一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制备方法

专利名称：：一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制备方法
技术领域：
：本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，涉及一种编码高温强碱下具有木聚糖酶活性的改良基因、含有该改良基因的载体、基因工程菌株，该基因的制备和表达方法和菌株的制备方法。
背景技术：
：木聚糖酶[EC.3.1.2.8]以内切方式水解木聚糖分子中e-1.4-糖苷键，其水解产物主要是木二糖和木寡糖，在纸浆造纸、动物饲料、食品工业和能源工业具有很大的应用前景。木聚糖酶在造纸工业中可作为纸浆漂白助剂，不仅可以提高纸张的白度和强度，更可以减少传统漂白剂氯化物和次氯化物的排放，大大减少环境污染；在动物饲料中加入木聚糖酶，可以降解木聚糖，提高非反刍类动物对饲料的利用率；木聚糖酶能分解制备酒类和饮料的原料中所含有的一些非淀粉类多糖物质，达到澄清饮料和酒类的目的；木聚糖酶用于加工面包食品时，可以分解部分麸质物质，改变面包的松软度，大大提高口感；同时，木聚糖酶分解木聚糖所产生的低聚木糖是很有效的双歧因子，在人体的大肠中可以促进双歧杆菌等益生菌的增殖，调整菌群平衡，改善肠道功能，抑制肠道腐败，降低血脂胆固醇，增强机体的免疫功能。目前人们已经从真菌、放线菌、细菌等多种微生物中分离克隆了大量木聚糖酶的编码基因。这些天然来源的木聚糖酶的最适反应温度大多在50-60。C左右，最适反应pH值大多在4.0-6.O(刘亮伟eta丄，河南农业科学，2006,Vol6，14-18)，其酶学特性往往不能满足工业生产和应用的需要。例如在纸浆和造纸工业中，要求木聚糖酶在较高的温度(60-65°C)和较高的pH值(10-11)下对木材进行处理(PickersgillR.W.eta丄，Proteins，1997，Vol29，77-86),这就对木聚糖酶的物理化学的稳定性提出了更高的要求。
发明内容本发明的第一个目的是获得一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因。本发明的第二个目的是获得表达上述木聚糖酶改良基因的基因工程菌株。本发明的第三个目的是提供上述木聚糖酶改良基因和菌株的制备方法。本发明利用分子定向进化技术获得了一种木聚糖酶改良基因(Xyn-CDBFV-G201C)，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其核苷酸编码序列如SEQIDNO1所示。本发明获得了一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因。作为改良基础的木聚糖酶C(Xyn-CDBFV)(EMBLAccNo.AF123252)来源于牛瘤胃真菌(psWcisr咖)(Xiu"s丄，Can.J.Microbiol.1999,Vol45,970-974)，该木聚糖酶基因最适反应温度是62X,最适反应pH值6.0(Chen"s丄，Can.J.Microbiol.2001，Vol47,1088-1094)。本发明将原木聚糖酶(Xyn-CDBFV)的601位的核苷酸由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，相应的，201位的氨基酸残基由甘氨酸突变为半胱氨酸。分子动力学模拟以及定点突变实验结果均显示出在改良木聚糖酶中，201位与50位半胱氨酸形成二硫键(见图1和2)，该二硫键导致改良木聚糖酶热稳定性较原始木聚糖酶高。本发明提供了一种含有上述木聚糖酶改良基因的核苷酸编码序列的质粒。该质粒可以是原核或者真核质粒。将含有本发明的木聚糖酶改良基因编码序列通过常规方法克隆至载体的多克隆位点，即可形成重组载体质粒。本发明的质粒可以是原核质粒，例如大肠杆菌表达质粒，例如PET21a，PET30a等。该质粒也可以是真核表达质粒，例如酵母表达质粒。例如，该质粒可以是毕赤氏酵母表达质粒。比如pPIC9k,pPIC9等。本发明还提供了一种含有上述表达质粒的酵母基因工程菌株。该菌株可以采用毕赤氏酵母基因工程菌株。例如，PichiapastroisGS115,SMD1168等，用电转化等常规方法将含有本发明的木聚糖酶改良基因编码序列导入酵母菌株，通过筛选可以获得含有目的基因的菌株。该菌株在摇瓶中发酵、分泌表达木聚糖酶，表达水平可以达到5000-10000U/ml。