三维细胞培养支架及其制备方法和用途与流程

本公开涉及制备三维细胞培养支架的方法。本公开还涉及通过所述方法获得的三维细胞培养支架。本公开还涉及三维细胞培养方法。本公开还涉及通过所述的三维细胞培养方法而获得的细胞培养物。本公开还涉及血浆与促进血浆凝固的试剂的组合用于制备三维细胞培养支架的用途。本公开还涉及血浆作为制备三维细胞培养支架的基础原料的用途。

背景技术：

三维细胞培养可以促进细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用，改善细胞局部的微环境，较好模拟了体内的生理环境，在新药研发、干细胞研究以及肿瘤研究等领域具有广泛的应用前景。支架是实现细胞三维培养最常用的手段之一，其主要作用是为细胞粘附、迁移、增殖、分化提供支持物，其次也作为细胞生长所需可溶性因子的扩散介质。因此，体外三维细胞培养支架一般具有以下特性：(1)与细胞具有较好的生物相容性；(2)高度多孔结构，利于细胞附着、渗透和扩散以及营养物质和代谢产物的交换；(3)合适的力学强度；(4)较好的生物降解性。

技术实现要素：

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种制备三维细胞培养支架的方法，该方法包括：将血浆与促进血浆凝固的试剂混合。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种通过本公开的制备三维细胞培养支架的方法而获得的三维细胞培养支架。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种三维细胞培养方法，该方法包括以下步骤：

1)将血浆与促进血浆凝固的试剂混合；

2)将通过步骤1)获得的混合物加入到细胞培养容器中；

3)待该混合物凝固后，在其上方加入细胞悬液。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种三维细胞培养方法，该方法包括以下步骤：

1)将细胞与血浆以及促进血浆凝固的试剂混合；

2)将通过步骤1)获得的混合物加入到细胞培养容器中；

3)待该混合物凝固后，在其上方加入细胞培养液。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种通过本公开的三维细胞培养方法而获得的细胞培养物。

根据本公开的一种实施方式，可以提供血浆与促进血浆凝固的试剂的组合用于制备三维细胞培养支架的用途。

根据本公开的一种实施方式，可以提供血浆作为制备三维细胞培养支架的基础原料的用途。

附图说明

图1示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行细胞的支架外培养的示意图；

图2示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行细胞的支架内培养的示意图；

图3示出了利用马血浆制备的三维细胞培养支架在光学显微镜下的结构；

图4示出了利用肿瘤患者来源血浆制备的三维细胞培养支架在光学显微镜下的结构；

图5示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行原代肿瘤细胞的支架外培养所形成的培养物；

图6示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行原代肿瘤细胞的支架内培养所形成的培养物；

图7示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行人肝癌hepg2细胞的支架外培养所形成的培养物；

图8示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行人肝癌hepg2细胞的支架内培养所形成的培养物。

具体实施方式

除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示含量、浓度、比例、质量、体积、时间、温度、大小、技术效果等的所有数字在任何情况下均应理解为由术语“约”或“大致”修饰。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中列出的数字参数是近似值。对于本领域技术人员来说，其可以根据通过本公开寻求获得的期望性质和效果而变化，应根据有效数字位数和常规舍入方法或者本领域技术人员理解的方式来解释每个数值参数。

尽管阐述了本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是尽可能精确地提供了在具体实施例中阐述的数值。然而，任何数值都会固有地包含某些误差，这些误差由于在其相应的测试测量中发现的标准偏差而必然地导致的。本说明书给出的每个数值范围将包括落入该较宽数值范围内的每个较窄数值范围，就如同这些较窄数值范围均在本文中明确写出一样。

常见的三维细胞培养支架分为三种：天然细胞外基质支架、天然材料支架和合成材料支架。天然细胞外基质支架是通过人或动物组织器官脱细胞后得到的天然支架，与天然组织具有极高的结构相似性；但可用的天然组织较少，组织结构的复杂性和质量的难以控制限制了该技术的运用。天然材料支架包括动物胶原蛋白及其基底膜提取物、海藻中提取的藻酸盐以及从蟹壳和虾壳中提取的壳聚糖等；天然材料支架来源易于获得，均一性较好，但其自身复杂的生化反应和来源不明确等属性也是限制其应用的主要因素。合成材料支架包括由聚乳酸羟基乙酸、聚l-乳酸和聚已内脂等合成材料制备的支架，具有良好的可控性和降解性，精良的组成成分和物理特性，无免疫方面的问题；但缺点是器官特异性结构和细胞类型特异性的相对缺乏，需要对材料进行生物修饰以整合结合肽、生长因子的结合位点。

