与大白菜基因共分离的根肿病分子标记syau3008、引物及应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与大白菜基因共分离的根肿病分子标记syau3008、引物及应用。


背景技术：

2.大白菜(brassica rapa ssp.pekinesis)作为十字花科芸薹属重要的蔬菜作物之一，在我国甚至世界都占有十分重要的地位，种植面积大，营养价值极高。近年来，根肿病(clubroot)在我国很多地区，例如东北地区、西南地区、长江中上游等地均有发现，并且面积有扩大的趋势。现在已成为我国十字花科芸薹属作物的主要病害之一，其中大白菜受到的危害最为严重。根肿病是由芸薹根肿菌(plasmodiophora brassicae)侵染引起的一种传染性非常强的土传病害。根肿菌专性寄生在芸薹属、萝卜属以及拟南芥等十字花科活体植物的根部。一般认为根肿菌属于原生动物界、丝足虫门、植物寄生黏菌纲、根肿菌目、根肿菌科的一种有害菌。在世界各地每年因为根肿病的危害导致芸薹属作物减产多达10％
‑
15％，发病严重时可导致作物绝收。
3.面对大白菜根肿病发病区域日益扩大的严峻形势，现有的生物防治、化学防治、农业防治措施虽然可以在一定程度上减轻根肿病的危害，但同时存在土壤、环境污染，生产成本高等诸多问题。仍不能从根本上解决大白菜栽培所面临的严重问题。抗病育种是防控根肿病危害最经济和有效的途径之一。分子标记由于与植物性状紧密连锁，所以常作为抗病育种的辅助手段。
4.自从1961年thoday首次利用一对侧翼标记定位一个qtl以来，数量性状尤其是经济性状的qtl研究取得了巨大进展。然而qtl的初步定位在染色体上是一个比较宽的区间，精细定位就是在完成初定位的基础上，通过在qtl区域内加密标记并结合作图群体的表型差异分析，将目标qtl锁定在一个更小的区域。qtl精细定位需要大量的染色体片段的重组，可靠的表型测定以及高密度的分子标记。用于精细定位的群体可以是f2、回交群体、重组自交系和近等基因系等群体。其中，近等基因系由于只在少数几个甚至一个区段存在彼此差异，而其他遗传背景完全相同。其基因组中只存在一个或几个qtl，可以消除其它背景干扰和消除微效qtl的影响，特别适合于进行qtl精细定位的群体。紧密连锁标记的开发直接影响到精细定位的效果。虽然大白菜抗根肿病育种取得了一定的进展，但于根肿菌的变异以及土壤中多个生理小种混生，导致抗病品种在种植3
‑
5年后丧失抗性。根肿菌群体结构及致病力的分化给抗病育种带来了新的挑战。
5.因此，利用1个主效抗病基因(clubroot resistance,cr)进行抗病育种已经面临严峻挑战，需要在以抗地区优势生理小种作为主要育种目标的同时聚合抗更多生理小种的抗病基因。从而借助分子标记辅助选择(marker
‑
assisted selection，mas)技术进行聚合抗病基育种。因此，目前迫切需要在挖掘和定位更多的抗根肿病基因基础上，开发精准的高通用性抗病基因连锁标记。
reference genetic linkage map for the multinational brassica rapa genome sequencing project.genome 53,939
–
947.doi:10.1139/g10
‑
054)提取3000株f2个体及两个亲本的基因组dna，利用qs_b3.1位点侧翼标记引物cnu
‑
ssr316，syau3008和sau_um026进行pcr扩增，筛选重组体。
42.cnu
‑
ssr316：
43.cnu
‑
ssr316
‑
f：5
’‑
tcaagcatgtccttaaaactctga
‑3’
，见seq id no.3；
44.cnu
‑
ssr316
‑
r：5
’‑
gcgttcacgtttcccatatc
‑3’
，见seq id no.4；
45.syau3008：
46.syau3008
‑
f：5
’‑
ataaagcgtaagcgccatgt
‑3’
，见seq id no.5；
47.syau3008
‑
r：5
’‑
aatgataaatcagatgccgga
‑3’
，见seq id no.6；
48.sau_um026：
49.sau_um026
‑
f：5
’‑
agtggctcccaggaggataata
‑3’
，见seq id no.7；
50.sau_um026
‑
r：5
’‑
cttggagaagagaaacttgggc