本发明还提供了上述木聚糖酶改良基因的制备方法，即以Xyn-CDBFV基因为模板，将其核苷酸编码序列第601位由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。也可以以Xyn-CDBFV基因为模板，进行随机突变，通过筛选较高温度(65-80°C)条件下，耐受性最佳即残余活性最高的突变体而得。本发明还提供了基因工程菌株的制备方法，木聚糖酶改良基因的核苷酸编码序列的酵母表达质粒转化酵母菌即可。该菌株可以采用毕赤氏酵母基因工程菌株。例如，PichiapastroisGS115,SMD1168等。转化可以采用常规方法，如电转化等。本发明的实施例中，通过常规基因克隆技术将该改良木聚糖酶基因克隆至毕赤氏酵母表达载体pPIC9k(也可以是pPIC9)中，获得含有该改良木聚糖酶基因的重组毕赤氏酵母表达质粒和重组毕赤氏酵母工程菌株。该重组毕赤氏酵母表达质粒为pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C，重组毕赤氏酵母工程菌株是含有pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C质粒的GS115工程菌株。本发明获得了一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因。改良后的木聚糖酶较原木聚糖酶具有更好的热稳定性，在75。C处理10min后，原始木聚糖酶的残余相对活性为15%左右，而改良木聚糖酶达到了80%。同时，改良木聚糖酶在高温强碱的环境下的酶活是原木聚糖酶的1.5-2倍，并能在高温下长时间分解木聚糖。本发明还提供了上述木聚糖酶改良基因的表达质粒及其酵母基因工程菌株。该工程菌株的表达产物分泌到胞外，有利于木聚糖酶的提取。本发明的木聚糖酶改良基因能够在纸浆造纸、动物饲料、食品工业和能源工业中，更好的满足工业化生产需要。图1是木聚糖酶及其突变体经DTT处理后残余活性比较图。"+"为DTT(二硫苏糖醇，是一种还原剂，可以打开蛋白中存在的二硫键)存在情况，"-"为不使用DTT。图中残余相对活性代表了75。C处理10min后与处理前的比值，即以未进行热处理的酶测得的活性作为100%。该图表明，G201C突变体可以大大增加残余相对活性。由图判断，改良的木聚糖酶201位与50位半胱氨酸形成二硫键，而不是201与60位半胱氨酸形成二硫键，也不是50与60位半胱氨酸形成二硫键。其中，C60A即原始木聚糖酶氨基酸序列60位的半胱氨酸变为丙氨酸的突变体蛋白；G201C是原始木聚糖酶氨基酸序列201位的甘氨酸变为半胱氨酸的突变体蛋白，即本发明的改良木聚糖酶；C60A-G201C是原始木聚糖酶氨基酸序列60位的半胱氨酸变为丙氨酸并且201位的甘氨酸变为半胱氨酸的突变体蛋白。图2是三个可能存在的蛋白模拟结构与各自模拟的初始结构的均方根偏差(RootMeanSquareDeviation)比较结果图。条件为60°C。该图显示，201位与50位半胱氨酸形成二硫键的蛋白模型的模拟结构与其初始结构的均方根偏差值最小，表明该模型的结构最稳定。横坐标为时间，以ps(即10—e秒)为单位。50ss201表示50位和201位半胱氨酸形成二硫键，其它的依次类推。图3:在pH4.0的50mM柠檬酸缓冲液中，大肠杆菌重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同温度下的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%，原始木聚糖酶以67T测得的酶活作为100%，改良木聚糖酶以77"C测得的酶活作为100%。图4:在pH5.0的50mM拧檬酸缓冲液中，大肠杆菌重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同温度下的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%，原始木聚糖酶以67"C测得的酶活作为100%,改良木聚糖酶以67X测得的酶活作为100%。图5:在pH6.0的50mM柠檬酸缓冲液中，大肠杆菌重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同温度下的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%，原始木聚糖酶以62X测得的酶活作为100%,改良木聚糖酶以67"C测得的酶活作为100%。