通过木质纤维素原材料的纤维素和半纤维素的顺序酶水解来生产特别是乙醇的方法与流程

一般地，各种生物质源的组合物在解剖体和结构方面表现出很大的异质性，但是它们还表现出一定程度的不变性，也就是存在三种主要的大分子化合物，纤维素、半纤维素和木质素。

纤维素是线型葡萄糖聚合物，和因此是发酵性糖的潜在来源；半纤维素是杂聚物，其最具代表的单体是包含五个碳原子的C5糖(木糖，阿拉伯糖)和易被多种微生物代谢；而木质素是复杂的三维杂聚物，其天然降解是长且复杂的过程，且至今被认为希望从中通过水解得到任何工业生产过程是不现实的。

木质纤维素的特异性要求，特别是出于例如由上述发酵性糖生产乙醇的目的，进行预处理以解决使纤维素可接近旨在特别是溶解半纤维素和木质素的酶试剂的问题。

本申请人CIMV是专门从事处理和开发木质纤维素植物原材料的公司。

就此而言，本申请人已提交且是涉及用于通过在甲酸/乙酸介质中分馏木质纤维素植物材料生产纸浆、木质素、糖和乙酸的方法(WO-A1-00/68494)的各种专利申请和专利的所有人。

本申请人还是涉及用于预处理木质纤维素植物材料以生产生物乙醇的方法(WO-A2-2010/006840)的专利申请和/或专利的所有人。

这样的预处理过程特别地可使得在经济工业条件下由木质纤维素植物原材料(MPVL)首先获得表现出用于其随后酶水解的最佳条件的基本上由脱纤维的纤维素构成的基质，和由源自半纤维素的甘蔗糖蜜构成的第二基质，其水解产物不含糠醛。

因此，本申请人已经提出用于由木质纤维素植物原材料生产生物乙醇的方法，其包括预处理MPVL、酶水解经预处理的材料和酒精发酵由水解步骤所得的产物的连续步骤。

本申请人特别提出用于由木质纤维素植物原材料生产生物乙醇的方法，其包括以下的连续步骤：

-a)预处理木质纤维素植物原材料以便分离包含在该木质纤维素植物原材料中的纤维素、半纤维素和木质素，所述预处理包括以下的连续步骤：

·(i)通过在包含甲酸、乙酸和水的混合物的存在下将木质纤维素植物原材料置于在95℃和110℃之间的反应温度下而使木质纤维素植物原材料解构；

·(ii)然后，在大气压力下和在任何水解然后发酵作用之前分离：

*一方面，基本由所述纤维素(C6糖)组成的固体相，其能够然后被水解和发酵用于生产乙醇；

*和另一个方面，特别是在含水溶液中包含甲酸、乙酸、木质素和半纤维素(C5糖)的液体相；

-b)酶水解所述固体相；

-c)酒精发酵由所述水解步骤所得的产物，其能够被发酵用于生产乙醇。

该方法特别详细地描述于文献EP-2235254(WO-A1-2009/0927498)中。

该方法提出完全不同于现有技术的方法，其通过在酸/水介质中溶剂分解来分离三种生物聚合物，这可在纤维素和半纤维素的水解然后发酵的任何作用之前，分离具有高附加值的线型、非重组、低分子量的木质素。

该方法可获得工业性能水平，而不管所使用的植物的性质，和因此在用于打开新开发的一年生植物的情况下，特别地在谷物秸秆和甘蔗渣或糖高粱渣的情况下是特别有利的，所述开发加入由本申请人在涉及用于通过在甲酸/乙酸介质中分馏木质纤维素植物材料生产纸浆、木质素、糖和乙酸的方法的国际申请WO-A1-00/68494中已经提出的那些。

例如，通过CIMV“精炼”方法源自植物材料(例如源自麦秆)的纤维素的量和在酶水解之后存在的聚葡糖的量如下:

