GLUD1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法及其应用与流程

glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法及其应用。


背景技术：

2.天性高胰岛素血症(congenital hyperinsulinism，chi)主要是由编码胰岛β细胞功能的基因突变引起的疾病，也称为婴儿持续性高胰岛素血症性低血糖症。先天性高胰岛素血症难以治愈，很容易引起年幼婴儿低血糖症，其特点是顽固的低血糖及与血糖水平不相称的相对高胰岛素血症同时伴有低酮体低脂血症，年龄越小低血糖的危害越大，特别是低血糖造成的脑功能损害。新生儿低血糖是威胁新生儿健康甚至生命的严重疾病，反复发作的严重低血糖不仅威胁生命也能造成永久且不可逆的脑功能伤害，终身致残，给家庭和社会都带来严重的伤害和负担。
3.glud1(glutamate dehydrogenase 1)基因位于人类染色体10q23.3能够编码谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)，该蛋白在线粒体中以六聚体形式存在。谷氨酸脱氢酶是氨基酸代谢的关键酶，gdh获得功能突变是新生儿低血糖的一个亚型，gdh的突变位点如果干扰了对内源性抑制物的敏感性，就会表现出功能的增强。gdh在胰岛β细胞的功能增强直接导致胰岛素的不恰当分泌，进而导致胰岛素释放过量以及低血糖症。
4.谷氨酸脱氢酶(gdh)是催化谷氨酸氧化脱氨或其逆反应的一类不需氧脱氢酶。在生物体内存在广泛，是体内催化l-氨基酸脱去氨基反应中能力最强的一种酶，在氨基酸的联合脱氨作用中起重要作用。在不同的生物细胞或细胞器内，辅酶可能不同，或nad+，或nadp+。是一种变构酶，活性受细胞内atp、adp、gtp、gdp、nadh+h+、nad+等所调节。引起高胰岛素血症的主要是谷氨酸脱氢酶(gdh)中的氨基酸错义突变，这种突变有损酶抑制作用的敏感性，特别是对gtp的抑制作用敏感性降低。最终使得谷氨酸脱氢酶活性不能关闭，进而导致胰岛素释放过量以及低血糖症。谷氨酸脱氢酶(gdh)是谷氨酸进入三羧酸循环产生atp的关键酶，gdh获得功能突变除了引起低血糖外，还有高氨血症，癫痫、学习能力下降、智商受损、脑发育异常等，可以造成多器官和系统的损害。编码gdh的glud1基因突变位点多位于gtp结合位点附近，突变干扰了gtp和gdh的结合，从而引起突变蛋白对gtp抑制作用的敏感性降低。哺乳动物的gdh在辅酶、adp激活和gtp抑制方面表现出负协同性，gdh获得功能突变会引发高胰岛素血症/高氨血症综合征(hhs)，导致胰腺β细胞对亮氨酸的反应性增加，在高蛋白饮食后易发生低血糖。
5.规律成簇间隔短回文重复序列(crispr/cas9)技术是一种细胞和模拟生物中有效的基因编辑技术。cas9(crispr associated nuclease)是crispr相关核酸酶，crispr/cas9就是在rna指导下，利用cas9核酸酶对靶向基因进行编辑。cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割dna两条单链。cas9首先与crrna及tracrrna结合成复合物，然后通过pam序列结合并入侵dna，形成rna-dna复合结构，进而对目的dna双链进行切割，使dna双链断裂。crispr-cas9基因敲入系统是cas9内切酶切割双链dna，且有一段高度同源的dna修复模
板存在的情况下，生物体内启动hdr修复路径，将一段外源dna定点插入基因内部。
6.crispr/cas9技术是继锌指核酸酶(zfn)、es细胞打靶和talen等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。crispr-cas9技术在生物工程和生物医学方面有广泛的应用。可以快速建立基因突变的动物模型和细胞模型，用于探究遗传变异与疾病之间的关系；可以用于新作物的培育中，解决抗极端环境、病虫害等问题等。
7.然而，在现有的基因敲入小鼠库中尚未发现有glud1突变基因敲入小鼠及相关低血糖、高血氨、先天性高胰岛素血症的研究。
8.基于以上，本发明人利用crispr/cas9技术构建glud1突变基因敲入小鼠动物模型，为低血糖、高血氨、先天性高胰岛素血症的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。


技术实现要素：

9.本发明的主要目的在于：针对上述问题，提供一种利用crispr/cas9技术构建glud1突变基因敲入小鼠动物模型的方法和应用，为低血糖、高血氨、先天性高胰岛素血症的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物数据。
10.本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
