2)。

表2indel引物扩增的等位片段信息汇总表

本发明还提供了上述香菇l952菌种的indel标记指纹图谱的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基pda中，23～25℃下避光培养，10d后收集菌丝；

(2)基因组dna的提取：用ctab法提取上述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和纯度，调整样品dna的浓度为20～30ng/ul；

ctab法提取菌丝的基因组dna工艺包括：

①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2ml离心管中，并放入2-3颗钢珠；

②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60hz，时间30s研磨至均匀粉末；

③加入65℃预热1h的2×ctab抽提液，于65℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；

④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800ul；

⑤在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；

⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中的上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；

⑧将得到的沉淀加入1ml浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心5min；

⑨弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μl10×te缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μl10mg/ml的rnasea于37℃水浴1h，去除rna；

⑩将得到的dna提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

indel分子标记的检测：对上述提取的dna进行全基因组indel标记的pcr扩增；pcr扩增体系为：总体积20μl，包括：premixtaq^tm(1.25u/25μltaqdna酶，0.4mm/ldntp，0.3mm/lpcrbuffer)10μl，10μmol/lindel标记正向引物和反向引物总体积各1μl，浓度20～30ng/μl提取的模板dna2μl，ddh2o6μl；

pcr反应条件：94℃5min；94℃45second，55-60℃45second，72℃30second，35个循环；72℃7min；10℃保存；

电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物，点样7μl于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1×tae，电压90v，电流300ma，功率100w，电泳5h，拍照，分析结果；

采用7对indel标记引物对香菇菌株进行pcr扩增，通过dna分子量对照d2000bpdnaladder可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：12(1+2)1(1+2)1(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇l952菌种。

本发明的有益效果

本发明的香菇l952菌种的indel标记指纹图谱可用于l952菌种的鉴别，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3-4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国44个香菇菌种中具有l952菌种的专一性，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为香菇l952菌种indel标记指纹图谱，其中m是d2000bpdnaladder，数字1-7代表的是所用的7对indel标记引物，箭头所指的是香菇l952菌种的特异性indel等位片段组合；

图2为引物lefp_id001在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图3为引物lefp_id002在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图4为引物lefp_id003在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图5为引物lefp_id004在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图6为引物lefp_id005在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图7为引物lefp_id006在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图8为引物lefp_id007在所选44个香菇材料中的扩增图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

marker、premixtaq^tm均购自:takalabio宝日医生物技术有限公司

其余材料和试剂均为普通市售产品。

44个菌株来源：

1、cv108菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；2、香九菌株，来源广东省微生物研究所；3、l7402菌株，来源松阳县食药用菌研究所；4、8404菌株，来源湖北省宜昌森源食用菌有限公司；5、华香5号菌株，来源华中农业大学；6、cv442菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；7、广香菌株，来源广东省微生物研究所；8、l135菌株，来源福建省三明真菌研究所；9、l9319菌株，来源浙江省丽水市大山菇业研究开发有限公司；10、闽丰1号菌株，来源福建省三明真菌研究所；11、森源1号菌株，来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司；12、申香18号菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；13、香如菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；14、申香15号菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；15、cv105菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；16、l241菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；17、香杂26菌株，来源广东省微生物研究所；18、l9608菌株，河南西峡县食用菌科研中心；19、z3244菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；20、申香16号菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；21、华香8号菌株，来源华中农业大学；22、n7菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；23、rbl1菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；24、z3210菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；25、沪香f2菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；26、l241-4菌株，来源浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心；27、l26菌株，来源福建省三明真菌研究所；28、菌兴8号菌株，来源浙江省丽水市食用菌研究开发中心；29、cv501菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；30、苏香菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；31、l952菌株，来源华中农业大学；32、z3239菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；33、z3243菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；34、hk3161菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；35、l212菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；36、l868菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；37、tw1151菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所38、l9105菌株，来源浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心；39、申香12号菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；40、j868菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；41、森源10号菌株，来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司；42、wd4204菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；43、wd5140菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；44、931菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所。

其中7对indel标记引物序列(5′-3′)如下：

lefp_id001正向引物：acggatggagagacacagga

反向引物：tgccccacttactctcaacc

lefp_id002正向引物：cctttctcaaaagcggactg

反向引物：gggagtgggttgtttggata

lefp_id003正向引物：cggatgttatgcactggaag

反向引物：cgtacggttggacatttgaa

lefp_id004正向引物：agcctttcacagtcagctcg

反向引物：gtcaacggagggaaacagag

lefp_id005正向引物：gtagcactcctcatacaacc

反向引物：accaaatgtcacagcacagg

lefp_id006正向引物：acattggcgaaggctgtacg

反向引物：cccttttgccctataaggcg

lefp_id007正向引物：aacagtaacctgtgcactgc

反向引物：catgatcagatcacacagcg。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例1

(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基pda中，23～25℃下避光培养，10d后收集菌丝；

(2)基因组dna的提取：用ctab法提取上述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和纯度，调整样品dna的浓度为20～30ng/ul；

ctab法提取菌丝的基因组dna工艺包括：

①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2ml离心管中，并放入2-3颗钢珠；

②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60hz，时间30s研磨至均匀粉末；

③加入65℃预热1h的2×ctab抽提液，于65℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；

④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800ul；

⑤在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；

⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；

⑧将得到的沉淀加入1ml浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心5min；

⑨弃乙醇，超净工作台中吹干。加入100μl10×te缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μl10mg/ml的rnasea于37℃水浴1h，去除rna；

⑩将得到的dna提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

(3)indel分子标记的检测：对上述提取的dna进行全基因组indel标记的pcr扩增；

pcr扩增体系为：总体积20μl，包括：premixtaq^tm(1.25u/25μltaqdna酶，0.4mm/ldntp，0.3mm/lpcrbuffer)10μl，10μmol/lindel标记正向引物和反向引物总体积各1μl，浓度20～30ng/μl提取的模板dna2μl，ddh2o6μl；

pcr反应条件：94℃5min；94℃45second，55-60℃45second，72℃30second，35个循环；72℃7min；10℃保存；

(4)电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物，点样7μl于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1×tae，电压90v，电流300ma，功率100w，电泳5h，拍照，分析结果；

采用7对indel标记引物分别对香菇菌株进行pcr扩增，通过dna分子量对照d2000bpdnaladder可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，如图1所示，找到符合编号组合为：12(1+2)1(1+2)1(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇l952菌种，图2-8中的编号31即为l952菌种，其条带与图1的一致。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>一种香菇l952菌株的indel标记指纹图谱及其构建方法

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acggatggagagacacagga20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgccccacttactctcaacc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cctttctcaaaagcggactg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gggagtgggttgtttggata20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cggatgttatgcactggaag20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cgtacggttggacatttgaa20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

agcctttcacagtcagctcg20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gtcaacggagggaaacagag20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gtagcactcctcatacaacc20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

accaaatgtcacagcacagg20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

acattggcgaaggctgtacg20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

cccttttgccctataaggcg20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

aacagtaacctgtgcactgc20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

catgatcagatcacacagcg20