-CIMV方法的纤维素级分产率：包含88wt％的纤维素的生物质(谷物秸秆情况)的48wt％，即生物质的42wt％(以重量计)；

-葡萄糖产率：生物质的44％(重量比)；

-纤维素醇产率：生物质的21％(重量比)。

通过CIMV精炼方法分离的包含半纤维素的物流表示大约20％的发酵性糖的潜力。

这些发明(CIMV方法)旨在改进由MPVL生产乙醇，和特别是水解纤维素以产生发酵性糖的工业条件。

通常和以已知的方式，由MPVL生产乙醇的方法考虑数个参数。

在这些参数中，特别确定木质素可以是酶的抑制剂和需要预处理木质纤维素基体以便使得纤维素和半纤维素水解。

由于它们的化学组成，木质素聚合物具有不溶性和高度反应性。

因此，木质素的存在加强了纤维素-半纤维素网络，和它们阻碍酶的渗透和作用，要求水的存在。

当与化学水解比较时，由于各种原因，特别地因为经济评估的结果有利于酶水解，酶水解纤维素是获得发酵性糖的推荐方法。

此外，酶水解产生少量待处理的流出物和没有腐蚀问题。

实际的酶水解通过使经预处理的植物原材料与酶溶液简单接触来进行，同时确保悬浮液均匀和维持最佳条件，所述条件例如对于T.reesei纤维素酶为在45℃和50℃之间的温度和约4.8的pH。

酶作用时间取决于所用酶的量和取决于酶的特定活性。

在酶水解过程中，还原糖基本上以葡萄糖的形式释放。

纤维素降解中涉及的酶，通常称为纤维素酶，为各种类型和具有各种来源和它们的特征特别是它们的活性。

纤维素酶的成本相对高和构成通常被评为由MPVL生产生物乙醇中最贵的要素。

因此，已进行了大量的努力来确定酶水解的机理以改进它，它是可溶性蛋白对不溶性和“耐火”基质的作用的复杂的过程。

酶水解过程的效率和盈利性的另一参数为水解时间，它可以相对长，为48-72小时。

为了改进酶水解纤维素的效率，本申请人CIMV已在文献WO-A2-2012/049054中提出了用于生产乙醇的方法，其特征在于它包括在酶水解纤维素的步骤之前部分去除木质素的步骤以获得木质素的残余整体水平，其表示为重量百分比(wt％)，它为非零且包括在由分别等于0.30％和4％的下限和上限确定的范围内。该方法的总效率相似或基本上等于由MPVL生产理论最大水平的乙醇，此外，无论整个方法根据该方法首先使用酶水解步骤和然后发酵步骤，还是同时进行水解和发酵(SSF方法)，该效率相同。

这样的相同效率是由于根据该方法的酶水解纤维素不能产生发酵抑制剂的事实。此外，显示出该方法的优点(整体木质素水平和特定再酸化条件)未改变，即具有相同性质和具有相同值，无论所用的纤维素酶，和无论是否涉及更低或更高效率的纤维素酶。

当通过酶水解将纤维素水解为葡萄糖时，葡萄糖以与例如由淀粉所得的葡萄糖一样的方式进行发酵。

使用MPVL作为初始基质所特定的已知问题依然存在，例如可能存在由半纤维素和木质素所得的有毒的化合物和抑制剂，和还可能在单一步骤中进行酶水解和发酵。

水解产物中存在的抑制剂源自糖的降解(至糠醛)，所述糖存在于半纤维素和来自木质素。

抑制剂的存在取决于MPVL的性质和其预处理的条件。

除了由糠醛抑制酶以外，注意到各种抑制剂的组合效果。

已提出了根据称为SSF(同时糖化和发酵)的方法在相同反应器中同时实施水解和发酵操作，所述方法的第一优点看上去是显著的，因为它要求单一设备，但是所述方法要求使用酶和酵母在相同物理化学环境中工作。

然而，它们的最佳温度相对离得很远(对于酵母30℃和对于纤维素酶50℃)。

因此，SSF的发展需要能够在高很多的温度下发酵的酵母菌株的发展。

就根据“SSF”(“同时糖化和发酵”)方法(其包括在单一步骤中进行酶水解和乙醇发酵)同时进行发酵和水解而言，它的主要优点在于通过消除预先进行酶水解所需的操作的投资降低，和不存在由葡萄糖的纤维素酶抑制，所述葡萄糖在它出现时被发酵性微生物消耗。