11.本发明一方面提供了一种glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，该方法为通过采用crispr/cas9技术构建glud1突变基因敲入小鼠动物模型，所述方法包括以下步骤：
12.(1)确定glud1突变基因的特异性靶位点，通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和sgrna；
13.(2)构建同源重组载体(donor vector)；
14.(3)将cas9 mrna、donor vector以及体外活性合格的sgrna混合均匀，显微注射到供体小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到受体小鼠中孕育，繁育子代即得。
15.前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤(1)中所述体外活性合格的sgrna其碱基序列如seq id no：1所示。
16.前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤(2)中所述donor vector的碱基序列如seq id no：2所示。
17.前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤(3)包括以下步骤：
18.a.将经体外培养后存活的受精卵移植到受体小鼠体内，繁育获得f0代小鼠，经pcr扩增鉴定，获得阳性f0代小鼠；
19.b.将阳性f0代小鼠与野生型异性小鼠交配，繁育获得f1代小鼠，经pcr扩增鉴定，获得f1代杂合子小鼠；
20.c.将f1代杂合子小鼠杂交，繁育获得f2代小鼠，经pcr扩增鉴定，获得阳性f2代纯合子小鼠，即为glud1突变基因敲入小鼠。
21.前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤a中所述pcr扩增鉴定的检测引物为glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1引物对，所述引物glud1-ki-3tf1的
序列如seq id no：3所示，所述引物glud1-ki-3tr1的序列如seq id no：4所示。
22.前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤a中所述pcr扩增鉴定中反应体系为：
[0023][0024]
反应条件：
[0025][0026]
前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤a中所述阳性f0代小鼠glud1突变基因增加了2.3kb个碱基，其碱基序列如seq id no.7所示。
[0027]
前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤b和c中所述pcr扩增鉴定的检测引物为glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1和glud1-wt-tf1+glud1-wt-tr1两对引物对，所述引物glud1-ki-3tf1的序列如seq id no：3所示，所述引物glud1-ki-3tr1的序列如seq id no：4所示，所述引物glud1-wt-tf1的序列如seq id no：5所示，所述引物glud1-wt-tr1的序列如seq id no：6所示。
[0028]
前述的glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其中，所述步骤b和c中所述pcr扩增鉴定中反应体系为：
[0029][0030]
反应条件：
[0031][0032][0033]
本发明的目的及解决其技术问题还可以通过采用以下技术方案来实现。
[0034]
本发明的另一方面还提供了一种glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法得到的glud1突变基因敲入小鼠动物模型在制备检测/治疗高血氨症伴有先天性高胰岛素血症药物中的应用。
[0035]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明涉及一种基于crispr/cas9技术构建人glud1突变基因(c.1532c
→
t，p.h454y)全身敲入小鼠动物模型，为氨基酸分解代谢、低血糖、高血氨、先天性高胰岛素血症及glud1基因对脑功能影响的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型，具有良好的医学临床应用前景，以及较大的社会效益。本发明首次构建成功glud1突变基因敲入小鼠，可为氨基酸分解代谢的调节、高血氨症伴有先天性高胰岛素血症及gdh对脑功能影响的相关研究提供新的研究手段及方向。
[0036]
