以木质素衍生物生产粘康酸的工程菌构建方法及其应用与流程

[0001]
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种以木质素衍生物高效生产粘康酸的工程菌构建方法及其应用。


背景技术：

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己二酸是一种重要的化工前体原料，可以用于尼龙-6，6合成。目前工业使用的己二酸通常来源于石油基原料，其面临着不可再生且产生三废等问题。微生物法生产己二酸通常通过粘康酸为中间体，通过氢化还原而获得，具有可再生、环境污染少等特点。目前报道的微生物合成法生产粘康酸通常采用发酵的方式。比如，karen m.draths等人报道利用大肠杆菌发酵生产粘康酸，可以实现利用56mm葡萄糖作为底物生产16.8mm粘康酸；在分配补料的条件下，可以达到6.8g/l粘康酸。近期，通过大肠杆菌共培养策略，粘康酸的得率甚至达到了0.35g/g葡萄糖/木糖。此外，相关研究也陆续报道利用pseudomonas putida,saccharomyces cerevisiae以及corynebacterium glutamicum等宿主生产粘康酸。此外，生物催化方面报道的最高粘康酸产量是以儿茶酚为原料，通过进一步生物催化而获得，达到了约100％的摩尔得率；但是儿茶酚被认为是属于致癌物，直接作为原料使用不利于操作。
[0003]
木质素作为地球上最丰富的芳香族原料，其中造纸业等生物炼制行业每年约产生1亿吨木质素废弃物。通过化学手段或酶法分解，木质素可以分解为多种芳香族化合物单体，可以作为可再生芳香族原料用于合成高附加值产品。例如：香兰酸可以通过copper-vanadium hydrotalcite以及v(acac)3/cu(no3)2·
3h2o催化分解木质素而获得。以木质素衍生的香兰酸作为底物，通过生物催化生产粘康酸的尚未见报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种以木质素衍生物生产粘康酸的工程菌构建方法及其应用。该方法构建出的工程菌可使香兰酸以高达87％以上的转化效率生产粘康酸，具有较好的经济价值及工业化应用前景。
[0005]
为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种以木质素衍生物生产粘康酸的工程菌构建方法，其包括以下步骤：
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向大肠杆菌中转化含有香兰酸去甲基化酶基因vanab的重组质粒以及含有脱羧酶基因gdc和儿茶酚双加氧酶基因cata的重组质粒。。
[0007]
根据本发明的一种以木质素衍生物生产粘康酸的工程菌构建方法，该方法构建的工程菌表达三种酶：来自恶臭假单胞杆菌pseudomonas putida的香兰酸去甲基化酶(vanillic acid o-demethylase,vanab)、来自talaromyces atroroseus的脱羧酶(gallat decarboxylase，gdc)、来自acinetobacter radioresistens的儿茶酚双加氧酶(catechol dioxygenase，cata)。利用同时含有上述三种酶的工程菌，通过简单的发酵工艺和酶级联催
化将木质素衍生香兰酸转变为粘康酸，根据本发明的实施例，实验结果显示50mm香兰酸底物可以实现粘康酸收率高达87％。由此，可将木质素废弃物制作成粘康酸，再利用粘康酸制作己二酸，变废为宝，具有较好的经济价值和工业应用前景。
[0008]
另外，根据本发明上述实施例提出的以木质素衍生物生产粘康酸的工程菌构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：
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可选地，所述香兰酸去甲基化酶基因vanab基因是以恶臭假单胞菌kt2440基因组为模板，以seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4所示序列为引物，经pcr扩增得到。
[0010]
可选地，所述脱羧酶基因gdc和儿茶酚双加氧酶基因cata是以含有gdc/cata基因的质粒作为模版，以seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8所示序列为引物，经pcr扩增得到。
[0011]
在本发明的第二个方面，本发明提出了由上述工程菌构建方法得到的以木质素衍生物生产粘康酸的工程菌。
[0012]
在本发明的第三个方面，本发明提出了粘康酸的制备方法，其通过上述的工程菌接种于培养基中发酵培养，即得。
[0013]
根据本发明实施例的粘康酸的制备方法，通过简单的发酵工艺，实现以香兰酸作为原料直接生产粘康酸，有利于粘康酸的工业化、规模化生产，同时，避免了儿茶酸的直接使用，具有环境友好的特点。
[0014]
进一步地，该生产粘康酸的制备方法包括：
[0015]
将所述工程菌进行活化和扩大培养，先接种于lb培养基中过夜培养，之后按1:100比例将过夜培养物转接入tb培养液中培养，然后加入诱导剂iptg进行诱导培养，离心收集细胞；