这导致整体乙醇生产力和水解的水平和速率的提高。

此外，降低了富含葡萄糖的水解产物的微生物污染的风险。

然而，显而易见的是由SSF方法提供的获益，特别是从经济角度来看，要求某些方面需要被优化，特别是初始固体浓度，以获得高浓度的乙醇。

根据共发酵的另一概念，可以提出在单一步骤中组合由预处理所得的C5糖与酶水解产生的C6糖的糖化和共发酵。

然而，这样的SSCF(同时糖化和共发酵)方法要求废除这样的机理，其中几乎所有的微生物处于适当位置以便在糖的混合物的存在下在其它糖同化之前系统地促进葡萄糖同化。

因此，从现有技术已知的各种选项的可能组合自然出现了两种不同的工业工艺方案。

第一方案提供了在预处理步骤结束时分离C5糖，该C5糖物流单独发酵和它可用于任选用于生产纤维素酶的一种级分，它可用于由预处理所得的待被SSF方法处理的不溶性级分(纤维素+木质素)。

第二方案显然更简单，基于SSCF，要求能够同时发酵C5和C6糖并恰好具有相同效率的微生物(或微生物的混合物)的可用性。

这是因为代谢速率的不同使得需要延长发酵直到代谢最慢的糖耗尽，由此导致用于生产、特别是用于在生物乙醇生产的情况下发酵的整个工业设备使用不足。

为了在所述方法的可行性和盈利性方面采取决定性步骤，本发明以已知的方式提出了新的方法，其基于第一预处理部分导致纤维素、半纤维素和木质素的分离，和然后惊奇地顺序水解C6和C5多糖，导致获得最终水解产物(或共水解产物)，其特别地根据所用的酵母特别地能够被发酵用于生产生物乙醇或任何其它产物。

出于该目的，本发明提出了用于由木质纤维素植物原材料(MPVL)生产产物如生物乙醇的方法，其包括以下步骤：

-a)预处理木质纤维素植物原材料以便分离包含在该木质纤维素植物原材料中的纤维素(C6)、半纤维素(C5)和木质素，所述预处理包括以下的连续步骤：使木质纤维素植物原材料解构，然后分离一方面能够然后被水解(和发酵用于生产生物乙醇)的纤维素(C6)和另一个方面能够然后被水解的半纤维素(C5低聚糖)；

-b)酶水解纤维素(C6)；

-c)酶水解半纤维素(C5)；

其特征在于水解纤维素和水解半纤维素根据以下的连续步骤以顺序方式进行：

-i)通过至少一种酶(纤维素酶)开始酶水解纤维素(C6)达第一时间(T1)以获得中间水解产物；

-ii)将半纤维素(C5)加入所述中间水解产物；

-iii)继续酶水解混合物直到在酶水解的总时间(T2)结束时获得最终水解产物。

例如，对于一公吨的构成木质纤维素植物原材料的秸秆，根据本发明的方法可使得增加大约20％的所产生乙醇的量。

因此，可以清楚地看到，以顺序和受控方式“组合”由生物质精炼所得的两种初始不同物流的优点，同时提高总产率和消除单独处理两种糖物流的生产单元的操作成本和设备的一部分。