综上所述，本发明特殊的glud1突变基因敲入小鼠动物模型，可为高血氨症伴有先天性高胰岛素地血症的相关研究提供新的研究方向。其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在方法上或功能上
皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有的方法具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
[0037]
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并结合附图详细说明如后。
附图说明
[0038]
图1：crispr/cas9-ki小鼠构建流程；
[0039]
图2：基因敲入序列；
[0040]
图3：鉴定引物设计原理；
[0041]
图4：f1代glud1基因突变敲入小鼠pcr结果鉴定电泳图；
[0042]
图5：f1代glud1基因突变敲入小鼠基因部分测序结果；
[0043]
图6：f2代小鼠pcr检测结果；
[0044]
图7：glud1基因突变小鼠和wt小鼠肝脏gdh酶活性变化；
[0045]
图8：glud1基因突变小鼠和wt小鼠肾脏gdh酶活性变化；
[0046]
图9：glud1基因突变小鼠和wt小鼠血氨变化；
[0047]
图10：glud1基因突变小鼠和wt小鼠血糖变化；
[0048]
图11：本发明所构建的glud1基因突变载体质粒图谱。
具体实施方式
[0049]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0050]
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0051]
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0052]
实施例1 cas9/grna靶点设计及体外cas9酶切活性检测
[0053]
(一)实验动物
[0054]
6周龄健康的c57bl/6型小鼠(体重在18
±
2g)，雌雄各100只，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，经隔离饲养两周后即可达到实验要求的8周龄；6～8周龄健康的b6d2f1小鼠60只，雌雄各半，体重在24
±
2g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，小鼠均在spf级环境下喂养，严格按照动物饲养环境管理规定，保证每天温度在22℃，湿度40％～60％，动物房内光照时间和黑暗时间各半，动物实验所有相关操作处理严格遵循实验动物相关管理条例。
[0055]
(二)实验试剂
[0056]
cas9 nuclease(neb美国)；taq dna polymerase(mg2+plus buffer)(vazyme中国)；dna纯化回收试剂盒(天津tiangen中国)；注射用cas9 mrna(北京百奥生物中国)；t7 ultra试剂盒(invitrogen)；短链rna纯化试剂盒(invitrogen美国)；孕马血清(pmsg)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)(宁波第二激素厂中国)；ksom培养液(millipore美国)；透明质酸酶、m2培养基(sigma美国)；小鼠基因组dna提取试剂盒(天津tiangen中国)；水合氯醛(浙江嘉之源中国)。
[0057]
(三)构建方法，包括下列步骤：
[0058]
通过genbank中可知glud1突变基因相关信息如表1所示：
[0059]
表1 glud1基因突变位点信息
[0060]
突变基因核苷酸变异氨基酸变异glud1c.1532c
→
tp.h454y
[0061]
利用genbank中glud1突变基因相关信息和crispr/cas9的grna靶点设计分析网站，设计了针对glud1突变基因的sgrna靶点序列，利用crispr-cas9体外酶切反应对靶点序列进行了体外活性检测，根据cas9/grna的活性结果及靶点位置，本实施例最终筛选出较高活性的sgrna序列如seq id no：1所示，见表2。通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和sgrna，并用该序列对进行后续试验。
[0062]
表2 sgrna序列信息
[0063]
sgrna名称sgrna序列(5
’→3’
)pamgps00000897-glud1-s1gcagcgcttcgcccagacgg(seq id no：1)cgg
[0064]
sgrna体外转录：根据靶序列设计sgrna，构建体外转录载体puc57-sgrna，将其扩大培养后提取质粒，经dra
ꢀⅰ
酶切后进行胶回收。以回收产物作为模板，用t7 rna聚合酶完成体外转录，并对产物进行胶回收纯化，最终通过乙醇沉淀浓缩产物至200ng/μl。
[0065]