图6:在pH4.0的50mM柠檬酸缓冲液中，毕赤氏酵母重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同温度下的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%，原始木聚糖酶以67°C测得的酶活作为100%，改良木聚糖酶以67T测得的酶活作为100%。后缀Y表示酵母毕赤氏分泌表达的蛋白。图7:在pH5.0的50mM拧檬酸缓冲液中，毕赤氏酵母重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同温度下的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%，原始木聚糖酶以72T测得的酶活作为100%，改良木聚糖酶以77。C测得的酶活作为100%。后缀Y表示毕赤氏酵母分泌表达的蛋白。图8:在pH6.0的50mM柠檬酸缓冲液中，毕赤氏酵母重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同温度下的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%，原始木聚糖酶以67"C测得的酶活作为100%，改良木聚糖酶以72。C测得的酶活作为100%。后缀Y表示毕赤氏酵母分泌表达的蛋白。图9:60。C，在不同pH值环境中，大肠杆菌重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%，原始木聚糖酶以在pH5.2的柠檬酸缓冲液中测得的酶活作为100%,改良木聚糖酶以在pH5.2的柠檬酸缓冲液中测得的酶活作为100%。图10:65。C，不同pH值环境中，毕赤氏酵母重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)的相对活性的比较结果图。以各自最高的酶活作为100%,原始木聚糖酶以在pH6.2的磷酸钠缓冲液中测得的酶活作为100。i，改良木聚糖酶以在pH6.2的磷酸钠缓冲液中测得的酶活作为100%。后缀Y表示毕赤氏酵母分泌表达的蛋白。图11:75°C，在pH5.0的50mM柠檬酸缓冲液中，大肠杆菌重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)持续分解木聚糖能力的比较结果图。以最初5分钟所产生的产物量作为100%。图12:80°C，在pH5.0的50mM柠檬酸缓冲液中，毕赤氏酵母重组表达制备的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)持续分解木聚糖能力的比较结果图。以最初5分钟所产生的产物量作为100%。后缀Y表示毕赤氏酵母分泌表达的蛋白。具体实施例方式所用实验材料和相关操作方法如下(未详述处可以参考冷泉港实验室的《分子克隆》)1:菌株，载体和基因大肠杆菌菌株E.coliB121(DE3)和ToplO，质粒PET21a，酵母菌株PichiapastroisGS115,酵母表达载体pPIC9k，木聚糖酶基因(Xyn—CDBFV)(EMBLAccNo.AF123252)(Cheneta丄，Can.J.Microbiol.2001，Vol47,1088-1094)均为本室保存，与现有文献中相应物质的性质相同。2:酶与试剂盒限制性内切酶，连接酶购自TaKaRa公司，随机突变PCR试剂盒GeneMorphII购自Stratagene公司，质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自博大公司(上海)。3:培养基大肠杆菌培养基为LB(1%Polyp印tone，1%NaCl,0.5%YeastExtract,pH7.0，氨苄选择性的培养基中Ampicillin终浓度为100fig/mL，固体培养基添加1.5%琼脂)，酵母完全培养基为YEPD(1%YeastExtract,2%Polyp印tone，2%Glucose,固体培养基添加1.5%琼脂)，酵母转化培养基为MD(1.34%YNB，2%Glucose,0.4mg/L生物素，固体培养基添加1.5%琼脂)酵母诱导培养基BMGY(1%YeastExtract,2%Polyp印tone，1.34%YNB，0.4mg/L生物素，1%甘油)和BMMY(1°/。