有利地，和特别是为了能够容易实施该方法，通过免除粘度问题同时加工具有高固体含量的纤维素，所述酶水解纤维素的步骤i)包括以下：

i1)将所述至少一种第一酶引入反应器；

i2)添加纤维素的第一部分直到获得固体(MS)含量在10wt％和15wt％之间的混合物；

i3)使混合物水解在六小时和十五小时之间的时间；

i4)在数个步骤中添加纤维素的剩余部分以获得在20wt％和25wt％之间的最终固体(MS)含量。

根据所用的酶或酶的混合物，所述酶水解纤维素的第一时间(T1)在二十小时和四十小时之间。

所述酶水解纤维素的第一步骤i)例如在45℃和55℃之间的温度下进行。

纤维素的固体含量在10wt％和25wt％之间。

纤维素的固体含量优选大于20wt％。

在引入所有待水解的纤维素之后，所述添加半纤维素的步骤ii)在单一步骤中进行。

所述添加半纤维素的步骤ii)还包括同时添加特别能够水解半纤维素的另一酶。

所述包括继续酶水解的步骤iii)在45℃和55℃之间的温度下进行。

半纤维素的固体含量在20wt％和35wt％之间。

顺序酶水解纤维素和顺序酶水解半纤维素的总时间(T2)在四十八小时和七十二小时之间。

所述至少一种酶为能够水解纤维素的酶，特别是纤维素酶，例如，Cellic CTec^TM加Htec^TM(来自Novozyme)或CMAX^TM(来自Dyadic)。

所述至少一种酶为能够水解纤维素和半纤维素的酶的混合物，例如，Cellic CTec^TM加Htec^TM(来自Novozyme)或CMAX^TM(来自Dyadic)。

所述其它酶为能够水解半纤维素的酶，例如，Cellic Htec^TM(来自Novozyme)或CMAX^TM(来自Dyadic)。

该方法包括在所述将半纤维素(C5)加入所述中间水解产物的步骤ii)之前从包含半纤维素的相至少部分去除木质素的步骤。

根据本发明的方法包括以下的连续步骤：

·(j)通过在包含甲酸、乙酸和水的混合物的存在下将木质纤维素植物原材料置于在95℃和110℃之间的反应温度下而使木质纤维素植物原材料解构；

·(jj)然后，在大气压力下和在任何水解作用之前分离：

*一方面，基本由所述纤维素组成的固体相，其构成能够然后被水解的第一共基质；和

*另一个方面，特别是在含水溶液中包含甲酸、乙酸、木质素和半纤维素的液体相，其构成能够在分离酸和分离木质素之后然后被水解的第二共基质。

对于生产生物乙醇，该方法包括酒精发酵最终水解产物的额外步骤。

如上所述，例如，对于一公吨的构成木质纤维素植物原材料的秸秆，根据本发明的方法可使得增加大约20％的所产生乙醇的量。

通过水解C6和C5糖的两种物流，可以移动包含在两种物流中的糖和获得满意的发酵产率。

研究了移动这些C6和C5糖的数种可能性：

a)水解和发酵经分离的C6和C5物流或流；

b)单独水解两种C6和C5物流，之后共发酵两种共水解产物；

c)共水解C6和C5物流，和发酵共水解产物。

a)水解纤维素+发酵纤维素，水解和发酵C5低聚糖(糖汁)+发酵木糖。

a-i)在高浓度(高于20％)下水解和发酵纤维素至乙醇:

-水解，具有95％的产率

-以0.48的转化率将葡萄糖发酵至乙醇。

因此，达到每kg生物质总共0.21kg乙醇。

a-ii)水解和发酵C5糖浆：包含在糖汁中的低聚糖的水解可以以小于20％的干物质进行；低聚糖水解产率低于50％：参见图1。

但是该C5糖物流的发酵不具有发酵性或具有差的发酵性。

事实上，发酵该物流需要包括层析纯化步骤，这使得除去部分的酵母抑制剂。在没有这样的纯化的情况下，糖浆不具有发酵性。

在这种情况下，这意味着可以产生的乙醇的量为由纤维素级分获得的乙醇的量，即为生物质的21wt％。

因此，达到每kg生物质总共0.21kg乙醇。

b)在对于每种20％的干物质(MS)的浓度下单独水解两种物流和共发酵:

在这种情况下，产生乙醇的量以及乙醇浓度相对低。

因此，达到每kg生物质总共0.24kg乙醇。

c)共水解和共发酵C6和C5的共水解产物:

在共水解的情况下，可以以大于22％的浓度使用糖汁(C5)，以获得最浓缩的可能共水解产物；由此在共水解之后获得的发酵性糖的量(重量比为65/35)高于180g/升和乙醇产率为约0.47-0.48g/l。

参见图2。

因此，达到每kg生物质总共0.265kg乙醇，即所产生乙醇的量的大于20％的增加。