cas9体外转录：使用dna提取试剂盒提取cas9表达载体，经xbaⅰ酶切后进行胶回收。以回收产物为模板，用t7 rna聚合酶完成体外转录，并对产物进行5’加帽、3’加尾，使之成为成熟的mrna。利用rna纯化试剂盒对体外转录产物进行纯化，最终通过乙醇沉淀浓缩产物至200ng/μl。
[0066]
按照t7体外转录试剂盒进行转录，反应体系：
[0067][0068]
将体系混匀后，在37℃水浴锅内反应4-6h，然后利用天根生化科技有限公司的dna纯化回收试剂盒进行胶回收。
[0069]
实施例2 donor vector的构建
[0070]
通过in-fusing cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)。其中，所构建得到的donor vector的碱基序列信息如seq id no：2所示。
[0071]
seq id no：2
[0072]
gatttgccccgcgcctcttcggcttcggcgcggcgtcactctccggccggccgcgcagcggatccgcacaccgttccggcccaaggcggaaaggaggggcctggtgactcatgcggccggggctgctggccagccagcgaggcctccctgcagtccgcttccacctcccaggccgccgcgcgtgcacacgggaccgaccttccgggccgcggccgcgtccgaccgctctcaggagcccaggcctccgggccgcagcccgcgcgcgtccacgctagccccgcccccgcccgcgagcatgcgcaccaagcccatctgcaaaggcgcgccccccgccgccgcagccgcacgcgccgccgcctggaggccgggcaaggccgcggcggaggcgaggcccagcgccctgggcggcgcgcggccgccgaagtccgtcctcccggtggggcgacaagcggcgcaggggaggggacagccagacaagcaggaagccgcggcttaaaagggcagctcgcgcccagcccttcctccccgcggtccaggcctgcgagctccggtctttacagctcccgccgcactcgcctcagcccgccgccgccgccatgtaccgctacctgggcgaagcgctgttgctgtcccgggccgggcccgctgccctgggctcggcgtccgccgactcggccgcgttgctgggctgggcccggggacagcccgccgccgccccgcagccggggctggcattggccgcccggcgccactacagcgaggcggtggccgaccgcgaggacgaccccaacttcttcaagatggtggagggcttcttcgatcgcggcgccagcatcgtggaggacaagctggtggaggacctgaggacccgggagagcgaggagcagaagcggaaccgggtgcgcggcatcctgcggatcatcaagccctgcaaccatgtgctgagtctctccttccccatccggcgcgacgacggctcctgggaggtcatcgaaggctaccgggcccagcacagccagcaccgcacgccctgcaagggaggtatccgttacagcactgatgtgagtgtagatgaagtaaaagctttggcttctctgatgacatacaagtgtgcagtggttgatgtgccgtttgggggtgctaaagctggtgttaagatcaatcccaagaactatactgataatgaattggaaaagatcacaaggaggttcaccatggagctagcaaaaaagggctttattggtcctggcattgatgtgcctgctccagacatgagcacaggtgagcgggagatgtcctggatcgctgatacctatgccagcaccatagggcactatgatattaatgcacacgcctgtgttactggtaaacccatcagccaagggggaatccatggacgcatctctgctactggccgtggtgtcttccatgggattgaaaatttcatcaatgaagcttcttacatgagcattttaggaatgacaccagggtttggagataaaacatttgttg