YeastExtract,2%Polyp印tone，1.34YNB,0.4mg/L生物素，0.5%甲醇)4:生化试剂引物购自Invitrogen公司，IPTG购自Sigma公司，TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺以及甲叉双丙烯酰胺购自Premega公司，DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂(甲液溶解6.9克结晶酚于15.2ml10MNa0H中，用蒸馏水稀释至69ml，再加入6.9克NaHS03;乙液255克酒石酸钾钠加至300ml10%Na0H中，再加入880ml1%3，5-二硝基水杨酸溶液；将甲液与乙液相混合即得到黄色DNS试剂，储于棕色瓶中，在室温下放置7-10天后使用)5:酶蛋白在大肠杆菌系统的表达及纯化将含有酶基因的PET21a质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，涂布于LA平板，37X倒置培养至转化子出现，用牙签挑取一个单克隆转化子接种至3mlLA(LB培养液+100^g/ml氨节霉素)培养液中，37°C,220rpm培养过夜，次日取0.5ml过夜菌至50mlLA+1%Glucose中，37°C，220rpm培养,当菌密度(OD.600)达到0.4-0.6，加入终浓度为0.lmM的IPTG，22度，220rpm继续培养10小时。离心收集菌体，用pH7.4,50mMTris-HC1重悬菌体，超声破碎大肠杆菌细胞，高速离心收集上清，Ni-NTA柱结合C端含有6*His标签的酶蛋白，用梯度浓度的咪唑洗脱结合在Ni-NTA柱上的酶蛋白。实施例l通过定向进化技术获得改良木聚糖酶基因设计PCR引物XynFl和XynRl如下XynFl:GGCGGATCCATGCAAAGTTTCTGTAGTTCAGCTTCTCAC(正向引物，下划线的序列为BamHI酶切识别序列)，即SEQIDNO3。XynRl:GCGGCGGCCGCATCACCAATGTAAACCTTTGCGTAT(反向引物，下划线的序列为NotI酶切识别序列，不含终止密码子，利用载体上的终止密码子终止表达)，即SEQIDNO4。以Xyn-CDBFV基因为模板，以上述引物用GeneMorphII随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，BamHI和Notl进行酶切处理后与经过同样酶切后的PET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LA平板(LB培养基+100Pg/ml氨苄霉素)，37°C倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔平板的每个小孔中(其中有一个小孔挑入含有原始木聚糖酶基因的转化子)，每个小孔里加入150ul含有0.lmMIPTG的LA培养基(LB培养基+100l^g/ml氨苄霉素)，将平板于22。C,220rpm培养至菌密度(OD.600)达到1.0左右，离心去除上清液，用100ulpH5.0的50mM柠檬酸缓冲液重悬菌体，反复冻融，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。分别取出30ul裂解液至两块新的96孔平板，其中一块平板于75度处理10分钟后，两块平板都加入30ul的2%的木聚糖溶液，于60X反应10分钟后，DNS法(Miller,G丄，Anal.Chem.1995，Vol31，426-428)测定生成的还原糖，对高温处理后依然保持高活性的突变子进行DNA测序分析，获得一株热稳定性高(75。C处理10min后，残余酶活为80%，而原酶仅为15%)，但酶活却没有降低的改良木聚糖酶基因，即Xyn-CDBFV-G201C。该改良木聚糖酶与原木聚糖酶相比，存在一个核苷酸的差异，其601位的鸟嘌呤变为胸腺嘧啶，与之相对应，其编码氨基酸由原来201位的甘氨酸突变为半胱氨酸。实施例2:改良木聚糖酶中201位与50位半胱氨酸形成了二硫键改良的木聚糖酶热稳定性的提高的原因是由于201位与50位半胱氨酸形成了一个新的二硫键。改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在SWISS-MODEL(http:〃swissmode1.expasy.org/)进行了同源建模，可以看到50，60和201位的半胱氨酸在空间上相互接近，彼此都有可能形成二硫键，但201位与50位半胱氨酸的空间位置使它们更容易形成二硫键，于是对原始和改良木聚糖酶进行了定点突变，将60位的半胱氨酸突变为丙氨酸。