一种耐高温耐强碱木聚糖酶及其在废纸脱墨中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种耐高温耐强碱木聚糖酶及其在废纸脱墨中的应用。
【背景技术】
[0002]半纤维素是仅次于纤维素的第二丰富的可再生资源，其高效应用对于人类解决当前资源危机、能源危机、环境污染等问题具有极其重要的意义。半纤维素结构与组成十分复杂，包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖等多种组分。其中木聚糖是细胞中最具代表性的半纤维素，它可以作为再生资源被人们利用。木聚糖是一种复杂的多聚五碳糖，主要由β -1，4-D-木糖苷键连接起来，并带有多种取代基，它的完全降解需要多种水解酶的协同作用。其中最主要的糖苷水解酶是内切-β_1，4-木聚糖酶，它可以降解木聚糖主链的β_1，4-糖苷键。目前木聚糖酶在造纸、食品、饲料、生物转化等行业得到了日益广泛的应用。在造纸工业中，木聚糖酶可以应用于生物制浆，纸浆漂白，废纸脱墨处理等，尤其在废纸脱墨中，与传统的化学脱墨法相比，利用木聚糖酶进行脱墨，不需要大量的化学药品，因而对环境的影响较小，脱墨废水的B0D和C0D也较低，而且酶法脱墨的效果与化学法相近，但纤维的物理性能则优于化学法脱墨，因此具有很好的发展前景。
[0003]在用木聚糖酶脱墨之前，纸浆处于大约高温(55_70°C )及高碱性pH (pH9_ll)下。高温和高碱性状态对木聚糖酶制剂提出了严格的要求。许多可商购的野生型木聚糖酶的缺点是这些酶呈现酸性的最佳pH及大约55°C的最佳温度，因而会大大影响脱墨的效果。因此获得新型的具有耐高温及高碱性的木聚糖酶的研究具有重要的价值。
[0004]Planomicrobium glaciei CHR43是一种极端嗜冷菌，由于其独特的生存能力，我们推测来自于这种细菌的木聚糖酶很可能具有耐高/低温和高pH适应性。目前关于来源号Planomicrobium glaciei CHR43的木聚糖酶基因及其表达与应用还没有相关的报道。
【发明内容】
[0005]为了弥补现有木聚糖酶温度和pH不能满足工业需求的不足，本发明提供一种耐高温耐强碱木聚糖酶及其在废纸脱墨中的应用。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
一种耐高温耐强碱木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]编码所述耐高温耐强碱木聚糖酶的基因xynl，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]一种重组质粒，它包含所述的耐高温耐强碱木聚糖酶基因。
[0009]一种重组菌，它含有所述的重组质粒。
[0010]耐高温耐强碱木聚糖酶的制备方法，在营养培养基中培养所述的重组菌，收集具有耐高温耐强碱木聚糖酶活性的多肽。
[0011]所述耐高温耐强碱木聚糖酶在废纸脱墨中的应用。将待脱墨的废纸放入含有
0.6-1.2 U/mg耐高温耐强碱木聚糖酶的缓冲溶液中，在50-90°C，pH5.0-12.0条件下进行脱墨反应。
[0012]进一步优选为，将待脱墨的废纸放入含有1 U/mg耐高温耐强碱木聚糖酶的缓冲溶液中，在80°C，pH9.0条件下进行脱墨反应。
[0013]应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的耐高温耐强碱木聚糖酶还包括由SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID N0.1所示的蛋白质衍生的蛋白质。例如通过在末端添加标签序列，如His-tag或Strep-tag而衍生的蛋白质。
[0014]优选的，耐高温耐强碱木聚糖酶的衍生蛋白的氨基酸序列与SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的同源性可为70 %以上，优选80 %以上，更优选90 %以上。
[0015]本发明还提供的含有所述基因或基因簇的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
[0016]本发明中，耐高温耐强碱木聚糖酶基因是通过如下方法获得的:利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库，分析、筛选、发现glaciei CHR43中有一段序列与sp.Strain NG-27中的木聚糖酶(Genbank号:AAB70918)序列具有较高同源性，很有可能是编码木聚糖酶的基因序列。对该序列进行筛选、优化(优化包括部分位点的突变、插入等)，得到具有SEQ ID N0.2的核苷酸序列。耐高温耐强碱木聚糖酶xynl基因由金斯瑞公司按照SEQ ID N0.2核苷酸序列进行人工合成，在序列两端分别添加BamHI和Xho I酶切位点，连接至pETDuet-Ι质粒载体上的BamH I和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒 pETDuet-1-xynlo
[0017]转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选并通过测序鉴定阳性重组质粒，提取重组质粒，转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，获得含有重组质粒的重组工程菌大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)。
[0018]本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知的方法对多核苷酸进行修饰，以增强本发明多核苷酸在体内的活性或者存活期。
[0019]本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。
[0020]重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，这些方法包括:氯化钙热激法，电转化法，PEG介导法，基因枪法等。
[0021]本发明提供制备上述耐高温耐强碱木聚糖酶表达和纯化的方法。将获得的重组工程菌大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)转接培养，IPTG诱导酶蛋白表达。通过超声波破碎细胞，高速离心和N1-NTA sepharose4B亲和层析分离纯化；然后通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白分子大小；最后浓缩，测定蛋白浓度，分析蛋白的酶学性质。本发明提供的耐高温耐强碱木聚糖酶在PH5.0-12.0范围内保持较高活性，最适pH为9.0 ;在50_90°C保持较高活性，适宜反应温度是80°C。
[0022]有益效果:
本发明从极端嗜冷菌glaciei CHR43中获得一种木聚糖酶基因，利用密码子优化技术进行筛选、优化得到耐高温耐强碱木聚糖酶基因，并通过表达获得相关酶蛋白。在大肠杆菌中的高表达，表达的木聚糖酶无纤维素酶活性，具有耐高温、耐高碱性质；该木聚糖酶可应用于废纸脱墨，且具有比商业酶更高的效率，表现出良好的工业应用价值。
[0023]本发明提供的木聚糖酶的最适pH是9.0，最适宜反应温度是80°C，并且有较好的耐高温性和高碱性。同时，该木聚糖酶对废纸具有很好的脱墨效率，和购于上海源叶生物科技有限公司的商业酶(型号:MF⑶00132594) (157%)相比，达到了 298%，且高于目前已报道的来自于sp.CKBxlD 的木聚糖酶(200%) (Maity et al.Applied B1chemistryand B1technology.2012, 167: 1208-1219.)。
【附图说明】
[0024]图1耐高温耐强碱木聚糖酶表达并纯化后的SDS-PAGE分析，其中:1为耐高温耐强碱木聚糖酶表达纯化后的条带；M为蛋白分子量标准。
[0025]图2 pH对耐高温耐强碱木聚糖酶活性的影响及其pH稳定性。
[0026]图3温度对耐高温耐强碱木聚糖酶活性的影响。
[0027]图4耐高温耐强碱木聚糖酶的热稳定性。
[0028]图5酶法脱墨后的废纸表面形态，其中:A为对照组；B为本发明耐高温耐强碱木聚糖酶组；C为商业酶组。
【具体实施方式】
[0029]本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，