基于以上原因，迫切需要开发一种价格低廉、来源易得、操作简便、生物相容性好且能较好模拟体内微环境的三维细胞培养支架材料。

血浆是全血经抗凝处理后，通过离心沉淀所获得的不含细胞成分的液体，是机体内环境的重要组成部分，含有细胞生长所需的各种细胞因子和生长因子等营养成分。血浆中还含有凝血酶、凝血因子和纤维蛋白原等多种参与凝血过程的物质。目前血浆在生物医药领域存在广泛的应用，例如用于制备疫苗、用于生产白蛋白、用于生产丙种球蛋白、用于生产凝血酶原复合物等，但还没有利用血浆来制备三维细胞培养支架的技术。

本公开的发明人创造性地发现，通过在动物或人的血浆中加入适量浓度的促进血浆凝固的试剂，能够获得非常适合用作三维细胞培养支架的材料。通过这种方法得到的三维细胞培养支架价格低廉、来源易得、操作简便、生物相容性好且能较好模拟体内微环境。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种制备三维细胞培养支架的方法，所述方法包括：将血浆与促进血浆凝固的试剂混合。

在本文中使用时，“血浆”可以是动物来源血浆、正常人来源血浆或患者来源血浆。血浆可以通过本领域技术人员公知的实验操作来制备，例如，用以枸橼酸钠或乙二胺四乙酸作为抗凝剂的采血管抽取一定量人或动物的静脉血，将采血管立即颠倒混匀后离心，收集血浆。

在本文中使用时，“促进血浆凝固的试剂”指的是任何能够促进血浆凝固的物质，包括但不限于含有游离钙离子的溶液、凝血因子、凝血酶、凝血酶原、纤维蛋白、纤维蛋白原。优选地，“促进血浆凝固的试剂”为含有游离钙离子的溶液。

在本文中使用时，“含有游离钙离子的溶液”指的是其中存在离子钙的任何溶液，包括所有含钙离子的无机或有机盐溶液中的任意一种或任意若干种的混合液，例如氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙、溴化钙、碘化钙、氯酸钙、高氯酸钙、高锰酸钙溶液等中的一种或多种。优选地，“含有游离钙离子的溶液”为氯化钙溶液。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以包括含有游离钙离子的溶液、凝血因子、凝血酶、凝血酶原、纤维蛋白、纤维蛋白原中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以为含有游离钙离子的溶液，并且通过混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约6-12mmol/l。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以为氯化钙溶液。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约7-11mmol/l。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约8-10mmol/l。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约9mmol/l。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种通过本公开所述的制备三维细胞培养支架的方法而获得的三维细胞培养支架。

在一些实施方式中，所述三维细胞培养支架可以用于自体或异体细胞的三维培养、优选地用于自体细胞的三维培养。在一些实施方式中，所述三维细胞培养支架可以用于细胞的支架内或支架外三维培养、优选地用于细胞的支架外三维培养。在一些实施方式中，所述三维细胞培养支架可以用于自体细胞的支架外三维培养。图1示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行细胞的支架外培养的示意图；图2示出了利用本公开的三维细胞培养支架进行细胞的支架内培养的示意图。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种三维细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)将血浆与促进血浆凝固的试剂混合；

2)将通过步骤1)获得的混合物加入到细胞培养容器中；

3)待所述混合物凝固后，在其上方加入细胞悬液。

在一些实施方式中，所述血浆与所述促进血浆凝固的试剂的比例大于1:1，优选地大于或等于2:1、更优选地大于或等于3:1、更优选地大于或等于4:1、更优选地大于或等于5:1、更优选地大于或等于6:1、更优选地大于或等于7:1、更优选地大于或等于8:1、更优选地大于或等于9:1、特别优选地为9:1。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以包括含有游离钙离子的溶液、凝血因子、凝血酶、凝血酶原、纤维蛋白、纤维蛋白原中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以为含有游离钙离子的溶液，并且通过混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约6-12mmol/l。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以为氯化钙溶液。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约7-11mmol/l。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约8-10mmol/l。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约9mmol/l。

