识别Caspase蛋白的自组装多肽探针、制备方法及应用与流程

识别caspase蛋白的自组装多肽探针、制备方法及应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物医药领域，尤其是识别caspase蛋白的自组装多肽探针、制备方法 及应用。


背景技术：

[0002]
细胞凋亡，又称细胞程序性死亡，是存在于细胞中的自毁机制。在细胞凋亡过程中， caspase即半胱天冬蛋白酶起着重要的作用，细胞凋亡的过程实际上是caspase不可逆有 限水解底物的级联放大反应过程。在caspase家族中caspase-3和caspase-8扮演了十分 重要的角色。目前检测凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的方法主要是通过caspase-3和 caspase-8的特异性识别序列devd和ietd来实现。ac-devd(ietd)-afc是常用的检 测方法，但是由于ac-devd(ietd)-afc的溶解性差及其进入细胞效率低的问题，无法 在活细胞中根据荧光强度实时检测caspase-3和caspase-8蛋白的表达情况。对发生凋亡 的活细胞中凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的快速检测是一项重大挑战。活细胞标记技 术需要高特异性，高标记密度和标记分子的细胞渗透性以及较强的目标蛋白靶向性。为 了开发更简单方便的平台，我们利用小分子多肽类的自组装特性。因为其具有生物相容 性好，对身体无毒，容易合成等优点。小分子水凝胶作为一种新型的材料，由于其良好 的生物相容性，较好的三维形貌，已经在生物医学和生物材料方面得到国内外科学家广 泛的研究。迄今为止，还没有出现用小分子多肽n端连接nap-gff
p
y和c端连接 devd(ietd)-afc，通过碱性磷酸酶催化自组装形成纳米纤维，可以用来实时指示凋亡 细胞内caspase-3和caspase-8蛋白的表达情况的研究报道。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，通过短肽nap-gff
p
y将caspase-3/8特 异性识别序列devd/ietd和afc连接起来形成nap-gff
p
ydevd-afc和 nap-gff
p
yietd-afc的小分子多肽化合物，通过碱性磷酸酶催化自组装形成纳米纤维， 该纳米纤维可以内吞的方式进入细胞，根据afc的荧光强度来检测发生凋亡的活细胞中 caspase-3和caspase-8的蛋白活性。
[0004]
本发明的识别caspase蛋白的自组装多肽探针，其中，用于识别caspase-3蛋白的自 组装多肽探针nap-gff
p
ydevd-r的结构式如下：
[0005][0006]
用于识别caspase-8蛋白的自组装多肽探针nap-gff
p
yietd-r的结构式如下：
[0007][0008]
其中，r为荧光功能基团；
[0009][0010]
其中，
[0011]
其中，-nap代表萘乙酸疏水封端基团，-afc代表天冬氨酸衍生物形成的荧光基团。 自组装的短肽nap-gff
p
y与devd-afc和ietd-afc的连接方式可以选用0到3个的 甘氨酸。
[0012]
本发明还在于提供一种识别caspase蛋白的自组装多肽探针的制备方法，其特征在 于，主要包括如下步骤：
[0013]
(1)中间体化合物fmoc-asp(oh)-afc的合成过程如下：
[0014]
i)取fmoc-asp(otbu)-cooh、香豆素151、无水吡啶和三氯氧磷进行反应；反应后 加入盐酸溶液，萃取、干燥后得到fmoc-asp(otbu)-afc；
[0015]
ii)把fmoc-asp(otbu)-afc溶于三氟乙酸溶液中，冰浴条件下反应，得到 fmoc-asp(oh)-afc；
[0016]
(2)nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc的合成过程如下：
[0017]
iii)在固相合成器中将(1)中合成的fmoc-asp(oh)-afc连接在固相载体2-氯三苯 甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂，反应1-3小时；
[0018]
iv)用哌啶的二甲基甲酰胺溶液去除保护基团fmoc，取多肽缩合剂hbtu放入iii) 步骤的固相合成器中，依次加入fmoc-缬氨酸、fmoc-谷氨酸，fmoc-天冬氨酸、fmoc
-ꢀ
磷酸酪氨酸、fmoc-苯丙氨酸、fmoc-苯丙氨酸、fmoc-甘氨酸进行反应，并用萘乙酸对 多肽的n端进行封端，即可得到nap-gff
p
ydevd-afc；依次加入fmoc-苏氨酸、fmoc
-ꢀ
谷氨酸、fmoc-异亮氨酸、fmoc-磷酸酪氨酸、fmoc-苯丙氨酸、fmoc-苯丙氨酸、fmoc
-ꢀ
甘氨酸进行反应，并用萘乙酸对多肽的n端进行封端，即可得到nap-gff
p
yietd-afc。
[0019]
v)用95％的三氟乙酸把制备的自组装短肽探针从固相树脂上切割下来，并用hplc 将所得nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc进行纯化分离。
[0020]
本发明还在于提供识别caspase蛋白的自组装多肽探针应用于小分子水凝胶纳米纤 维传输体系的方法，nap-gff
p