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采用ph＝8的磷酸盐缓冲液反应体系，在30℃下催化香兰酸反应为粘康酸，以液相色谱检测粘康酸产量。
附图说明
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图1为根据本发明实施例的vanab、gdc、cata三种酶催化合成粘康酸的路径；
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图2为根据本发明实施例的大肠杆菌重组菌株在不同底物浓度下生成粘康酸的得率与时间曲线图；
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图3为根据本发明实施例的大肠杆菌重组菌株在高浓度25mm(a)以及50mm(b)底物浓度通过分批补料生产粘康酸的时间曲线图；
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图4为根据本发明实施例的大肠杆菌重组菌株在保持ph体系稳态下生产粘康酸的时间曲线图；
[0021]
图5为根据本发明实施例的大肠杆菌重组菌株在保持ph体系稳态下生产粘康酸的hplc验证图。
具体实施方式
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以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步
id no:8所示序列为引物(表1)，pcr扩增gdc(seq id no:11)和cata(seq id no:12)基因片段，pcr扩增条件：98℃2min，98℃10s，58℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min；将pcr扩增所得的gdc和cata基因片段用bsai酶切，随后连接进入经过bamhi和xhoi双酶切的表达载体prsfduet-1，得到质粒prsf-gdc-cata。
[0037]
3、获取大肠杆菌重组菌株
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将上述1和2获取的pacyc-vanab质粒和prsf-gdc-cata质粒导入大肠杆菌de3菌种中，在含有氨苄霉素、卡纳霉素抗生素的培养基中筛选，获取大肠杆菌重组菌株。
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表1：pcr扩增所用引物
[0040][0041][0042]
实施例2全细胞生物转化重组菌株
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将实施例1制备的大肠杆菌重组菌株按1:100体积比接入tb培养液中扩大培养至od
600
达0.4-0.6后，加入0.5mm iptg后低温诱导蛋白表达24h，在7000rpm离心10min后获取菌体。按1ml的反应体系催化(10g/l菌体量、5～25mm香兰酸底物)，最后加入磷酸缓冲液(200mm，ph＝8.0)补齐，在30℃，250rpm全细胞催化1-24h后，采用液相色谱检测粘康酸产量。
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产品定量分析：转化液采用shimadzu高效液相色谱仪检测分析，采用光电二极管阵列检测器(工作波长210nm)、shimadzu c18色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温40℃、进样量10μl；流动相：70％双蒸水，0.1％三氟乙酸，30％乙腈。
[0045]
结果如图2所示，以5mm香兰酸为底物，10g/l菌体量全细胞催化4h后，得到5.1mm粘康酸，摩尔收率>99％；以10mm香兰酸为底物，全细胞催化8h后，得到10.1mm粘康酸，摩尔收率为>99％；以25mm香兰酸为底物，10g/l菌体量全细胞催化12h后，得到17mm粘康酸，摩尔收率为68％。
[0046]
结果如图3所示，通过每隔1.5小时补料10mm的香兰酸底物的分批补料的方式可以有效提高以25mm香兰酸(a)为底物全细胞催化效率；以50mm香兰酸(b)为底物，每隔1.5小时补料10mm的香兰酸分批补料方式，尚有香兰酸残留。
[0047]
结果如图4所示，在保持ph稳态(ph＝8.0)的情况下，以50mm香兰酸为底物，每隔1.5补料10mm的香兰酸的分批补料的方式可获得粘康酸>87％的摩尔收率。结果如图5所示，hplc分析显示30小时后底物香兰酸被彻底转变为粘康酸。
[0048]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示
例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0049]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。