在一些实施方式中，步骤2)中所述混合物与所述细胞培养容器的体积比可以为约1:4-1:8。

在一些实施方式中，步骤3)中所述凝固的条件是本领域技术人员公知的并且可以灵活调整，例如但不限于：37℃，30min。

在一些实施方式中，步骤3)中所述细胞悬液的细胞浓度是本领域技术人员公知的并且可以灵活调整，例如，约10⁵个细胞/ml。在一些实施方式中，步骤3)中所述的细胞悬液可以是任何细胞，包括正常细胞、肿瘤细胞(包括原代肿瘤细胞、肿瘤细胞系细胞)等的悬液。在一些实施方式中，步骤3)中所述的细胞悬液是肿瘤细胞悬液。

在一些实施方式中，步骤3)中所述细胞悬液与所述混合物的体积比可以为约1:1-3:1，优选地约1:1。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种三维细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)将细胞与血浆以及促进血浆凝固的试剂混合；

2)将通过步骤1)获得的混合物加入到细胞培养容器中；

3)待所述混合物凝固后，在其上方加入细胞培养液。

在一些实施方式中，所述血浆与所述促进血浆凝固的试剂的比例大于1:1，优选地大于或等于2:1、更优选地大于或等于3:1、更优选地大于或等于4:1、更优选地大于或等于5:1、更优选地大于或等于6:1、更优选地大于或等于7:1、更优选地大于或等于8:1、更优选地大于或等于9:1、特别优选地为9:1。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以包括含有游离钙离子的溶液、凝血因子、凝血酶、凝血酶原、纤维蛋白、纤维蛋白原中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以为含有游离钙离子的溶液，并且通过混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约6-12mmol/l。

在一些实施方式中，所述促进血浆凝固的试剂可以为氯化钙溶液。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约7-11mmol/l。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约8-10mmol/l。在一些实施方式中，通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度可以为约9mmol/l。

在一些实施方式中，步骤1)中所述的细胞可以是任何细胞，包括正常细胞、肿瘤细胞(包括原代肿瘤细胞、肿瘤细胞系细胞)等。在一些实施方式中，步骤1)中所述的细胞是肿瘤细胞。

在一些实施方式中，步骤2)中所述混合物中细胞的浓度是本领域技术人员公知的并且可以灵活调整，例如，约10⁵个细胞/ml。

在一些实施方式中，步骤2)中所述混合物与所述细胞培养容器的体积比可以为约1:2-1:4。

在一些实施方式中，步骤3)中所述凝固的条件是本领域技术人员公知的并且可以灵活调整，例如但不限于：37℃，30min。

在一些实施方式中，步骤3)中所述细胞培养液与所述混合物的体积比可以为约1:2-1:1，优选地约1:1。

根据本公开的一种实施方式，可以提供一种通过本公开所述的三维细胞培养方法而获得的细胞培养物。

根据本公开的一种实施方式，可以提供血浆与促进血浆凝固的试剂的组合用于制备三维细胞培养支架的用途。

根据本公开的一种实施方式，可以提供血浆作为制备三维细胞培养支架的基础原料的用途。

在本文中使用时，“基础原料”意味着在形成三维细胞培养支架的所有原料中占比超过50％、优选地超过60％、更优选地超过70％、特别优选地超过80％、最优选地超过85％的原料。

根据本公开，利用血浆作为基础原料、更具体地利用血浆与促进血浆凝固的试剂的组合来制备三维细胞培养支架，开辟了一种新的制备三维细胞培养支架的思路，不仅独具匠心，而且实现了三维细胞培养支架的价格低廉、来源易得、操作简便、生物相容性好且能较好模拟体内微环境的有益效果。

此外，本公开还包括以下方面所述的实施方案。

第一方面是一种制备三维细胞培养支架的方法，所述方法包括：将血浆与促进血浆凝固的试剂混合。

第二方面是如第一方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂包括含有游离钙离子的溶液、凝血因子、凝血酶、凝血酶原、纤维蛋白、纤维蛋白原中的一种或多种。

第三方面是如第二方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂为含有游离钙离子的溶液，并且通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度为6-12mmol/l。

第四方面是如第三方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂为氯化钙溶液。

第五方面是如第三方面所述的方法，其中通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度为7-11mmol/l。

第六方面是如第三方面所述的方法，其中通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度为8-10mmol/l。