将原始和改良木聚糖酶基因以及它们的C60A突变体基因分别克隆至PET21a中，大肠杆菌重组表达制备了这四种酶蛋白。DTT是还原剂，能够打开这些酶蛋白中可能存在的二硫键。首先在不含DTT的pH5.0的柠檬酸缓冲液对这四种蛋白进行热稳定试验(75度处理10min)，原始木聚糖酶和其C60A突变体的热稳定性是一致的，残余活性均为15%，同时改良木聚糖酶和其C60A突变体的热稳定性也是一致的，残余活性均为80%;其次在含有2mMDTT的pH5.0的柠檬酸缓冲液对这四种蛋白进行热稳定试验，原始木聚糖酶和其C60A突变体的热稳定性在DTT存在的情况下并没有发生变化；而改良木聚糖酶和其C60A突变体的热稳定性在DTT存在的情况下发生了明显的降低，残余活性均从80%下降到了50%(图1)，由此可以推断，在原始木聚糖酶中没有二硫键，而在改良木聚糖酶中，201位与50位半胱氨酸形成了二硫键，而不是201与60位半胱氨酸形成二硫键，也不是50与60位半胱氨酸形成二硫键。另一方面，利用了分子动力学模拟间接证明201位与50位半胱氨酸形成了二硫键。201，50，60位的半胱氨酸彼此有可能形成二硫键，于是建立了三个蛋白模型，50与201位半胱氨酸形成二硫键(50ss201)，50与60位半胱氨酸形成二硫键(50ss60)，60与201位半胱氨酸形成二硫键(60ss201)，利用namd2程序对这三个蛋白结构在一个大气压单位下，60°C进行分子动力学模拟。将蛋白结构放入一个边长为10埃的水盒子中，离子浓度为50mM,cut-off距离为8埃，particle-meshEwald(PME)处理的周期边界条件计算长距离电磁作用，CHARMM27力场，SHAKE运算法则限制包括氢键的共价键，Timest印为lfs，模拟时间为7ns，每5ps记录蛋白结构。模拟结束后，进行均方根偏差(RootMeanSquareDeviation)的计算，均方根偏差的含义是比较两个结构的差异，均方根偏差越小，表明两个结构越相近。计算均方根偏差的对比结构是三个蛋白模型结构动力学模拟的初始结构，由图2可以看到，在7ns的模拟过程中，50ss201与初始结构的均方根偏差在三个可能存在二硫键的蛋白模型中是最小的，表明这个结构是最稳定的结构，也是实际上最有可能存在的结构。实施例3含有改良基因的重组酵母表达载体的构建以及重组酵母基因工程菌株的获得用于构建酵母表达载体的质粒是pPIC9K(带有alpha因子分泌信号)，设计PCR引物XynF2和XynR2如下XynF2:GGCGAATTCATGCAAAGTTTCTGTAGTTCAGCTTCTCAC(正向引物，划线的序列为EcoRI酶切识别序列)，即SEQIDNO5。XynR2:GCGGCGGCCGC[^VTCACCAATGTAAACCTTTGCGTAT(反向引物，划线的序列为Notl酶切识别序列，方框内的序列为终止密码子)，即SEQIDNO6。以PET21a-Xyn-CDBFV-G201C质粒DNA为模版，利用高保真Pfu聚合酶扩增出Xyn-CDBFV-G201C片段，克隆至pPIC9k，形成重组质粒pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C,酶基因在A0X1启动子下游。用同样的方法获得重组质粒pPIC9k-Xyn-CDBFV。过量的pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C质粒DNA经BglII酶切，乙醇沉淀后，70%乙醇洗两次，冷冻干燥后用无菌水溶解DNA，取2-3化DNA电击转化至毕赤氏酵母GS115中，涂布于MD平板，30X倒置培养至转化子出现。受体菌GS115是组氨酸缺陷型，目的基因通过体内同源重组将整合至酵母基因组中，重组转化子能在不含His的MD平板上生长。用牙签从转化平板上挑取转化子划线至含有3mg/ml的G418的YETO平板，只有目的基因高拷贝重组的转化子能在高浓度G418下生长。挑取生长良好的重组转化子在以甘油为碳源的培养基(BMGY)中，30T摇瓶培养至细胞密度(0.D.600)达到20，离心后弃上清，酵母细胞再转接到诱导培养基(BMMY)(甲醇终浓度0.5%)中30°C诱导培养72个小时，在外源甲醇的诱导下，A0X1启动子可以启动下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物分泌至酵母细胞胞外，SDS-PAGE检测发酵上清液，从300株重组酵母中初步筛选到28株表达木聚糖酶的重组转化子，其中表达量最高的一株重组酵母基因工程菌株，定义为GS115/Xyn-CDBFV-G201C，按照同样方法获得含有原始木聚糖酶基因的重组酵母基因工程菌株，定义为GS115/Xyn-CDBFV。