一种过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物及其试剂盒的制作方法

[0001]
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物和试剂盒，及其在过敏性紫癜检测中的应用。


背景技术：

[0002]
过敏性紫癜(henoch
–
scholein purpura，hsp)是一种iga介导的血管炎，是儿童时期最常见的自身免疫性疾病。临床表现包括可触及的紫癜或瘀斑，关节痛，腹痛和肾脏受累，肾脏病理活检提示以iga沉积为主的增生性肾小球肾炎。hsp的诊断主要根据特征性临床表现，可能会导致诊断和治疗的延迟。很多研究者尝试开发各种生物标志物用于hsp的诊断，包括血小板计数、粪便钙卫蛋白浓度、血清淀粉样蛋白a、il-6、wbc、iga和igm等，但仍没有明确的实验室检查可用于诊断hsp。
[0003]
人们发现肠道细菌对人体同样发挥着重要的作用。已有大量研究表明肠道菌群组成改变可能在免疫介导性疾病的发病机制中发挥重要作用。hsp的病因和发病机制仍未完全阐明，目前大量研究局限于易感基因(hla-b、hla-drb1、mefv、c1galt1等)、感染(细菌、病毒或寄生虫)和免疫(iga、补体)等方面，关于肠道菌群与hsp的研究较少。肠道菌群失调在hsp的发病中起到重要作用，但目前对于hsp肠道菌群在不同疾病分期(hsp初发和复发)中的研究还不够深入，尚无基于肠道菌群的hsp的诊断方法。


技术实现要素：

[0004]
为了解决现有技术中过敏性紫癜相关菌群的选择及检测问题，发明人提供了一种用于过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物及其检测试剂盒，技术方案如下：
[0005]
一种过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物，至少包括以下菌属：faecalibacterium，prevotella_9，escherichia-shigella，blautia和ruminococcus_gnavus_group。
[0006]
所述的菌群标志物还包括bacteroides，subdoligranulum，parabacteroides，fusobacterium，dialister，lachnocostridium，bifidobacterium，phascolarctobacterium，roseburia，veillonella其中的一种以上。
[0007]
一种过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括faecalibacterium，prevotella_9，escherichia-shigella，blautia和ruminococcus_gnavus_group，这5种菌属丰度定量的试剂。
[0008]
一种过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒还包括bacteroides，subdoligranulum，parabacteroides，fusobacterium，dialister，lachnocostridium，bifidobacterium，phascolarctobacterium，roseburia，veillonella其中的一种以上菌属丰度定量的试剂。
[0009]
进一步的，所述的菌群丰度定量试剂为pcr试剂，其扩增的otu序列如seq id no：5～seq id no：9所示。
[0010]
进一步的，所述的过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物的检测试剂盒，还包括总细菌的丰度定量试剂。
[0011]
进一步的，过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物的检测试剂盒在过敏性紫癜初次发病风险预测中的应用。
[0012]
进一步的，过敏性紫癜发病风险预测的菌群标志物的检测试剂盒在过敏性紫癜复发风险预测中的应用。
[0013]
区别于现有技术，上述技术方案的优点在于：
[0014]
通过对过敏性紫癜初发和复发相关的肠道菌群标志物的检测，分析菌群结构，可以提示过敏性紫癜的发病风险，为过敏性紫癜的诊断提供辅助参考，也为过敏性紫癜的治疗提供方向。
附图说明
[0015]
图1为具体实施方式所述的门水平的物种组成。
[0016]
图2为具体实施方式所述的属水平的物种组成。
[0017]
图3为具体实施方式所述的基于otu水平的nmds分析结果。
[0018]
图4为具体实施方式所述的lda值分布柱状图。
[0019]
图5为具体实施方式所述的多组差异分析。
[0020]
图6为具体实施方式所述的疾病初发模型的roc曲线图。
[0021]
图7为具体实施方式所述的疾病复发模型a的roc曲线图。
[0022]
图8为具体实施方式所述的疾病复发模型b的roc曲线图。
具体实施方式
[0023]