ydevd-afc小分子化合物在细胞膜表面碱性磷酸酶的作 用下，自组装形成纳米纤维，并以内吞的方式进入细胞；被凋亡细胞中caspase-3蛋白识 别，并切割释放出荧光基团afc，起到在活细胞中实时检测caspase-3蛋白表达的作用；
[0021]
nap-gff
p
yietd-afc小分子化合物在细胞膜表面碱性磷酸酶的作用下，自组装形成 纳米纤维，并以内吞的方式进入细胞；被凋亡细胞中caspase-8蛋白识别，并切割释放出 荧光基团afc，起到在活细胞中实时检测caspase-8蛋白表达的作用。
[0022]
需要说明的是，本发明用到的氨基酸均为l构型的天然氨基酸。
[0023]
本发明具有以下有益效果：
[0024]
(1)本发明制备得到的小分子自组装多肽化合物nap-gff
p
ydevd-afc和 nap-gff
p
yietd-afc，用小分子多肽nap-gff
p
y连接caspase-3和caspase-8蛋白的识 别序列devd和ietd及荧光基团afc，该小分子多肽化合物在碱性磷酸酶催化自组装 形成纳米水凝胶(纳米纤维)，该纳米水凝胶可以内吞的方式进入细胞，配合caspase-3 和caspase-8蛋白的识别序列devd和ietd可以用来指示细胞内caspase-3和caspase-8 蛋白活性；即不仅解决了ac-devd(ietd)-afc溶解性问题。还可以在活细胞中实时检 测凋亡细胞中caspase-3(caspase-8)蛋白的表达。
[0025]
(2)本发明的小分子多肽化合物nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc 制备过程中用到的原料为培养细胞每天所需要的各种氨基酸，对细胞不产生毒副作用， 制备得到的nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc的mtt结果显示对细胞生 长没有抑制现象。
[0026]
(3)本发明制备得到的纳米水凝胶具有良好的生物相容性及较好的三维形貌(10 纳米左右的纳米纤维)，能更容易进入肿瘤细胞，可在caspase-3/8活性检测方面得到广 泛应用。
附图说明
[0027]
图1为fmoc-l-asp(otbu)-afc的化学合成路线图；
[0028]
图2为nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc的化学合成路线图；
[0029]
图3为nap-gff
p
ydevd-afc的氢谱图；
[0030]
图4为nap-gff
p
yietd-afc的氢谱图；
[0031]
图5为nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc两种小分子水凝胶的透射电 镜观察的三维形貌图，其中，alp为血清碱性磷酸酶；
[0032]
图6为蛋白caspase-3对nap-gff
p
ydevd-afc探针中afc荧光基团释放的影响；
[0033]
图7为蛋白caspase-8对nap-gff
p
yietd-afc探针中afc荧光基团释放的影响；
[0034]
图8为在hela细胞中nap-gff
p
ydevd-afc浓度为50μmol/l的条件下，用1mmol/l h2o2的浓度下诱导hela细胞发生凋亡；afc的荧光强度随诱导时间(0min、10min、20min、 40min、60min)的增加逐渐增强；
[0035]
图9为在hela细胞中nap-gff
p
ydevd-afc浓度为50μmol/l的条件下，用1mmol/l h2o2的浓度下诱导hela细胞发生凋亡；afc的荧光强度随诱导时间(0min、10min、20min、 40min、60min)的增加逐渐增强。
具体实施方式
[0036]
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理 解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所 述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本发明。
[0037]
实施例一fmoc-l-asp(oh)-afc的合成
[0038]
称取fmoc-l-asp(otbu)-oh(10mmol，4.11克)和7-氨基-4-三氟甲基香豆素(10mmol， 2.29克)放入50毫升的圆底烧瓶中，加入40毫升的无水吡啶，在负15摄氏度的条件下， 滴加10mmol的三氯氧磷(3.06g)。用氮气保护，以免接触空气中的水分，负15摄氏度 度恒温反应30分钟。向暗红色粘稠液体中加入3mol/l的盐酸溶液，直到溶液的ph＝2。 用乙酸乙酯萃取三遍，饱和食盐水洗三遍，无水硫酸钠干燥2小时。旋蒸除去乙酸乙酯。 用硅胶色谱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：3)。得到白色固体fmoc-l-asp(otbu)-afc总 共5.07克，产率81.38％。
[0039]
称取fmoc-l-asp(otbu)-afc(6.42mmol，4g)溶于95％的三氟乙酸(三氟乙酸：二 氯甲烷＝95％：5％)的溶液中，在冰浴的条件下反应60分钟。旋蒸除去三氟乙酸和二氯 甲烷，经硅胶色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝75：1)，得到fmoc-l-asp(oh)-afc总共2.59 克，产率71.26％。
[0040]
本实施例的合成步骤可参考图1。
[0041]
实施例二nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc的化学合成