ttcagggatttggtaatgtgggcctacactctatgagatatttacatcgttttggtgctaaatgtattgctgttggtgagtctgatgggagtatatggaatccagatggtattgacccaaaggaactggaagacttcaaattgcaacatgggtccattctgggcttccccaaggcaaagccctatgaaggaagcatcttggaggccgactgtgacatactgatcccagctgccagtgagaagcagttgaccaaatccaacgcacccagagtcaaagccaagatcattgctgaaggtgccaatgggccaacaactccagaagctgacaagatcttcctggagagaaacattatggttattccagatctctacttgaatgctggaggagtgacagtatcttactttgagtggctgaagaatctaaatcatgtcagctatggccgtttgaccttcaaatatgaaagggattctaactaccacttgctcatgtctgttcaagagagtttagaaagaaaatttggaaagcatggtggaactattcccattgtacccacggcagagttccaagacaggatatcgggtgcatctgagaaagacatcgtgtactctggcttggcatacacaatggagcgttctgccaggcaaattatgcgcacagccatgaagtataacctgggattggacctgagaacagctgcctatgttaatgccattgagaaagtcttcaaagtgtacaatgaagctggtgtgaccttcacatagactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatccctcgacctgcagtgtcctccctcccctccagactcccgtagcccgggccgctactcggcccagcccagttctgcaggccgtgccccgcttcgggctcccccgcctcgggtgtggcagccttagaggatactgattttttttttccgccctaaaactaccacgtaatatgccagcctttttactgggcaagtcttcaccccaagcctctgcttgtgttgatgctgacttcactgaggacactgtacagcttttctttagcctcggtgcctgtcatgtcatagaccgtgaacccttaacgccagcagccgacgatacaagaacagagaaaaattatcttctttttggagttggaatcttgaaagtttgattaaccagcgcagct。
[0073]
实施例3显微注射
[0074]
(1)组分配制：按照表3进行显微注射组分的配制，将配制好的组分进行4℃高速离心，10min后取出15μl进行后续显微注射实验。
[0075]
表3显微注射各组分的浓度及用量
[0076]
组分浓度用量cas9 mrna200ng/μl5μldonor vector200ng/μl5μlsgrna200ng/μl5μladd rnase-free h2o to40μl25μl
[0077]
(2)胚胎供体小鼠的排卵处理
[0078]
准备8周龄且身体健康的c57bl/6j雌鼠、激素孕马血清促性腺激素(pmsg)和人绒毛膜促性腺激素(hcg)。在下午14:30进行pmsg注射，每只雌鼠注射pmsg的浓度为10个单位(10iu/ml)，剂量为0.2ml。间隔46-48小时，再进行hcg注射，每只雌鼠注射hcg的浓度为10个单位，剂量为0.2ml。然后将注射后的雌鼠和雄鼠进行合笼交配。
[0079]
(3)胚胎获取及体外培养
[0080]
准备胚胎培养基，置于37℃、co2浓度为5％的培养箱中。将见栓老鼠处以安乐死后，将其腹腔抛开，用剪刀将输卵管剪下，置于胚胎培养基中。在一个平皿上准备3个100ul
的胚胎培养基液滴，放置在显微镜载物台上，再用尖镊将放置在液滴中的输卵管划破，然后将卵团取出。用透明质酸酶进行消化，去除多余颗粒细胞，将卵清洗干净后放在液体培养基中进行培养。
[0081]
(4)显微注射
[0082]
显微注射采用narishige nt-88-v3显微操作系统，具体操作步骤见说明书。用吸卵针吸取受精卵于m2培养基中，并区分可用和不可用受精卵。将固定针、注射针固定于显微操作操作仪的机械臂上，使用固定针固定一个受精卵，将注射针扎入细胞质或者原核部位，将注射后的受精卵进行体外培养，筛选存活的受精卵用作后续实验。
[0083]
实施例4胚胎移植
[0084]
(1)受体小鼠准备
[0085]
选取c57bl/6j品系的7-10周龄雌鼠作为受体。
[0086]
(2)胚胎移植
[0087]
将受体雌鼠根据体重腹腔注射麻药，放在一个干净盒子中，等其麻醉。取一个培养皿，用移液枪在培养皿中点上四个干净的m2液(m2培养液)滴。用移植针将胚胎从培养盘滴中转移到干净的m2滴中，更换干净的移植针后，将胚胎在剩余三个干净的m2液滴中清洗。判断小鼠是否进入麻醉状态，若进入麻醉状态即可开始进行手术，反之依据情况补打麻药。用婴儿理发器除去小鼠两侧脊部偏下方毛发，并用70％的酒精进行消毒。用移植针吸取m2(可分为三段)，在前端做两个气泡后吸入胚胎，然后在胚胎前端再做一个气泡，吸好后将移植针放在一旁备用。在脊腰中央纵向处剪开皮肤，开口约为0.7cm，用直剪对皮肤做钝性分离，见到肌肉层，透过肌肉层可见白色脂肪垫位于脊柱两侧约1cm处，剪开肌肉层见到脂肪垫，将脂肪垫用直镊轻轻提起，用脂肪夹夹住脂肪向左旋转。在显微镜下观察输卵管，观察到在输卵管上有一段膨大部为壶腹部，移植剪口位置在壶腹部后方的第一个拐弯处，用尖镊轻轻提起输卵管，显微剪轻轻在拐弯处剪一个口，将吸好胚胎的移植针轻轻从剪口处插入，将胚胎慢慢吹入壶腹部。将脂肪夹松开，把输卵管和卵巢重新放回受体雌鼠体内。缝合皮肤和肌肉层，放入准备好的鼠盒内，送到动物饲养间进行喂养。移植后的小鼠预计20天后出生f0代。