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
[0024]
实施例1
[0025]
1.实验方法
[0026]
本实验收集了23例健康儿童和34例过敏性紫癜患儿(其中18例为过敏性紫癜初发患儿，16例为过敏性紫癜复发患儿)的粪便样本。健康组标记为ch，疾病初发组标记为at，疾病复发组标记为bt。
[0027]
1.1粪便dna的提取
[0028]
采用粪便dna提取试剂盒(购自广州美基)提取粪便样本的dna。
[0029]
1.2文库构建
[0030]
(1)引物设计
[0031]
针对16s rrna基因的v3-v4区设计特异性引物并加上overhang序列，具体序列如下：
[0032]
上游引物f：
[0033]
tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcctacgggnggcwgcag(seq id no:1)
[0034]
下游引物r：
[0035]
gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggactachvgggtatctaatcc(seq id no:2)
[0036]
(2)pcr扩增和标记靶点
[0037]
a)在0.2ml pcr tube中配制反应体系：
[0038][0039]
其中，pcr amplification mix购自南京诺唯赞，primer mix1为含有上述引物的te buffer。
[0040]
b)将配置好的mix混匀，置于pcr仪中，执行以下程序：
[0041][0042]
c)反应结束后，取2μl pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，pcr产物约500bp。电泳条件：1％agarose，d2000 ladder，120v，20min。
[0043]
(3)pcr产物纯化
[0044]
利用ampure xp磁珠对pcr产物进行纯化。
[0045]
(4)为靶点建立index标签
[0046]
a)从-20℃冰箱中取出pcr amplification mix(2x)，10μm/μl indexed pcr primer i5和indexed pcr primer i7，并在冰上进行化冻；
[0047]
以下仅列出一组index序列，其余序列见nextera index kit
–
pcr primers试剂盒。
[0048]
i5：aatgatacggcgaccaccgagatctacacctctctattcgtcggcagcgtc(seq id no:3)
[0049]
i7：caagcagaagacggcatacgagattcgccttagtctcgtgggctcgg(seq id no:4)
[0050]
b)在0.2ml离心管中按以下方法配制反应体系：
[0051][0052]
c)将配置好的mix轻柔吹打10次混匀，然后置于pcr仪中，反应程序如下：
[0053][0054]
(5)文库纯化
[0055]
利用磁珠对上一步的pcr产物进行纯化。
[0056]
(6)文库质检
[0057]
a)取1μl使用qubit3.0 fluorometer(qubit dsdna hs assay kit)进行浓度检测，并记录浓度。
[0058]
b)使用agilent 2200high sensitivity d1000 kit对文库进行条带分布检测。
[0059]
1.3miseq测序
[0060]
将构建好的文库和芯片一同放进miseq测序仪中，采用miseq reagent kit v3试剂盒(购自illumina公司)进行测序。
[0061]
1.4测序数据分析
[0062]
(1)测序数据处理
[0063]
根据barcode序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去barcode后使用flash对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始tags数据(raw tags)；拼接得到的raw tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的tags数据(clean tags)。参照qiime的tags质量控制流程，进行如下操作：a)tags截取：将raw tags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝
19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)tags长度过滤：tags经过截取后得到的tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于tags长度75％的tags。经过以上处理后得到的tags去除引物以及嵌合体。
[0064]
使用mothur过滤处理得到高质量的reads，之后进一步去除嵌合体序列，至此完成测序数据的处理。
[0065]
(2)otu聚类和物种注释
[0066]
