一种功能化双网络水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及医用新材料技术领域，尤其涉及一种功能化双网络水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.炎症、肿瘤、外伤等导致骨缺损是人类的常见病、多发病，严重影响患者的生理功能、身心健康及生活质量。目前，临床上修复骨缺损常用的方法包括异体骨、自体骨移植、骨骼延长术等，但往往因存在免疫排异、传染疾病、来源有限等问题而效果不佳。利用组织工程技术，将种子细胞与生物支架构建的骨组织工程材料用于骨缺损修复是一种有效的治疗手段。
3.在组织工程中，良好的支架材料不仅仅作为细胞载体，更应是一个促进细胞生物学活性和向特异性组织定向分化的场所。生长因子作为组织工程微环境的一个重要组成部分，在促进间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)定向分化中起到关键作用。研究表明，骨形成发生蛋白(bone morphogenetic proteins,bmps)、转化生长因子(transforming growth factor
‑
β,tgf
‑
β)和胰岛素样生长因子(insulin
‑
like growth factors,igfs)等生长因子对mscs均具有诱导成骨向分化的作用。尽管生长因子对细胞具有良好的诱导作用，但其生物半衰期短，缺乏长效作用，在体内的稳定性和组织选择特异性差等问题一直未能得到有效的解决，这些缺陷限制了生长因子在临床中的进一步应用。2012年，johnson等从22000多种结构不同的杂环类药性分子中筛选出了一种新型小分子化合物kartogenin(kgn)，并发现其具有促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmmscs)软骨向分化的作用。近期，有研究表明kgn不仅能够参与bmmscs介导的软骨组织再生，通过体外实验发现kgn亦具有诱导bmmscs成骨向分化的作用，表明kgn在骨组织工程领域具有巨大潜力。
4.水凝胶作为一种典型的生物支架材料，因其高度水化的三维交联结构、良好的生物相容性被广泛应用于组织工程领域。当水凝胶作为骨再生的支架材料时，其力学性能至关重要。因为水凝胶不仅为种子细胞提供生长、增殖和分化所需要的微环境，而且还提供了力学支撑及维持软骨细胞表型所必须的三维结构。然而，大多数用于骨修复、常规方法制备的水凝胶软或碎，不足以应对复杂的力学环境，从而阻碍了它们作为承重支架在骨组织工程上的应用。双网络(double network，dn)水凝胶以硬而脆的非均相聚电解质为第一网络，以软而韧的中性聚合物为第二网络，两种物理性质差异较大的互穿网络可以在刚度和韧性之间实现力学性能的平衡，从而赋予dn水凝胶优异的力学性能。作为一种高水含量、高力学强度和高韧性的新型材料，其力学性能明显优于传统的水凝胶，能够承受连续的、高强度的加载
‑
卸载过程，并且具有损伤后自愈合的能力，因此越来越多被作为替代材料或生物材料应用于骨损伤修复。
5.传统dn凝胶的构建通常涉及复杂的制备步骤、有毒的引发剂和丙烯酰胺起始材料。同时，大多数dn水凝胶是不可降解的，这可能会限制细胞的浸润和基质的沉积及分布，
从而阻碍了它们在软骨组织工程上的应用。
6.另外，就目前研究而言，尚未有研究及产品将kgn通过简单高效的化学合成方法修饰在dn水凝胶支架材料上以促进大面积骨缺损修复。


技术实现要素：

7.本发明的第一目的在于提供一种接枝有kgn的功能化双网络水凝胶；
8.本发明的第二目的在于提供一种简单、且无需使用有毒引发剂的制备方法来制备功能化双网络水凝胶。
9.本发明的第三目的在于提供一种功能化双网络水凝胶的应用。
10.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
11.一种功能化双网络水凝胶，所述双网络水凝胶由壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络相互穿插形成；