[0042]
固相合成法合成nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc，具体合成步骤如 下：
[0043]
(1)称量0.75mmol(700毫克)二氯树脂，加入固相合成器中，加入20毫升二氯 甲烷(dcm)浸没树脂，溶胀树脂20分钟，除去dcm溶剂，加入1mmol(566毫克) fmoc-l-asp(oh)-afc的dcm溶液，加入800微升的n,n-二异丙基乙胺(dipea)。反 应2小时。之后用dcm洗五次，每次2分钟。用体积比dcm：甲醇：dipea＝17：2： 1的封闭液，封闭30分钟。之后用dcm溶液洗涤5次，每次用dcm溶液20毫升，， 每次1分钟。之后用dmf溶液洗涤5次，每次用dmf溶液20毫升，每次2分钟。
[0044]
(2)加入20毫升20％哌啶的dmf溶液，反应30分钟，脱去fmoc保护基，暴露 出下一步反应的氨基，在此基础上制备nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc。
[0045]
nap-gff
p
ydevd-afc的制备过程如下：在固相合成管中加入1mmol肽缩合剂 hbtu
(379毫克)，1mmol的fmoc-缬氨酸(339毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌 啶切割fmoc基团30分钟，用二甲基甲酰胺(dmf)溶液20毫升，洗涤5次，每次2 分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379毫克)，1mmol的fmoc-谷氨酸(426毫 克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc基团30分钟，用dmf溶液20毫升， 洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379毫克)，1mmol的fmoc
-ꢀ
天冬氨酸(412毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc基团30分钟，用dmf 溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379毫克)， 1mmol的fmoc-磷酸酪氨酸(484毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc基 团30分钟，用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol肽缩 合剂hbtu(379毫克)，1mmol的fmoc-苯丙氨酸(388毫克)，反应120分钟。之后用20％ 的哌啶切割fmoc基团30分钟，用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。fmoc
-ꢀ
苯丙氨酸重复添加一次，反应120分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379毫克)， 1mmol的fmoc-甘氨酸(297毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc基团30 分钟，用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂 hbtu(379毫克)，1mmol的萘乙酸(186毫克)，反应120分钟。反应完毕之后，用dmf 溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。每次用dcm溶液20毫升，洗涤5次，每次1 分钟。用95％的三氟乙酸(tfa)(tfa：h2o：tis＝95％：2.5％：2.5％)切割1小时，即 得nap-gff
p
ydevd-afc。
[0046]
nap-gff
p
yietd-afc的制备过程如下：在固相合成管中加入1mmol肽缩合剂 hbtu(379毫克)，1mmol的fmoc-苏氨酸(339毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌 啶切割fmoc基团30分钟，用二甲基甲酰胺(dmf)溶液20毫升，洗涤5次，每次2 分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379毫克)，1mmol的fmoc-谷氨酸(426毫 克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc基团30分钟，用dmf溶液20毫升， 洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379毫克)，1mmol的1mmol 的fmoc-异亮氨酸(354毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc基团30分钟， 用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379 毫克)，1mmol的fmoc-磷酸酪氨酸(484毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc基团30分钟，用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol 肽缩合剂hbtu(379毫克)，1mmol的fmoc-苯丙氨酸(388毫克)，反应120分钟。