利用mothur软件对数据处理过的样品进行聚类，默认以97％的一致性(identity)将序列聚类成为otus(operational taxonomic units)，同时会选取otus的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是otus中出现频数最高的序列作为otus的代表序列。对otus代表序列进行物种注释，用mothur方法与silva的ssurrna数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。
[0067]
根据物种注释结果，选取每个样品或分组在各分类水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样品在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。
[0068]
(3)物种多样性及组间差异分析
[0069]
根据物种注释结果，进行alpha、beta多样性以及组间差异分析，并通过kruskal-wallis h test检验分析组间物种多样性差异是否显著。
[0070]
采用lefse(lda effect size)方法，在组与组之间寻找具有统计学差异的biomarker，即组间差异显著的物种。
[0071]
2.实验结果
[0072]
(1)物种组成
[0073]
at组、bt组和ch组，这三组的物种组成门水平如图1，属水平如图2所示。
[0074]
在门水平上，厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、变形杆菌门(proteobacteria)和放线菌门(actinobacteria)均是三组的优势菌门。
[0075]
在属水平上，拟杆菌属(bacteroides)比例最高，粪杆菌属(faecalibacterium)次之。在at组、bt组和ch组三组中，普雷沃氏菌属(prevotella_9)、副萨特氏菌属(parasutterella)呈降低的趋势；大肠埃希氏菌属(escherichia-shigella)、subdoligranulum、lachnoclostridium呈增加的趋势。
[0076]
(2)物种多样性
[0077]
对于物种多样性采用非度量多维尺度分析(nmds)，见图3，stress小于0.2，说明nmds可以准确反映样品间的差异程度。
[0078]
(3)组间差异分析
[0079]
利用lefse分析对菌群组成差异进行了比对分析，结果见图4。采用kruskal-wallis秩和检验进行多组样本分析，结果见图5。实验结果表明，faecalibacterium，prevotella_9，escherichia-shigella，blautia和ruminococcus_gnavus_group在三组间差异具有统计学意义。
[0080]
进一步分析发现，faecalibacterium，prevotella_9，escherichia-shigella，blautia，ruminococcus_gnavus_group，bacteroides，subdoligranulum，
parabacteroides，fusobacterium，dialister，lachnocostridium，bifidobacterium，phascolarctobacterium，roseburia，veillonella这15个菌属是关键菌属，可以作为生物标志物用于过敏性紫癜的发病风险预测。
[0081]
实施例2
[0082]
选择faecalibacterium、prevotella_9、escherichia-shigella、blautia、ruminococcus_gnavus_group这5种差异显著的菌属，建立风险预测模型。
[0083]
(1)过敏性紫癜初发风险预测模型
[0084]
以初发组(at)和健康组(ch)数据，建立过敏性紫癜初发风险预测模型，如下：
[0085]
y＝a+b1×
x1+b2×
x2+
…
+b5×
x5ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0086]
式中a为常数，b
i
为回归系数，x
i
为关键菌属的相对丰度，y为预测值。
[0087]
对于未发生过过敏性紫癜的儿童，可采用此模型对初次发病风险进行预测。
[0088]
通过画roc曲线，并计算其auc面积，作为评估二类分类效果的一个典型测量。计算后得到auc为0.786，如图6所示。说明本模型对过敏性紫癜初次发病风险预测效果较好，可以根据该模型对过敏性紫癜的发病风险进行预测。最优临界点为0.7，即当预测值大于0.7被分类为健康人，预测值小于0.7被分类为患者时，预测效果最好。
[0089]
(2)过敏性紫癜复发风险预测模型
[0090]
以复发组(bt)和健康组(ch)数据，建立过敏性紫癜复发风险预测模型a，如下：
[0091]
z＝c+d1×
x1+d2×
x2+
…
+d5×
x5ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0092]
式中c为常数，d
i
为回归系数，x