12.所述壳聚糖交联网络由偶联有kgn的壳聚糖离子交联而成；
13.所述四臂聚乙二醇交联网络由第一前体和第二前体经化学反应而成，所述第一前体为tetra
‑
peg
‑
nh2，所述第二前体为tetra
‑
peg
‑
nhs。
14.优选地，所述第一前体与所述第二前体的质量比为(0.5
‑
2)：(0.5
‑
2)，进一步优选为1:1；和/或
15.所述偶联有kgn的壳聚糖与所述第一前体的质量比为1:(1
‑
5)，进一步优选为1:(2
‑
3)。
16.优选地，所述离子交联通过多价阴离子实现；可选地，所述多价阴离子为柠檬酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根、过硫酸根、硼酸根中的任一种或多种；和/或
17.所述偶联有kgn的壳聚糖利用壳聚糖与经edc/nhs活化的kgn反应而得；优选地，所述壳聚糖与活化前的kgn的质量比为(30
‑
40):1。
18.一种所述功能化双网络水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
19.(1)将壳聚糖与经edc/nhs活化的kgn混合并反应，得到壳聚糖
‑
kgn化合物；
20.(2)将步骤(1)得到的壳聚糖
‑
kgn化合物和tetra
‑
peg
‑
nh2配制成第一前体溶液；
21.(3)将tetra
‑
peg
‑
nhs配制成第二前体溶液；
22.(4)将第一前体溶液和第二前体溶液混合后静置成胶，得到复合水凝胶，然后将复合水凝胶进行激活处理，得到功能化双网络水凝胶。
23.优选地，在步骤(2)中，壳聚糖
‑
kgn化合物与tetra
‑
peg
‑
nh2按照1:(1
‑
5)，更优选为按照1：(2
‑
3)的质量比混合；和/或
24.tetra
‑
peg
‑
nh2与tetra
‑
peg
‑
nhs的质量比为(0.5
‑
2)：(0.5
‑
2)，更优选为1:1。
25.优选地，所述第一前体溶液的浓度为60
‑
100mg/ml，更优选为70
‑
80mg/ml，最优选为75mg/ml；和/或
26.所述第二前体溶液的浓度为150
‑
250mg/ml，更优选为180
‑
220mg/ml，最优选为200mg/ml。
27.优选地，在步骤(4)中，所述激活处理按照如下方法进行：
28.将所述复合水凝胶浸泡于含有多价阴离子的溶液中；可选地，所述多价阴离子为柠檬酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根、过硫酸根、硼酸根中的任一种或多种。
29.优选地，所述步骤(1)按照如下方法进行：
30.(11)将壳聚糖、活化后的kgn和溶剂混合，然后30
‑
40℃下搅拌反应；可选地，按照如下方法对kgn进行活化：将kgn、edc、nhs和溶剂混合，调节混合溶液的ph至5
‑
6，然后搅拌反应；
31.(12)将步骤(11)得到的反应物进行透析，优选采用截留分子量为20kd的透析袋进行透析；
32.(13)将经步骤(12)透析后的反应物冻干，得到所述壳聚糖
‑
kgn化合物。
33.一种功能化双网络水凝胶，采用本发明提供的所述制备方法制得。
34.本发明提供的所述功能化双网络水凝胶和/或利用本发明提供的制备方法制得的功能化双网络水凝胶在骨再生支架材料中的应用。
35.有益效果
36.本发明的上述技术方案具有如下优点：
37.本发明选择经美国食品药品监督管理局(fda)批准、对人体无毒、生物相容性好、生物可降解的壳聚糖(chi)和聚乙二醇(peg)为原料。chi作为唯一的碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在多价阴离子存在下，通过配位作用和二次作用可以形成chi离子交联网络。peg具有无免疫原性、无毒性和生物相容性等优点，本发明的四臂peg水凝胶仅需通过混合两种前体溶液即可原位成胶，制备过程简单方便。