‑3’
，见seq id no.8；
51.3.2、pcr扩增
52.反应体系：15ng模板dna(步骤3.1的基因组dna)，5pmol/l正向引物，5pmol/l反向引物，5μl 2
×
taq pcr stamix，ddh2o补全到10μl，放到离心机中4℃、2200rpm离心20s，加入10μl mineral oil再离心一次。
53.扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58s℃复性45s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
54.3.3、pcr产物电泳检测
55.向pcr产物中加入10μl的溴酚蓝溶液(98％的去离子甲酰胺，1g/l的溴酚蓝，1g/l的二甲苯腈，0.5mol/l的edta)，96℃变性6min后，将pcr产物迅速拿出放在冰上冷却。在dna电泳仪上进行6％(6g/100ml)的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳。
56.电泳结束后，将平板胶面向上放在固定液中(固定液成分：200ml无水乙醇；10ml冰醋酸；1.8l蒸馏水)，轻轻摇晃7min；从固定液中取出放到银染液中(银染液成分：3g硝酸银；4ml甲醛；2000ml蒸馏水)轻轻摇晃10min；从银染液中取出，用蒸馏水漂洗一下，放入显色液中(显色液成分：28g氢氧化钠；4ml甲醛；2l蒸馏水)显色，当出现清晰条带时，将平板放在固定液中固定3min，放在蒸馏水中漂洗5min,取出后晾干，读取数据，扫描或拍照。读取数据时基因型与抗病亲本
‘
cr510’一样的记为
‘
b’，与感病亲本
‘
59
‑1’
一样的记为
‘
a’，杂合基因型记为
‘
h’。
57.利用qs_b3.1位点侧翼标记cnu
‑
ssr316，syau3008和sau_um026进行pcr扩增，最终共筛选出重组体51株，基因型12种。具体结果如表1。
58.表1重组体单株个数及其基因型
[0059][0060]
4、重组单株家系构建及其抗病性鉴定
[0061]
4.1、重组单株家系的构建
[0062]
从f2中筛选出来的51株重组单株进行自交授粉，收获种子f3代。
[0063]
4.2、重组单株f3家系抗病性鉴定
[0064]
将f3中每个单株种子随机抽取30粒播种，抗病亲本
‘
cr510’和感病亲本
‘
59
‑1’
同时播种30粒。进行抗病性鉴定。
[0065]
将种子放置在铺有用灭菌水润湿滤纸的培养皿中，均匀放置，放在黑暗处，温度控制在20℃左右，当胚根刚刚突破种皮时即可播在72孔穴盘中。播种10天后即两叶一心时，对f3植株及抗病与感病对照，在根部进行垂直接种根肿菌4号生理小种的菌体稀释液。
[0066]
所述菌体稀释液的获得方法如下：
[0067]
(1)取30g根肿菌4号生理小种导致的发病大白菜根瘤组织用清水洗干净，再用蒸馏水冲洗3次，加入100ml灭菌水，放在室温下活化12小时，活化后放入用高锰酸钾灭菌后的破壁机中研磨成匀浆。
[0068]
(2)用8层纱布加一层无纺布进行过滤，将滤渣再研磨一次；
[0069]
(3)收集上一步的两次滤液放入灭菌的50ml离心管中，4℃ 1000g/min离心10min，弃上层清液；
[0070]
(4)加入5ml灭菌水充分震荡，4℃、1000g/min离心10min，弃上层清液；
[0071]
(5)重复上述步骤(4)4次，此步骤为洗净沉淀。
[0072]
(6)向步骤(5)最后一次的沉淀中加入5ml灭菌水，震荡均匀，制成母液。
[0073]
(7)将母液摇匀，用移液器取100μl母液于1.5ml离心管中，加900μl灭菌水摇匀；吸取稀释10倍的母液100μl于1.5ml离心管中，加入200μl的苯胺蓝溶液，700μl的灭菌水摇匀，染色5min；用血球计数板检测母液的浓度；将母液稀释到1
×
107个/ml
‑1的浓度，得菌体稀释液。每棵植株接种1ml的菌体稀释液。接菌后，24小时内禁止浇水，使温室温度维持在20℃左右，光周期为光照/黑暗16h/8h，土壤保持湿润。
[0074]
接菌5周后对植株进行抗病性调查，将植株从穴盘中取出，清洗植株根部，观察并记录。株发病情况分级标准，采用本发明采用0
‑
3级分级标准：
[0075]
0级：根部无肿瘤，正常生长；
[0076]
1级：根部须根和侧根有小的根瘤；
[0077]