[0088]
实施例5 glud1小鼠繁育路线及其基因型鉴定
[0089]
(1)小鼠繁育路线
[0090]
对f0代小鼠的出生日期、出生只数、性别等进行记录，用耳标对其进行标记。待基因型正确的f0代小鼠性成熟后，与野生型异性c57bl/6j小鼠交配，繁殖得到f1代小鼠，记录f1代小鼠相关信息，用耳标对其进行标记。待基因型正确的f1代小鼠性成熟后，在f2代小鼠之间进行交配，繁殖得到f2代小鼠。
[0091]
(2)小鼠基因型鉴定
[0092]
采用directmouse genotyping kit(apexbio，货号：k1025)对小鼠基因组进行提取，并将dna保存至-20℃冰箱中。
[0093]
在小鼠出生2周后剪其鼠尾，收集鼠尾，并做好标记，将小鼠尾巴(～2mm)置于75μl裂解缓冲液和0.75μl蛋白酶k溶液中消化，56℃下孵育15min。然后，将混合溶液在95℃孵育10min至1h(未溶解的组织不干扰pcr)。加热后，将样品冷却至4℃，并向每个样品添加75μl平衡缓冲液。每20μl pcr体系使用1μl的制备溶液作为模板。
[0094]
(3)f0代小鼠基因型鉴定
[0095]
采用pcr扩增鉴定f0代小鼠基因，所设计的引物为glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1引物对，所述引物glud1-ki-3tf1的序列如seq id no：3所示，所述引物glud1-ki-3tr1的序列如seq id no：4所示：
[0096]
seq id no：3 5
’-
atccaacgcacccagagtcaaag-3’正向引物
[0097]
seq id no：4 5
’-
aggcagacaaaggtctagtcctgc-3’反向引物
[0098]
按照表4所示的pcr反应体系及表5所示的pcr反应条件进行小鼠基因型鉴定，筛选出阳性f0代小鼠。
[0099]
表4 f0代小鼠基因型鉴定的pcr反应体系
[0100]
反应组分体积(μl)2x taq master mix，dye plus，12.5ddh2o9.5primer f(10μm)1primer r(10μm)1template dna1total25
[0101]
表5 f0代小鼠基因型鉴定的pcr反应条件
[0102]
步骤温度(℃)时间备注1955min 29530s 36430s 4721min重复步骤2-4，25个循环57210min 616hold [0103]
检测结果如图2所示，可知得到的f0代阳性小鼠gdh基因增加了2.3kb个碱基，其碱基序列如seq id no：7所示。
[0104]
seq id no：7
[0105]
atgtaccgctacctgggcgaagcgctgttgctgtcccgggccgggcccgctgccctgggctcggcgtccgccgactcggccgcgttgctgggctgggcccggggacagcccgccgccgccccgcagccggggctggcattggccgcccggcgccactacagcgaggcggtggccgaccgcgaggacgaccccaacttcttcaagatggtggagggcttcttcgatcgcggcgccagcatcgtggaggacaagctggtggaggacctgaggacccgggagagcgaggagcagaagcggaaccgggtgcgcggcatcctgcggatcatcaagccctgcaaccatgtgctgagtctctccttccccatccggcgcgacgacggctcctgggaggtcatcgaaggctaccgggcccagcacagccagcaccgcacgccctgcaagggaggtatccgttacagcactgatgtgagtgtagatgaagtaaaagctttggcttctctgatgacatacaagtgtgcagtggttgatgtgccgtttgggggtgctaaagctggtgttaagatcaatcccaagaactatactgataatgaattggaaaagatcacaaggaggttcaccatggagctagcaaaaaagggctttattggtcctggcattgatgtgcctgctccagacatgagcacaggtgagcgggagatgtcctggatcgctgatacctatgccagcaccatagggcactatgatattaatgcacacgcctgtgttactggtaaacccatcagccaagggggaatccatggacgcatctctgctactggccgtggtgtcttccatgggattgaaaatttcatcaatgaagcttcttacatgagcattttaggaatgacaccagggtttggagata