第七方面是如第三方面所述的方法，其中通过所述混合而获得的混合物中钙离子的浓度为9mmol/l。

第八方面是一种通过第一方面至第七方面中任一项所述的方法而获得的三维细胞培养支架。

第九方面是一种三维细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)将血浆与促进血浆凝固的试剂混合；

2)将通过步骤1)获得的混合物加入到细胞培养容器中；

3)待所述混合物凝固后，在其上方加入细胞悬液。

第十方面是根据第九方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂包括含有游离钙离子的溶液、凝血因子、凝血酶、凝血酶原、纤维蛋白、纤维蛋白原中的一种或多种。

第十一方面是根据第十方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂为含有游离钙离子的溶液，并且步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为6-12mmol/l。

第十二方面是根据第十一方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂为氯化钙溶液。

第十三方面是根据第十一方面所述的方法，其中步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为7-11mmol/l。

第十四方面是根据第十一方面所述的方法，其中步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为8-10mmol/l。

第十五方面是根据第十一方面所述的方法，其中步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为9mmol/l。

第十六方面是一种三维细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)将细胞与血浆以及促进血浆凝固的试剂混合；

2)将通过步骤1)获得的混合物加入到细胞培养容器中；

3)待所述混合物凝固后，在其上方加入细胞培养液。

第十七方面是根据第十六方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂包括含有游离钙离子的溶液、凝血因子、凝血酶、凝血酶原、纤维蛋白、纤维蛋白原中的一种或多种。

第十八方面是根据第十七方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂为含有游离钙离子的溶液，并且步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为6-12mmol/l。

第十九方面是根据第十八方面所述的方法，其中所述促进血浆凝固的试剂为氯化钙溶液。

第二十方面是根据第十八方面所述的方法，其中步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为7-11mmol/l。

第二十一方面是根据第十八方面所述的方法，其中步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为8-10mmol/l。

第二十二方面是根据第十八方面所述的方法，其中步骤2)中所述的混合物中钙离子的浓度为9mmol/l。

第二十三方面是一种通过第九方面至第二十二方面中任一项所述的方法而获得的细胞培养物。

第二十四方面是血浆与促进血浆凝固的试剂的组合用于制备三维细胞培养支架的用途。

第二十五方面是血浆作为制备三维细胞培养支架的基础原料的用途。

上文针对本公开的三维细胞培养支架、方法、用途的各个组成部分、步骤所述的各种实施方式和优选项可以相互组合(只要它们彼此之间不是内在矛盾的)，由此组合而形成的各种实施方式都视为本申请公开的一部分。

下面将结合附图和实施例以例证的方式更清楚、明确地阐述本公开的技术方案。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不旨在限制本公开的保护范围。本公开的保护范围仅通过权利要求来限定。

实施例

除非另有说明，否则以下实施例中所采用的试剂或酶购买自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1：三维细胞培养支架的制备

1.1配制10×氯化钙储存液：

称取无水氯化钙1克溶于100毫升去离子水中，氯化钙浓度为90mmol/l，用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。

1.2制备血浆：

(1)肺癌患者来源血浆：该样品来自北京大学肿瘤医院，用以枸橼酸钠作为抗凝剂的采血管抽取肿瘤细胞来源肺癌患者肘静脉血20ml，800g/min室温离心15min，收集10ml血浆。

(2)马血浆：商购自郑州九龙生物制品有限公司。

1.3制备三维细胞培养支架：

将1.8ml上述肺癌患者来源血浆或马血浆与0.2ml10×氯化钙储存液充分混匀后加入到6孔细胞培养板孔中，37℃平放静置30min直至血浆凝固成胶冻状。

图3、图4分别示出了利用马血浆和肿瘤患者来源血浆制备的三维细胞培养支架在光学显微镜下的结构。如图3、图4所示，二者均形成了致密的网状结构。

实施例2：自体细胞的支架外三维培养

将从实施例1中所述的肺癌患者身上手术切除的肿瘤组织用胰蛋白酶(sigma-aldrich,usa)消化，获得了单细胞悬液，然后经肿瘤细胞分离管分离，得到了肿瘤细胞。用原代肿瘤细胞培养液(mem基础培养液(thermoscientific,usa)中添加20ng/mlbfgf(invitrogen,usa)、50ng/mlegf(invitrogen,usa)、2％(v/v)n2(invitrogen,usa)、1％(v/v)b27(invitrogen,usa)、10μmrock抑制剂(enzolifesciences,usa)和1％(m/v)青/链霉素(sigma-aldrich,usa))重悬肿瘤细胞使其浓度为10⁵个/ml。