38.本发明提供的功能化的dn水凝胶不仅具有良好的力学性能和细胞亲和性，为骨再生提供力学支撑；还能缓慢释放kgn，持续为种子细胞成骨分化提供必要的生物活性因子。
39.由于kgn为小分子化合物，可以规避生长因子生物半衰期短、不稳定等不利因素，使其在骨缺损修复领域有广阔的应用前景。
40.本发明制得的dn凝胶具有良好的微观结构。
41.现有双网络水凝胶的制备步骤比较复杂，而本发明制备过程简单，价廉易得，可以通过比较简单的步骤制得双网络水凝胶。
附图说明
42.图1是sem检测peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶的形貌图；
43.图2是流变学测量的振荡频率扫描实验测定peg
‑
chi和peg
‑
chi
‑
kgn复合凝胶及dn凝胶的剪切性能；g＇为储存模量，g
″
为耗散模量；
44.图3是live/dead染色法观察peg
‑
chi和peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶中细胞的活性，绿色代表活细胞，红色代表死细胞；
45.图4是micro
‑
ct检测peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶修复小鼠颅顶骨缺损能力。
具体实施方式
46.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.〈第一方面〉
48.本发明在第一方面提供了一种功能化双网络水凝胶，所述双网络水凝胶由壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络相互穿插形成；所述壳聚糖交联网络由偶联有kgn的壳聚糖离子交联而成；所述四臂聚乙二醇交联网络由第一前体和第二前体经化学反应而成，所述第一前体为tetra
‑
peg
‑
nh2，所述第二前体为tetra
‑
peg
‑
nhs。
49.功能化双网络水凝胶
50.本发明在双网络水凝胶中引入了kgn(中文名称为2
‑
([1,1
‑
联苯]
‑4‑
基氨基甲酰)苯甲酸)，通过化学方法将kgn接枝与双网络水凝胶中，使得材料可以缓慢释放kgn，持续为种子细胞成骨分化提供必要的生物活性因子，提供了一种具有定向诱导成骨能力的组织工程支架材料。
[0051]
壳聚糖交联网络
[0052]
壳聚糖交联网络由偶联有kgn的壳聚糖离子交联而成。
[0053]
上述离子交联优选通过多价电负性分子和/或多价阴离子实现。壳聚糖带一价正电荷，多价阴离子带多价负电荷，通过正负电荷吸附(有的情况下还有离子络合作用)能够形成物理网络结构。
[0054]
作为多价阴离子，可以列举出柠檬酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根、过硫酸根、硼酸根等，可以选择上述多价阴离子中的任一种或多种。
[0055]
上述偶联有kgn的壳聚糖可以利用壳聚糖与经edc/nhs活化的kgn反应而得。优选地，所述壳聚糖与活化前的kgn的质量比为(30
‑
40):1，例如，30:1，31:1，32:1，33:1，34:1，35:1，36:1，37:1，38:1，39:1，40:1。
[0056]
四臂聚乙二醇交联网络
[0057]
四臂聚乙二醇交联网络由第一前体和第二前体经化学反应而成，第一前体为tetra
‑
peg
‑
nh2，第二前体为tetra
‑
peg
‑
nhs。
[0058]
本发明采用的两种四臂peg为超支化聚合物，拥有大量末端功能团、高度支化和三维球形结构，且合成简便。与普通peg相比，四臂peg有更多的末端功能团，为聚合物的修饰提供了大量反应位点，也拓展了其生物应用的多样性。本发明采用
‑
nh2和
‑
nhs修饰的两种四臂peg来形成四臂聚乙二醇交联网络，交联网络具有韧性佳、成胶时间较快、降解速度适宜以及生物安全性优异的优点。需要说明的是，tetra
‑
peg
‑
nh2和tetra
‑
peg
‑
nhs这两种四臂peg组分均为现有材料。