aaacatttgttgttcagggatttggtaatgtgggcctacactctatgagatatttacatcgttttggtgctaaatgtattgctgttggtgagtctgatgggagtatatggaatccagatggtattgacccaaaggaactggaagacttcaaattgcaacatgggtccattctgggcttccccaaggcaaagccctatgaaggaagcatcttggaggccgactgtgacatactgatcccagctgccagtgagaagcagttgaccaaatccaacgcacccagagtcaaagccaagatcattgctgaaggtgccaatgggccaacaactccagaagctgacaagatcttcctggagagaaacattatggttattccagatctctacttgaatgctggaggagtgacagtatcttactttgagtggctgaagaatctaaatcatgtcagctatggccgtttgaccttcaaatatgaaagggattctaactaccacttgctcatgtctgttcaagagagtttagaaagaaaatttggaaagcatggtggaactattcccattgtacccacggcagagttccaagacaggatatcgggtgcatctgagaaagacatcgtgtactctggcttggcatacacaatggagcgttctgccaggcaaattatgcgcacagccatgaagtataacctgggattggacctgagaacagctgcctatgttaatgccattgagaaagtcttcaaagtgtacaatgaagctggtgtgaccttcacatagactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatccctcgacctgcag。
[0106]
(4)f1代小鼠基因型鉴定
[0107]
f1代小鼠基因型判断标准如表6所示。
[0108]
表6 f1代小鼠基因型鉴定方法
[0109] glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1glud1-wt-tf1+glud1-wt-tr1纯合子2098bp无产物杂合子2098bp422bpwt(野生型)无产物422bp
[0110]
采用pcr扩增鉴定f1代小鼠基因，所设计的引物为glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1和glud1-wt-tf1+glud1-wt-tr1两对引物对，所述引物glud1-ki-3tf1的序列如seq id no：3所示，所述引物glud1-ki-3tr1的序列如seq id no：4所示，所述引物glud1-wt-tf1的序列如seq id no：5所示，所述引物glud1-wt-tr1的序列如seq id no：6所示。
[0111]
seq id no：3 5
’-
atccaacgcacccagagtcaaag-3’正向引物
[0112]
seq id no：4 5
’-
aggcagacaaaggtctagtcctgc-3’反向引物
[0113]
seq id no：5 5
’-
tgcaaccatgtgttgagcctc-3’正向引物
[0114]
seq id no：6 5
’-
gcgttaagggttcacggtctatg-3’反向引物
[0115]
具体如表7所示：
[0116]
表7引物序列信息
[0117][0118]
按照表8所示的pcr反应体系及表9所示的pcr反应条件进行小鼠基因型鉴定，筛选出f1代杂合子小鼠。
[0119]
表8 f1代小鼠基因型鉴定的pcr反应体系
[0120]
反应组分体积(μl)2xtaq master mix，dye plus，12.5ddh2o9.5primer f(10μm)1primer r(10μm)1template dna1total25
[0121]
表9 f1代小鼠基因型鉴定的pcr反应条件
[0122]
步骤温度(℃)时间备注1955min 29530s 36430s 4721min重复步骤2-4，25个循环57210min 616hold [0123]
对所得的f1代小鼠用引物glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1和glud1-wt-tf1+glud1-wt-tr1进行pcr检测，结果参见图4。由图4可知，野生型小鼠只会在422bp位置产生条带，纯合子小鼠只出现2098bp大小的条带，杂合子两种条带都能产生，因此，编号85、87、88的f1代小鼠为纯合子，而编号84、86、89～93的f1代小鼠为杂合型。其中，p代表阳性对照，b6为阴性对照，n为空白对照。
[0124]
(5)f2代小鼠基因型鉴定
[0125]