将1.8ml实施例1中所述的肺癌患者来源血浆与0.2ml10×氯化钙储存液充分混匀后加入到6孔细胞培养板孔中，37℃平放静置30min直至血浆凝固成胶冻状。在已凝固血浆的上方加入2ml制备好的细胞悬液。在37℃、5％co2条件下培养3天后更换新鲜细胞培养液。

结果如图5所示。可见，原代肿瘤细胞在支架外培养形成了球体样三维结构。

实施例3：自体细胞的支架内三维培养

将从实施例1中所述的肺癌患者身上手术切除的肿瘤组织用胰蛋白酶消化，获得了单细胞悬液，然后经肿瘤细胞分离管分离，得到了肿瘤细胞。用原代肿瘤细胞培养液(mem基础培养液(thermoscientific,usa)中添加20ng/mlbfgf(invitrogen,usa)、50ng/mlegf(invitrogen,usa)、2％(v/v)n2(invitrogen,usa)、1％(v/v)b27(invitrogen,usa)、10μmrock抑制剂(enzolifesciences,usa)和1％(m/v)青/链霉素(sigma-aldrich,usa))重悬肿瘤细胞使其浓度为10⁵个/ml。

将2ml制备好的细胞悬液800g/min室温离心5min，弃掉上清后用1.8ml实施例1中所述的肺癌患者来源血浆与0.2ml10×氯化钙储存液重悬细胞沉淀。充分混匀后加入到6孔细胞培养板孔中，37℃平放静置30min直至血浆凝固成胶冻状。在已凝固血浆的上方加入2ml原代肿瘤细胞培养液(mem基础培养液(thermoscientific,usa)中添加20ng/mlbfgf(invitrogen,usa)、50ng/mlegf(invitrogen,usa)、2％(v/v)n2(invitrogen,usa)、1％(v/v)b27(invitrogen,usa)、10μmrock抑制剂(enzolifesciences,usa)和1％(m/v)青/链霉素(sigma-aldrich,usa))。在37℃、5％co2条件下培养3天后更换新鲜细胞培养液。

结果如图6所示。可见，原代肿瘤细胞在支架内培养形成了球体样三维结构。

实施例4：异体细胞的支架外三维培养

将人肝癌hepg2细胞(atcc，usa)经二维培养至对数生长期，然后用胰蛋白酶消化，获得了单细胞悬液，随后用添加了10％(v/v)胎牛血清(thermoscientific,usa)和1％(m/v)青/链霉素的dmem培养液(thermoscientific,usa)重悬hepg2细胞使其浓度为10⁵个/ml。

将1.8ml实施例1中所述的马血浆与0.2ml10×氯化钙储存液充分混匀后加入到6孔细胞培养板孔中，37℃平放静置30min直至血浆凝固成胶冻状。在已凝固血浆的上方加入2ml制备好的细胞悬液。在37℃、5％co2条件下培养3天后更换新鲜细胞培养液。

结果如图7所示。可见，hepg2细胞在支架外培养形成了球体样三维结构。

实施例5：异体细胞的支架内三维培养

将人肝癌hepg2细胞(atcc，usa)经二维培养至对数生长期，然后用胰蛋白酶消化，获得了单细胞悬液，随后用添加了10％(v/v)胎牛血清(thermoscientific,usa)和1％(m/v)青/链霉素的dmem培养液重悬hepg2细胞使其浓度为10⁵个/ml。

将2ml制备好的细胞悬液800g/min室温离心5min，弃掉上清后用1.8ml实施例1中所述的马血浆与0.2ml10×氯化钙储存液重悬细胞沉淀。充分混匀后加入到6孔细胞培养板孔中，37℃平放静置30min直至血浆凝固成胶冻状。在已凝固血浆的上方加入2mldmem培养液(其中添加了10％(v/v)胎牛血清和1％(m/v)青/链霉素)。在37℃、5％co2条件下培养3天后更换新鲜细胞培养液。

结果如图8所示。可见，hepg2细胞在支架内培养形成了球体样三维结构。