i
为关键菌属的相对丰度，z为预测值。
[0093]
对于过敏性紫癜治愈后的人群，可采用此模型对疾病复发风险进行预测。
[0094]
通过画roc曲线，并计算其auc面积，作为评估二类分类效果的一个典型测量。计算后得到auc为0.792，如图7所示。说明本模型对过敏性紫癜复发风险预测效果较好，可以根据该模型对过敏性紫癜的发病风险进行预测。最优临界点为0.546，即当预测值大于0.546被分类为健康人，预测值小于0.546被分类为患者时，预测效果最好。
[0095]
以初发组(at)和复发组(bt)数据，建立过敏性紫癜复发风险预测模型b，如下：
[0096]
w＝g+h1×
x1+h2×
x2+
…
+h5×
x5ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0097]
式中g为常数，h
i
为回归系数，x
i
为关键菌属的相对丰度，w为预测值。
[0098]
对于初发过敏性紫癜的患者，可采用此模型对疾病复发风险进行预测。
[0099]
通过画roc曲线，并计算其auc面积，作为评估二类分类效果的一个典型测量。计算后得到auc为0.771，如图8所示。说明本模型对过敏性紫癜复发风险预测效果较好，可以根据该模型对过敏性紫癜的复发风险进行预测。最优临界点为0.325，即当预测值小于0.325时，存在复发风险。
[0100]
实施例3
[0101]
过敏性紫癜菌群标志物检测试剂盒，包括定量微生物群丰度的试剂。微生物群为faecalibacterium、prevotella_9、escherichia-shigella、blautia、ruminococcus_gnavus_group。检测受检者粪便中的5种菌属的丰度，代入实施例2所述的初发风险预测模型中，即可得出受检者过敏性紫癜初次发病的风险程度；代入实施例2所述的复发风险预测模型a中，即可得出受检者过敏性紫癜复发的风险程度。若受检者为过敏性紫癜初发患者，则代入实施例2所述的复发风险预测模型b中，即可得出受检者过敏性紫癜复发的风险程
度。
[0102]
作为上述试剂盒的进一步改进，试剂盒为pcr试剂盒，其扩增的otu序列如seq id no：5～seq id no：9所示。
[0103][0104][0105]
进一步的，定量微生物群丰度的试剂在制备过敏性紫癜疾病风险预测试剂盒中的应用。
[0106]
过敏性紫癜菌群标志物检测试剂盒，包括定量faecalibacterium、prevotella_9、escherichia-shigella、blautia、ruminococcus_gnavus_group和总细菌dna含量的试剂。
[0107]
试剂盒的使用方法为：
[0108]
(1)从受检者粪便提取细菌dna；
[0109]
(2)用本试剂盒检测5种菌属，以及总细菌的dna含量；
[0110]
(3)分别将5种菌的dna含量与总细菌的dna含量进行对比，计算得到5种菌的相对含量；
[0111]
(4)将5种菌的相对含量代入实施例2所述的初发风险预测模型中，即可得出受检者过敏性紫癜初次发病的风险预测值；
[0112]
(5)对于初发过敏性紫癜受检者，可将5种菌的相对含量代入实施例2所述的复发风险预测模型a或b中，即可得出受检者过敏性紫癜复发的风险预测值。
[0113]
实施例4
[0114]
选择faecalibacterium，prevotella_9，escherichia-shigella，blautia，ruminococcus_gnavus_group，bacteroides，subdoligranulum，parabacteroides，fusobacterium，dialister，lachnocostridium，bifidobacterium，phascolarctobacterium，roseburia，veillonella这15种菌属，建立过敏性紫癜发病风险的预测模型。
[0115]
r＝e+f1×
x1+f2×
x2+
…
+f
15
×
x
15
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(4)
[0116]
式中e为常数，f
i
为回归系数，x
i
为关键菌属的相对丰度，r为预测值。
[0117]
对于过敏性紫癜发病风险预测可采用此模型。通过画roc曲线，计算得到auc面积为0.812。
[0118]
过敏性紫癜菌群标志物检测试剂盒，包括定量以上15种菌属丰度的试剂。检测受检者粪便中的15种菌属的丰度，代入上述风险预测模型中，即可得出受检者患过敏性紫癜的风险程度。
[0119]
综上，过敏性紫癜相关致病菌属的丰度，可以作为过敏性紫癜辅助诊断的指标；可以结合风险预测模型，对过敏性紫癜患儿的发病风险进行预测分析，并对过敏性紫癜进行进一步诊断。
[0120]
以上风险预测模型还可进一步结合血常规(wbc、plt、mpv)或者免疫学指标(iga、igg、ige、igm、补体c3)或者凝血功能指标(d-二聚体、iga/c3)等综合判断过敏性紫癜的发病风险，以提高预测的准确性。
[0121]
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。