实施例4:改良木聚糖酶的酶学性质分析对改良和原始木聚糖酶进行酶学性质的比较研究，其中包括酶的比活，最适反应温度，最适反应pH值，持续分解木聚糖酶的能力以及酶动力学性质。酶活测定方法如下100ul相应pH缓冲液稀释的酶液与100ul2%的木聚糖溶液混合，于相应的温度反应10min后，加入DNS显色液，100度沸水浴显色10min，570nm分光光度计测定吸光度，以D-木糖作为标准物，通过测定酶促反应所生成的还原性木糖来定量的计算酶活性。木聚糖酶活性单位(U)定义为在一定条件下，lmg(或lml发酵液)木聚糖酶每分钟能分解木聚糖产生lumol的木糖。(李彩霞Wa丄，纸和造纸，2001，Vol1,60-61)以下所用原始木聚糖酶和改良木聚糖酶分别采用统一的发酵液。(1)改良木聚糖酶在高温下具有更高的活性。在pH4.0、5.0、6.050mM柠檬酸缓冲液中，测定42，47，52，57,62，67，72，77，82，87T中改良和原始木聚糖酶的酶活。结果见图3-5(大肠杆菌重组表达制备的酶蛋白)和图6-8(毕赤氏酵母重组表达制备的酶蛋白)，在三个pH值的缓冲液中，改良木聚糖酶的最适反应温度提高了0-10度，在低于最适反应温度的低温中，两种木聚糖酶的酶活是一致的，而在高于最适反应温度的高温中，改良木聚糖酶的酶活是原始木聚糖酶1.5-2倍。在pH6.0下，大肠杆菌重组表达制备的原始木聚糖酶的最适反应温度为62°C，酶比活为3729U/mg，而改良木聚糖酶的最适反应温度为67。C，酶比活为5004U/mg，在72X中，原木聚糖酶的酶比活下降到1948U/mg，而改良木聚糖酶只下降到4446U/mg;毕赤氏酵母重组表达制备的原始木聚糖酶的最适反应温度是67"C，比活为6872U/ml发酵液；而改良木聚糖酶的最适反应温度是72。C，比活为9282U7ml发酵液，在77°C中，原始木聚糖酶的酶比活为3335U/ml发酵液，而改良木聚糖酶的酶比活达到了6802U/ml发酵液。由此可见，改良木聚糖酶在高温下具有更高的活性。(2)改良木聚糖酶在强碱下具有更高的活性在65T，在3种不同pH范围的缓冲体系(pH4.3-6.25为50mM柠檬酸缓冲液，pH5.8-7.81为50mM的磷酸钠缓冲液，pH7.31-9.19为50mMTris-Hcl缓冲液)中测定改良和原始木聚糖酶的酶活。结果见图9(大肠杆菌重组表达制备的酶蛋白)和图10(毕赤氏酵母重组表达制备的酶蛋白)，两种木聚糖酶的最适pH值是一致的，大肠杆菌重组表达制备的酶蛋白在5.2左右，毕赤氏酵母重组表达制备的酶蛋白在6.2左右。在pH4.3-6.2中，这两种木聚糖酶的酶活是一致的，但在pH7-9.2中，改良木聚糖酶的酶活要大于原始木聚糖酶。在pH8.2的50mMTris-Hcl下，大肠杆菌重组表达制备的原木聚糖酶的酶活是最高酶活的34%，而改良木聚糖酶达到了48%;毕赤氏酵母重组表达制备的原木聚糖酶的酶活只是最高酶活的21%，而改良木聚糖酶达到了61%，由此可见，改良木聚糖酶在强碱下具有更高的活性。(3)改良木聚糖酶在高温下能够在较长时间内持续分解木聚糖在75。C和80°C，pH5.0，50mM拧檬酸缓冲液中，测定5-60min内改良和原始木聚糖酶催化产生的还原糖的产量。结果见图11(大肠杆菌重组表达制备的酶蛋白)和图12(毕赤氏酵母重组表达制备的酶蛋白)。在75T下，大肠杆菌表达的改良木聚糖酶催化反应40min后，产物量是5min反应产物量的4倍，而原始木聚糖酶只有2倍；在8(TC下，毕赤氏酵母表达的改良木聚糖酶催化反应35min后，产物量是5min反应产物量的2.5倍，而原始木聚糖酶只有1.5倍，表明改良木聚糖酶能够在35-40min内持续分解木聚糖，而原始木聚糖酶的持续分解时间只有10min左右。(4)改良木聚糖酶的酶动力学常数在65°C，pH5.050mM柠檬酸缓冲液中，以木聚糖为底物，利用Lineweaver-Burk双倒数法测定改良和原始木聚糖酶的i^和《^值，同时计算kcat/km值。结果见表1(大肠杆菌重组表达制备的酶蛋白)和表2(毕赤氏酵母重组表达制备的酶蛋白)。大肠杆菌重组表达制备的改良木聚糖酶和毕赤氏酵母重组表达制备的改良木聚糖酶的《/^值都为原木聚糖酶的1.5倍左右，表明改良木聚糖酶具有更高的催化效率。