2级:根部主根有小瘤或侧根有大瘤；
[0078]
3级：根部主根大瘤，根瘤直径约是根基部直径的2
‑
3倍。
[0079]
通过对f
3 51个家系每个家系30株幼苗接种根肿菌生理小种4，最终鉴定结果为8个家系完全抗病；18个家系完全感病；25个家系出现分离，分离比是3:1，符合qs_b3.1抗病位点显性单基因遗传。
[0080]
对f3家系接种根肿菌4号生理小种菌液5周后，部分植株根部出现明显的根瘤。f2代中基因型是bbh和hbb的重组单株自交后代，接菌5周后全部表现为正常生长无根瘤，对根肿菌4号生理小种表现为抗病；f2代中基因型是aab、aah、baa和haa的重组单株自交后代，接菌5周后全部发病，植株根部出现明显的根瘤，均为3级根瘤，对根肿菌4号生理小种没有抗性；f2代中基因型是ahh、bha、bhb、bhh和hha的重组单株自交后代，接菌5周后部分植株根部出现明显根瘤，部分植株正常生长，根部无根瘤，出现分离。
[0081]
5、抗根肿病基因qs_b3.1精细定位及其图谱的构建
[0082]
5.1、分子标记的设计
[0083]
对
‘
cr510’和
‘
59
‑1’
进行基因组测序，对序列进行分析获得了cnu
‑
ssr316和sau_um026之间的序列差异，根据这段序列，利用primer 5设计引物，引物设计主要参数为：gc含量为40％
‑
60％，退火温度50℃
‑
60℃，预期片段长度在100
‑
400bp之间，引物长度为18bp
‑
24bp，在设计引物过程中应尽量避免引物二聚体(cross dimer)，发卡结构(hairpin)、错配(flase priming)等结构的出现。
[0084]
5.2、亲本多态性标记的筛选
[0085]
以抗根肿病亲本“cr510”和感根肿病亲本“59
‑
1”基因组dna为模板，以新开发的引物进行扩增，筛选出亲本间有多态性的引物，具有多态性的引物用于qs_b3.1的精细定位。
[0086]
pcr扩增体系和程序步骤见3.2
[0087]
用聚丙烯酰胺凝胶电泳仪跑6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定功率70w下跑1
‑
1.5小时。电泳结束后，进行银染，显色，晾干后读板，记录数据。具体步骤见3.3。
[0088]
利用primer 5共设计25对indel标记包括syau
‑
indel3001、syau
‑
indel3002、syau
‑
indel3004、syau
‑
indel3006、syau
‑
indel3007、syau3008、syau
‑
indel3010等；以抗根肿病亲本“cr 510”和感根肿病亲本“59
‑
1”基因组dna为模板，对25对引物进行pcr扩增后，共筛选出19对具有多态性的引物。
[0089]
5.3、加密引物基因型鉴定
[0090]
以抗根肿病亲本“cr510”，感根肿病亲本“59
‑
1”和重组单株基因组dna为模板，对新开发的19对具有多态性的引物进行pcr扩增。
[0091]
pcr扩增具体步骤见3.2。
[0092]
pcr结束后，将pcr产物中加入10μl溴酚蓝溶液，95℃变性6min，变性结束后，迅速取出放在冰上冷却。6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒定功率70w，1.5小时。银染，显色，晾干读板，记录数据，读板时基因型与抗病亲本
‘
cr510’一样的记为
‘
b’，与感病亲本
‘
59
‑1’
一样的记为
‘
a’，杂合基因型记为
‘
h’。具体电泳步骤见3.3。
[0093]
由f3家系接菌鉴定可以分析出抗病基因在引物syau3008附近。
[0094]
5.4抗根肿病基因qs_b3.1精细定位图谱的构建
[0095]
在f2中随机抽取180粒种子，将种子放置在铺有用灭菌水润湿滤纸的培养皿中，均匀放置，放在黑暗处，温度控制在20℃左右，当胚根刚刚突破种皮时即可播在72孔穴盘中，同时播种抗根肿病亲本
‘
cr510’和感根肿病亲本
‘
59
‑1’
各12粒作为对照。当植株长到4叶一心时，将植株标号，每棵植株采取1cm2大小叶片放于2ml离心管中，每个离心管中放入一个直径3mm的钢珠，一定要将离心管的盖子盖紧，采用改良ctab法提取基因组dna。具体提取步骤见3.1。
[0096]
将提取的f2群体基因组dna和抗病亲本
‘
cr510’，感病亲本
‘
59
‑1’
