一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用

1.本发明涉及一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.3羟基丙酸是近些年来新兴的一种三碳平台化合物，该分子具有两种官能基团—羟基和羧基，以它为出发原料可用于合成涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品等多种化工产品及日用品。3羟基丙酸还可通过还原作用生成1,3-丙二醇，1,3-丙二醇也是一种重要的化工原料，可作为保护剂、溶剂等，也可用于合成聚氨酯和聚对苯二甲酸丙二醇酯等。3-羟基丙酸聚合形成的3-羟基丙酸聚合物合成的材料具有熔点高、强度高、生物可降解的优势，可作为原料合成多种高附加值的材料，具有广泛的应用前景。
3.目前，3-羟基丙酸的生产以化学合成为主，主要以丙烯酸、3-丙内酯、3-羟丙腈、醋酸乙烯酯和1，3-丙二醇为前体物质，通过一系列化工路线进行转化。化学合成方法具有生产成本较高而产率较低等缺点；同时，用于化学合成的前体物质大都具有毒性大、致癌性的特点，严重制约了产业化应用。生物转化法合成3-羟基丙酸的相关研究起步于近二十年，一些学者利用重组大肠杆菌(escherichia coli)或肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)以甘油或葡萄糖为底物进行微生物转化。为有效提高3-羟基丙酸产量，转化技术路线也各有不同，研究主要集中于工程菌的构建和发酵工艺的改进。
4.丙二酸是一种有机酸，目前应用非常广泛，主要用于香料和医药中间体，其下游产品覆盖面非常大，涉及塑料、染料、医药、农药、电镀等行业。目前，丙二酸主要通过丙二酸酯水解法获得，操作简单，经济方便。丙二酸分子结构中兼有羧基和活性亚甲基两种官能团，能参加各种化学反应，是非常重要的有机合成中间体。然而，目前尚无利用丙二酸合成3-羟基丙酸的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种以丙二酸为底物生物合成3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用，具体技术方案如下：
6.一种合成3-羟基丙酸的重组菌，所述重组菌是将编码丙二酸单酰辅酶a合酶的基因matb、编码丙二酸单酰辅酶a还原酶的基因mcr、编码丙二酸跨膜蛋白的基因madl和编码丙二酸跨膜蛋白的基因madm导入到大肠杆菌获得的。
7.在本发明的一个实施例中，所述的编码丙二酸单酰辅酶a合酶的基因matb来源于沼泽红假单胞菌rhodopseudomonaspalustris；所述编码丙二酸单酰辅酶a还原酶的基因mcr来源于嗜热光全绿丝菌chloroflexus aurantiacus；所述编码丙二酸跨膜蛋白的基因madl和编码丙二酸跨膜蛋白的基因madm来源于假单胞菌pf5pseudomonasfluorescens。
8.在本发明的一个实施例中，丙二酸单酰辅酶a合酶在ncbi的蛋白质编号为wp_011155789.1；丙二酸单酰辅酶a还原酶在ncbi的蛋白质编号为aas20429.1；丙二酸跨膜蛋
白madl在ncbi的蛋白质编号为wp_015637351.1；丙二酸跨膜蛋白madm在ncbi的蛋白质编号为wp_011063986.1。
9.在本发明的一个实施例中，所述编码丙二酸单酰辅酶a合酶的基因matb经过密码子优化，序列如seq no.1所示；所述编码丙二酸单酰辅酶a还原酶的基因mcr经过密码子优化，序列如seq no.2所示；所述编码丙二酸跨膜蛋白的基因madl和编码丙二酸跨膜蛋白的基因madm拼接后经过密码子优化，序列如seq no.3所示。
10.本发明还提供了上述重组菌的构建方法，步骤如下：
11.1)分别合成所述编码丙二酸单酰辅酶a合酶的基因matb和编码丙二酸单酰辅酶a还原酶的基因mcr，将合成所得的基因连接到质粒pacyc dute-1中，然后转入e.coli dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pacyc dute-matb-mcr；
12.2)分别合成所述编码丙二酸跨膜蛋白的基因madl和编码丙二酸跨膜蛋白的基因madm，将合成所得的基因连接到质粒pbad18中，然后转入e.coli dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pbad-madlm；
13.3)将步骤1)与步骤2)所获得的重组载体，转化到宿主escherichia colibl21(de3)感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。
14.本发明还提供了上述重组菌在发酵生产3-羟基丙酸中的应用。
15.在本发明的一个实施例中，所述发酵生产3-羟基丙酸的方法，步骤如下：
16.1)活化重组菌，获得种子液；
17.2)将步骤1)所得的种子液接种到含有氨苄青霉素与氯霉素的lb培养基中培养至od
600
在0.6～0.8，获得培养液；
18.3)向所得的培养液中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg，阿拉伯糖和丙二酸，继续培养48h。