f2代小鼠基因型判断标准如上述表6所示。
[0126]
采用pcr扩增鉴定f2代小鼠基因，所设计的引物为glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1和glud1-wt-tf1+glud1-wt-tr1两对引物对，所述引物glud1-ki-3tf1的序列如seq id no：3所示，所述引物glud1-ki-3tr1的序列如seq id no：4所示，所述引物glud1-wt-tf1的序列如seq id no：5所示，所述引物glud1-wt-tr1的序列如seq id no：6所示。
[0127]
seq id no：3 5
’-
atccaacgcacccagagtcaaag-3’正向引物
[0128]
seq id no：4 5
’-
aggcagacaaaggtctagtcctgc-3’反向引物
[0129]
seq id no：5 5
’-
tgcaaccatgtgttgagcctc-3’正向引物
[0130]
seq id no：6 5
’-
gcgttaagggttcacggtctatg-3’反向引物
[0131]
按照上述表8所示的pcr反应体系及上述表9所示的pcr反应条件进行小鼠基因型鉴定，筛选出f2代纯合子小鼠。
[0132]
用引物glud1-ki-3tf1+glud1-ki-3tr1和glud1-wt-tf1+glud1-wt-tr1进行pcr检测，结果参见图6。由图6可知，17～32和47～51均为纯合子小鼠，即为glud1突变基因敲入小鼠动物模型。
[0133]
实施例6glud1基因突变小鼠脏器gdh酶活性变化
[0134]
所需溶液配制方法如下：
[0135]
均质缓冲液：5mm磷酸氢二钠，5mm磷酸氢二钾，1mm edta，1％tritonx-100；
[0136]
测定缓冲液：10mm tris-醋酸盐，0.01mm edta；
[0137]
预混液：10mg的nadh溶于6.4ml nh4cl后，进行4倍稀释。
[0138]
具体操作如下：
[0139]
(1)摘取glud1突变基因h454y敲入小鼠和野生型b6小鼠的肝脏和肾脏，用于检测gdh酶活性变化；
[0140]
(2)分别向脏器中加入200μl均质缓冲液，在冰中匀浆，均质后冰上静置15-30min，4℃，10000rpm/min，离心5分钟；
[0141]
(3)将1μl上清液加入到19μl 0.9％nacl中，通过bradford测定法测定蛋白质浓度；
[0142]
(4)向384孔板(黑色且底部透明)内加入总体积为25μl的溶液，其中包括：5μl25mm alpha-kg，5μl预混液，5μl从5mm经分析缓冲液倍比稀释16次的鸟苷三磷酸(gtp)，5μl分析缓冲液和5μl终浓度为0.3μg/μl的样品蛋白，于波长为340nm处检测其吸光度，做多次动态监测，检测时间总长度为5分钟。结果如图7和8所示。
[0143]
由图7和8的结果可以看出，在对肝脏和肾脏的gdh酶活性检测结果可看出，随着gtp浓度的增加，gdh酶活性均成下降趋势，但是与野生型b6小鼠肝脏和肾脏的gdh酶活性相比，本发明构建的glud1突变基因h454y敲入小鼠的gdh酶活性变化在前期(gtp浓度为《1μm左右)比较稳定，而野生型b6小鼠肝脏和肾脏的gdh酶活性下降明显，在gtp浓度为＞1μm后，本发明构建的glud1突变基因h454y敲入小鼠的gdh酶活性下降明显，最后二者活性趋于相同的水平。
[0144]
上述结果提示，p.h454y敲入小鼠模型的肝脏及肾脏组织对gtp抑制作用的敏感性严重受损，符合p.h454y突变gdh的特点，说明小鼠模型的构建是成功的。
[0145]
实施例7 glud1基因突变小鼠血糖血氨变化
[0146]
将glud1基因突变小鼠和野生型b6小鼠断食，分别检测0h、2h、4h、6h后的血糖血氨变化，具体操作方法如下：
[0147]
(1)将glud1基因突变小鼠和野生型b6小鼠分组排序，于不同时间段用毛细管尾部采血，注意：全血有被引发感染的病原微生物污染的可能，采血前用酒精擦拭小鼠尾部，再用蒸馏水冲洗，擦净液滴后采血，避免影响实验结果。
[0148]
(2)用快速血糖仪和血氨分析仪对收集血样进行检测。检测结果如图9和10所示。
[0149]
由图9和10的结果可以看出，glud1基因突变小鼠和野生型b6小鼠血氨含量均随着时间呈下降趋势，均于断食2h后趋于稳定状态。glud1基因突变小鼠的血液中血氨含量明显高于野生型b6小鼠的血液中血氨的含量。glud1基因突变小鼠和野生型b6小鼠血糖含量均
随着时间呈下降趋势，断食8h时，glud1基因突变小鼠的血糖含量明显低于野生型b6小鼠的血糖含量，具有显著性差异。
[0150]
由图7-10的结果可以看出，根据本发明的方法成功构建了glud1突变基因敲入小鼠模型，该类小鼠模型及其构建方法可为高血氨症伴有先天性高胰岛素地血症的相关研究提供新的研究方向。
[0151]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。