之后 用20％的哌啶切割fmoc基团30分钟，用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。 fmoc-苯丙氨酸重复添加一次，反应120分钟。之后分别加入1mmol肽缩合剂hbtu(379 毫克)，1mmol的fmoc-甘氨酸(297毫克)，反应120分钟。之后用20％的哌啶切割fmoc 基团30分钟，用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。之后分别加入1mmol肽 缩合剂hbtu(379毫克)，1mmol的萘乙酸(186毫克)，反应120分钟。反应完毕之后， 用dmf溶液20毫升，洗涤5次，每次2分钟。每次用dcm溶液20毫升，洗涤5次， 每次1分钟。用95％的三氟乙酸(tfa)(tfa：h2o：tis＝95％：2.5％：2.5％)切割1 小时，即得nap-gff
p
yietd-afc。
[0047]
(3)用1％的tfa的二氯甲烷溶液20毫升洗两遍，收集总切割液，旋蒸除去液体， 用高效液相将多肽化合物nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc进行分离；
[0048]
本步骤中，高效液相色谱分离的过程如下：过c-18反相色谱柱，用水和甲醇为洗脱 剂，30％～80％的甲醇梯度洗脱，时间为25分钟；洗脱液过制备hplc，收集保留时间 tr＝15.0～15.5min的流份，得nap-gff
p
ydevd-afc；相同条件下收集保留时间 tr＝13.6～14.3min的流份，得nap-gff
p
yietd-afc。
[0049]
本实施例的合成步骤可参考图2；
[0050]
nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc的质谱图分别见图3和图4。
[0051]
实施例三小分子水凝胶nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc的形成
[0052]
小分子水凝胶的形成步骤如下：
[0053]
(1)称取2.00mg得到的多肽化合物，加入1ml的pbs(ph＝7.4缓冲液)用碳酸钠 调节ph至7.4，形成探针溶液。然后加入碱性磷酸酶溶液(酶的最终浓度为2.0u/ml)， 静置过夜后，倒置小瓶可以看到类似果冻状的胶体，即得到nap-gff
p
ydevd-afc和 nap-gff
p
yietd-afc凝胶状物质。
[0054]
(2)用移液枪吸取大约15微升左右的胶体滴加到表面干净的硅片上，旋涂使胶体 在硅片上分布均匀，用透射电镜观察形貌，具体见图5；其形貌为分散均匀的10nm左右 的纳米纤维。
[0055]
实施例四caspase-3蛋白和caspase-8蛋白分别促进探针nap-gff
p
ydevd-afc和 nap-gff
p
yietd-afc的荧光基团afc的释放。
[0056]
(1)取初始浓度为10mmol/l的nap-gff
p
ydevd-afc的母液，配置浓度80μmol/l， 40μmol/l，20μmol/l，10μmol/l和5μmol/l的探针溶液500微升。在25度的温度条件下 分别加入caspase-3蛋白，放置2个小时。之后用荧光光度计检测溶液中afc的荧光强 度。具体见图6；其荧光强度随着nap-gff
p
ydevd-afc浓度的提高逐渐增强。
[0057]
(2)取初始浓度为10mmol/l的nap-gff
p
yietd-afc的母液，配置浓度80μmol/l， 40μmol/l，20μmol/l，10μmol/l和5μmol/l的探针溶液500微升。在25度的温度条件下 分别加入caspase-8蛋白，放置2个小时。之后用荧光光度计检测溶液中afc的荧光强 度。具体见图7；其荧光强度随着nap-gff
p
yietd-afc浓度的提高逐渐增强。
[0058]
实施例五nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
p
yietd-afc在生物学上的应用
[0059]
(1)正常培养人宫颈癌hela细胞，均匀的平铺到10个共聚焦小皿中，细胞数目为 2.0x 104个。37℃，5％二氧化碳的条件下培养8个小时，之后加入nap-gff
p
ydevd-afc 和nap-gff
p
yietd-afc，浓度设置为50μmol/l。培养四个小时，使 nap-gff
p
ydevd-afc和nap-gff
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yietd-afc进入细胞。之后在浓度为1mmol/l h2o2的作用下，设置时间梯度(0min、10min、20min、40min、60min)诱导hela细胞发生凋 亡，用共聚焦显微镜拍摄各组细胞的荧光强度，进一步反应凋亡细胞中caspase-3和 caspase-8蛋白的表达量。结果显示：随着h2o2诱导的时间延长，凋亡蛋白caspase-3和 caspase-8的表达量逐渐增高，切割释放afc的量也逐渐增多，有afc所展示的荧光强 度也逐渐增强，具体见图8、图9，该结果说明，本发明设计的自主装多肽探针可以在活 细胞中实时检测细胞的凋亡情况。
[0060]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。