基因组dna，利用初步定位引物cnu
‑
ssr316，syau3008 sau_um026和新开发的19对具有多态性的引物引物进行pcr扩增，确定植株基因型，基因型与抗病亲本
‘
cr510’一样的记为
‘
b’，与感病亲本
‘
59
‑1’
一样的记为
‘
a’，杂合基因型记为
‘
h’。pcr扩增具体步骤见3.2。
[0097]
pcr结束后，将pcr产物中加入10μl溴酚蓝溶液，95℃变性6min，变性结束后，迅速取出放在冰上冷却。6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒定功率70w，1
‑
1.5小时。银染，显色。具体电泳步骤见3.3。
[0098]
各个连锁标记序列利用blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12)和大白菜bac文库中的序列进行对比，将各个标记锚定在bac上，从ncbi下载bac序列，对比各bac序列间是否存在重叠关系，利用mapchart2.2构建qs_b3.1基因的物理图谱，结果参见图1。
[0099]
5.5抗根肿病基因qs_b3.1精细定位
[0100]
将f2重组单株的基因型和重组单株f3家系的抗病性鉴定结果结合，根据图谱与重组单株f3家系抗病性鉴定结果见图1，对抗根肿病基因qs_b3.1进行精细定位。结合图1a
‑
b分析，可知所述抗根肿病基因qs_b3.1被syau
‑
indel3007和syau
‑
indel 3010定位在大白菜a03染色体753.4kb的区域内。syau3008最为接近且与抗病基因qs_b3.1完全连锁，所以选择引物syau3008为扩增该分子标记的引物。
[0101]
实施例2
[0102]
大白菜抗根肿病qs_b3.1基因的共分离分子标记syau3008在辅助选择大白菜抗根肿病植株中的应用方法，具体包括：
[0103]
a.用实施例1的ctab方法提取待测材料的基因组dna
[0104]
b.pcr扩增
[0105]
pcr扩增体系和程序参考实施例1的步骤3.2。
[0106]
pcr引物的序列为：
[0107]
syau3008
‑
f：5
’‑
ataaagcgtaagcgccatgt
‑3’
[0108]
syau3008
‑
r：5
’‑
aatgataaatcagatgccgga
‑3’
；
[0109]
c.电泳：将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94℃变性6min，之后在dna测序电泳仪上进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70w条件下电泳2小时电泳结束后，进行银染，并观察扩增结果；
[0110]
需要说明的是，上样缓冲液采用聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的缓冲液。
[0111]
d.判断：如果扩增出条带的核苷酸序列为seq id no.1，则为抗病个体，其含抗根肿病基因qs_b3.1基因的概率为100％；如扩增出条带的核苷酸序列为seq id no.2，则为感病个体。
[0112]
抗病个体中syau3008的核苷酸序列为seq id no.1：ataaagcgtaagcgccatgtgttacatttaagatggtgctgtaaccacgtgttagttgggccttaatgggccctcacaaatcaactggctttttctagttccgttgtctctttccggcatctgatttatcatt
[0113]
感病个体中syau3008的核苷酸序列为seq id no.2：ataaagcgtaagcgccatgtgttacatttaagatggtgctgtaaccacgtgtgggccctcacaaatcaactggctttttctagttccgttgtctctttccggcatctgatttatcatt
[0114]
抗病序列比感病序列长15个碱基。
[0115]
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0116]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精
神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。