19.在本发明的一个实施例中，步骤2)所述培养条件为：37℃，220rpm。
20.在本发明的一个实施例中，步骤2)中所述种子液按体积比为2％的接种量接种到含终浓度为100μg
·
ml-1
氨苄青霉素和终浓度为100μg
·
ml-1
氯霉素的lb培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养，待od
600
达到0.6时，温度调节至30℃，加入终浓度0.5mm iptg，终质量浓度0.02％阿拉伯糖和终浓度50mm丙二酸或丙二酸衍生物，20-30℃继续培养48小时后终止发酵。
21.本发明还提供了一种检测上述重组菌中酶活性的方法，步骤如下：
22.1)活化重组菌，获得种子液；
23.2)将步骤1)所得的种子液接种到含有氨苄青霉素与氯霉素的lb培养基中培养至od
600
在0.6～0.8，获得培养液；
24.3)向所得的培养液中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg至终浓度为0.5mm，阿拉伯糖至终质量浓度0.02％，然后继续培养；
25.4)将所得的培养液于4℃离心，收集得到菌体；然后加入100mm tris缓冲液重悬，将菌悬液用高压破碎机破碎，然后离心，得到上清即为粗酶液；
26.5)然后，向反应体系中加入丙二酸，步骤4)得到的粗酶液，nadph，atp，ph为7.8的tris缓冲液和水，30℃摇床，220rpm，反应12个小时。
27.在本发明的一个实施例中，所述继续培养的条件为20℃，220rpm条件下继续培养
20小时。
28.在本发明的一个实施例中，反应体系为1ml，其中丙二酸终浓度30mm，粗酶液300ul，nadph终浓度1mm，atp终浓度1mm，ph为7.8的tris缓冲液终浓度100mm，30℃摇床，200rpm，反应12个小时。
29.在本发明的一种实施方式中，lb培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，nacl 10.0g/l。
30.本发明所获得的有益效果如下：
31.本发明以escherichia coli bl21(de3)为宿主菌株，通过引入3-羟基丙酸合成的关键基因，构建获得工程菌，首次以丙二酸为底物，实现了3-羟基丙酸的生物合成。丙二酸价格低廉，约为1.6万/吨，利用丙二酸通过两步酶反应合成出3-羟基丙酸，理论产率可达86.5％，将大幅降低3-羟基丙酸合成成本，并有效与现有化工体系对接，更有助于3-羟基丙酸的推广应用。
32.定义和缩写
33.在本文中使用下列的缩写或简称：
34.丙二酸单酰辅酶a合酶基因：matb；
35.丙二酸单酰辅酶a还原酶基因：mcr；
36.丙二酸跨膜蛋白基因：madl以及madm，实施例中为方便命名，将两基因名称合并为madlm；
37.大肠杆菌(escherichia coli):e.coli；
38.3-羟基丙酸：3-hp。
附图说明
39.图1.利用丙二酸合成3-羟基丙酸的途径。
具体实施方式
40.下面通过实例来进一步阐明本发明，但本发明并不限于以下实施例。
41.下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
42.下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
43.所用酶试剂购自莫纳生物公司，提取质粒所用的试剂盒和纯化试剂盒购自sparkjade公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
44.培养基配方：
45.1)培养基
46.lb培养基：5g/l酵母粉，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
47.在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/l的氨苄青霉素和100μg
·
ml-1
氯霉素。
48.实施例1.合成3-羟基丙酸的重组菌的构建。
49.1.载体pacyc dute-matb-mcr的构建。
50.本实施例中，来源于沼泽红假单胞菌的丙二酸单酰辅酶a合酶的基因matb(matb在
ncbi的蛋白质编号为wp_011155789.1)和来源于chloroflexus aurantiacus(嗜热光全绿丝菌)的丙二酸单酰辅酶a还原酶的基因mcr(mcr在ncbi的蛋白质编号为aas20429.1)是通过全基因合成，matb经密码子优化后合成的序列seq id no.1所示；mcr经密码子优化后合成的序列如seq id no.2所示；分别获得含有mtab的质粒和mcr的质粒，载体为pacycdute-1。
51.将mtab质粒用bgiⅱ酶切，mcr质粒用bamhⅰ和bgiⅱ酶切，pacyc dute-1质粒用ncoⅰ，ecor
ⅴ
和kpnⅰ酶切，纯化酶切产物，再进行连接，载体(pacyc dute-1质粒)与插入片段(mtab、mcr)按照摩尔比1:2的比例，50℃连接30分钟，连接产物转化e.coli dh5α，然后涂布在加有100μg
·
ml-1