表1大肠杆菌表达制备的原始木聚糖酶和改良木聚糖酶的动力学常数<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>序歹U表<110>复旦大学<120>—种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株<130>51<160>6<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>675<212>DNA<213>人工合成<220><221>CDS<222>(1)…(675)<223><楊>1C33sgtGinSerttctgtagttcsgettctcacPheCysSerSerAlaSerHistctggacaaagtgtaaaggtaSerGlyGinSerValLysVal1015483ccggcThrGly33C33gAsn!Lys203ttggasetsttlieGlyThrlieggtGly25ggtGlygttValggtGlyt3CTyrgssttsGluLeu30tggT:rp96getgstagtggt33t33CagtgetaictttctsttctgatggttecttcAlaAspSerGlyAsnAsnSerAlaThrPheTyrSerAspGlySerPhe354045144teatgtactttcess33tgetggggsttsctt3tgtcgtsgtggtcttSerCysThrPheGinAsnAlaGlyAspTyrLeuCysArgSerGlyLeu505560192tctttcgatagtactaag3ccccatctcaaattggtcgtatgasggetSerPheAspSerThrLysThrProSerGinlieGlyArgMetLysAla657.07580240gatttc333cttgtcssscaa33tsgttecastgttggtt3ttectst288AspPheLysLeuValLysGinAsnSerSerAsnValGlyTyrSerTyr859095gttggtValGlygtttacValTyr100ggtGlytggsetTrpThragaagtccaArgSerPro105cttgtcLeuValg33GlutscTyr110t3CTyr3ttlie336gtcgstValAsp33ttggAsnTrp115cttLeu3gtCC3SerProttcccaccsPheProPro120ggtgstGlyAsptggTrp125gttValggtGlyAsn38433g33gLysLys130catggtHisGlytctSerttcsetPheThr135attgatggtlieAspGlygetC33AlaGin140t3CTyrsetThrgttValTyr432g3333CGluAsn145setcgtThrArgsetThrggtCC3GlyPro150tct3ttgstSerlieAspggtgstGlyAsp1553CCThr3CCThrttcPhe33tAsn160480t3CGinTyrtttsgtPheSer3ttCgtC33lieArgGin165essgetcgtGinAlaArg170gattgtAspCysggtGlysecThratt工le175Asp5283tttctlieSergetC3CAlaHis180tttgatessPheAspGintgggassagcttggtstgset3tgggtTrpGluLysLeuGlyMetThrMetGly185190576333tt3LysLeucatgasHisGlu195gecsaggttAlaLysValttatgtgsagecggtsscgttsscggtLeuCysGluAlaGlyAsnValAsnGly200205624ggtgecGlyAla210sgtggtSerGlysecgetgstThrAlaAsp215ttcccstacgc333ggtttscsttggtPheProTyrAlaLysValTyr工leGly220672gst675Asp225<210>2<211>225<212>PRT<213>人工合成<400>2GinSerPheCysSerSerAlaSerHisSerGlyGinSerValLysVal151015ThrGlyAsnLyslieGlyThrlieGlyGlyValGlyTyrGluLeuTrp202530AlaAspSerGlyAsnAsnSerAlaThrPheTyrSerAspGlySerPhe354045SerCysThrPheGinAsnAlaGlyAspTyrLeuCysArgSerGlyLeu505560SerPheAspSerThrLysThrProSerGinlieGlyArgMetLysAla65707580AspPheLysLeuValLysGinAsnSerSerAsnValGlyTyrSerTyr859095ValGlyValTyrGlyTrpThrArgSerProLeuValGluTyrTyrlie100105110ValAspAsnTrpLeuSerProPheProProGlyAspTrpValGlyAsn115120125LysLysHisGlySerPheThrlieAspGlyAlaGinTyrThrValTyr130135140GluAsnThrArgThrGlyProSerlieAspGlyAspThrThrPheAsn145150155160GinTyrPheSerlieArgGinGinAlaArgAspCysGlyThrlieAsp165170175lieSerAlaHisPheAspGinTrpGluLysLeuGlyMetThrMetGly180185190LysLeuHisGluAlaLysValLeuCysGluAlaGlyAsnValAsnGly195200205GlyAlaSerGlyThrAlaAspPheProTyrAlaLysValTyrlieGly210215220Asp225<210>3<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>3ggcggatccatgcsasgtttctgtsgttcsgcttctcsc<210>4<211>36<212>DNA<213>人工合成<400>4gcggcggccgc3tc3cc33tgtasscctttgcgtst<210>5<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>5ggcgaattcatgcaaagtttctgtagttcagcttctcac<210>6<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>6gcggcggccgctcsstcsccsaitgtssacctttgcgtst权利要求1.一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因，其特征在于，该木聚糖酶改良基因的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2.如权利要求1所述的木聚糖酶改良基因，其特征在于，该木聚糖酶改良基因的核苷酸编码序列如SEQIDNOl所示。3.—种含有权利要求1或者2所述木聚糖酶改良基因的核苷酸编码序列的质粒。4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，该质粒是原核或者真核表达质粒。5.如权利要求4所述的质粒，其特征在于，该质粒是酵母表达质粒。6.如权利要求5所述的质粒，其特征在于，该质粒是毕赤氏酵母表达质粒。7.—种含有权利要求5所述表达质粒的酵母基因工程菌株。8.如权利要求7所述基因工程菌株，其特征在于，该菌株是毕赤氏酵母基因工程菌株。9.如权利要求1所述基因的制备方法，其特征在于，以Xyn-CDBFV基因为模板，将其核苷酸编码序列第601位突变为胸腺嘧啶。10.如权利要求7所述基因工程菌株的制备方法，其特征在于，用权利要求5所述的质粒转化酵母菌即可。全文摘要本发明提供了一种编码高温强碱下具有高活性的木聚糖酶的改良基因、其重组质粒、含有该基因的重组酵母基因工程菌株及其制备方法。改良后的木聚糖酶和原始木聚糖酶相比，由原始木聚糖酶氨基酸序列的201位的甘氨酸突变为半胱氨酸。改良木聚糖酶较原始木聚糖酶具有更高的热稳定性，在75℃处理10分钟后，改良木聚糖酶的残余活性达到了80％，而原始木聚糖酶只有15％。改良木聚糖酶在高温强碱的环境下的活性是原木聚糖酶活性的1.5-2倍，并能在高温下长时间分解木聚糖。本发明还提供了含有该改良基因的重组毕赤氏酵母基因工程菌株。本发明的改良木聚糖酶可以广泛应用于造纸，饲料以及食品工业。文档编号C12N1/19GK101392266SQ200810200060公开日2009年3月25日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者红吕,淳游,强黄申请人:复旦大学;武汉新华扬生物有限责任公司