氯霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pacyc dute-matb-mcr后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
52.2.载体pbad-madlm的构建。
53.本实施例中，来源于假单胞菌pf5的丙二酸跨膜蛋白的基因madlm(madlm在ncbi的蛋白质编号为wp_015637351.1和wp_011063986.1)是经密码子优化后通过全基因合成获取，合成的序列如seq id no.3所示。
54.将madlm质粒用bgiⅱ和xbaⅰ酶切，pbad18质粒用ecorⅰ，xbaⅰ和hindⅲ酶切，纯化酶切产物，再进行连接，载体(pbad18质粒)与插入片段(madlm)按照摩尔比1:2的比例，50℃连接30分钟，连接产物转化e.coli dh5α，然后涂布在加有100μg
·
ml-1
氨苄青霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pbad-madlm后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
55.3.将pacyc dute-matb-mcr和pbad-madlm导入e.coli bl21(de3)并验证酶的活性。
56.1)将步骤1中获得的载体pacyc dute-matb-mcr与步骤2中获得的载体pbad-madlm导入e.coli bl21(de3)感受态细胞，涂布在含有100μg
·
ml-1
氨苄青霉素和100μg
·
ml-1
氯霉素的lb固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆，将获得的工程菌株单克隆在lb培养中进行活化，获得种子液；
57.2)活化后的菌株按1:50的比例接种到含有50ml lb培养基的250ml摇瓶中(内含100μg
·
ml-1
氨苄青霉素和100μg
·
ml-1
氯霉素)，37℃、220rpm条件下振荡培养，至od
600
达到0.6左右，获得培养液；
58.3)向培养液中加入诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.5mm，阿拉伯糖至终质量浓度0.02％，然后转入20℃，220rpm条件下继续培养20小时。
59.4)将所得的培养液8000rpm，4℃，离心5分钟收集得到菌体；然后加入100mm tris(ph7.8)缓冲液重悬，将菌悬液用高压破碎机破碎，将破碎后的菌液10000rpm，4℃，离心45min，得到上清即为粗酶液。
60.5)建立1ml反应体系：丙二酸终浓度30mm，粗酶液300ul，nadph终浓度1mm，atp终浓度1mm，tris缓冲液(ph7.8)终浓度100mm，同时设计无酶空白实验作为对照，30℃摇床，220rpm，反应12个小时。将反应液4℃，10000rpm离心5min，取上清，用高效液相色谱-质谱联用检测产物。
61.经检测，3羟基丙酸的出峰时间为2.5分钟左右，m/z为89.0，与3-羟基丙酸标准品一致。与无酶空白对比，反应体系中检测到产物3羟基丙酸，表明了重组菌中的酶具有催化
生成3羟基丙酸的活性。
62.实施例2.将pacyc dute-matb-mcr和pbad-madlm导入e.coli bl21(de3)合成3-hp。
63.1)将实施例1中获得的载体pacyc dute-matb-mcr与pbad-madlm导入e.coli bl21(de3)感受态细胞，涂布在含有100μg
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ml-1
氨苄青霉素和100μg
·
ml-1
氯霉素的lb固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。将获得的工程菌株单克隆在lb培养中进行活化，获得种子液；
64.2)活化后的菌株按1:50的比例接种到含有50ml lb培养基的250ml摇瓶中(内含100μg
·
ml-1
氨苄青霉素和100μg
·
ml-1
氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养至od
600
达到0.6左右，获得培养液；
65.3)温度调节至30℃，向所得的培养液中加入终浓度0.5mm iptg和终质量浓度0.02％的阿拉伯糖进行诱导，并加入终浓度50mm的底物丙二酸，继续培养48h终止发酵。
66.取1ml发酵液，4℃，10000rpm离心5min，取上清，用高效液相色谱-质谱联用检测产物。
67.3羟基丙酸的出峰时间为2.5分钟左右，m/z为89.0，与3-羟基丙酸标准品一致。反应体系中检测到产物3-羟基丙酸，产量为0.45g/l，表明了重组菌可以合成3-羟基丙酸。
68.合成基因序列:
69.matb：
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118.madlm：
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120.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。