[0059]
第一前体与第二前体的质量比优选为(0.5
‑
2)：(0.5
‑
2)，进一步优选为1:1。
[0060]
偶联有kgn的壳聚糖与第一前体的质量比优选为1:(1
‑
5)，进一步优选为1:(2
‑
3)。
[0061]
总得来说，本发明提供的功能化双网络水凝胶具有如下优点：
[0062]
①
本发明选择经美国食品药品监督管理局(fda)批准、对人体无毒、生物相容性好、生物可降解的壳聚糖(chi)和聚乙二醇(peg)为原料。chi作为唯一的碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在多价阴离子存在下，通过配位作用和二次作用可以形成chi离子交联网络。peg具有无免疫原性、无毒性和生物相容性等优点，本发明的四臂peg水凝胶仅需通过混合两种前体溶液即可原位成胶，制备过程简单方便。
[0063]
②
本发明制得的功能化的dn水凝胶不仅具有良好的力学性能和细胞亲和性，为骨再生提供力学支撑；还能缓慢释放kgn，持续为种子细胞成骨分化提供必要的生物活性因子。
[0064]
③
由于kgn为小分子化合物，可以规避生长因子生物半衰期短、不稳定等不利因素，使其在骨缺损修复领域有广阔的应用前景。
[0065]
〈第二方面〉
[0066]
本发明在第二方面提供了一种功能化双网络水凝胶的制备方法，利用这一制备方法可以制得本发明在第一方面提供的功能化双网络水凝胶，该制备方法包括如下步骤：
[0067]
(1)将壳聚糖与经edc/nhs活化的kgn混合并反应，得到壳聚糖
‑
kgn化合物；
[0068]
(2)将步骤(1)得到的壳聚糖
‑
kgn化合物和tetra
‑
peg
‑
nh2配制成第一前体溶液；
[0069]
(3)将tetra
‑
peg
‑
nhs配制成第二前体溶液；
[0070]
(4)将第一前体溶液和第二前体溶液混合后静置成胶，得到复合水凝胶，然后将复合水凝胶进行激活处理，得到功能化双网络水凝胶。
[0071]
步骤(1)：步骤(1)为利用化学方法将kgn偶联于壳聚糖(chi)上，获得chi
‑
kgn化合物(即上述提及的壳聚糖
‑
kgn化合物)的步骤，具体来说是利用碳二亚胺化学法使kgn末端羧基与chi胺基之间形成化学连接的酰胺键，从而将kgn偶联在chi上，从而获得chi
‑
kgn化合物。
[0072]
为了确保偶联效果，本发明的步骤(1)可以按照如下方法进行：
[0073]
(11)将壳聚糖、活化后的kgn和溶剂混合，然后30
‑
40℃下搅拌反应；可选地，按照如下方法对kgn进行活化：将kgn、edc、nhs和溶剂混合，调节混合溶液的ph至5
‑
6，然后搅拌反应；
[0074]
(12)将步骤(11)得到的反应物进行透析，优选采用截留分子量为20kd的透析袋进行透析；
[0075]
(13)将经步骤(12)透析后的反应物冻干，得到所述壳聚糖
‑
kgn化合物。
[0076]
上述步骤中，所用的活化后的kgn可以按照如下方法将kgn进行活化后而得到：
[0077]
将kgn、edc(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)和溶剂混合，调节混合溶液的ph至5
‑
6，然后搅拌反应，充分活化kgn的羧基，得到活化后的kgn。
[0078]
步骤(2)：步骤(2)为配制第一前体溶液的步骤。本发明将步骤(1)制得的chi
‑
kgn化合物与tetra
‑
peg
‑
nh2混合，可加入溶剂(如pbs缓冲溶液，即磷酸缓冲盐溶液)充分溶解，得到第一前体溶液。
[0079]
壳聚糖
‑
kgn化合物与tetra
‑
peg
‑
nh2优选按照1:(1
‑
5)的质量比混合，更优选按照1：(2
‑
3)的质量比混合。
[0080]
第一前体溶液的浓度优选为60
‑
100mg/ml，更优选为70
‑
80mg/ml，最优选为75mg/ml。需要说明的是，此处浓度指的是壳聚糖
‑
kgn化合物与tetra
‑
peg
‑
nh2两者在溶剂中的浓度。
[0081]
步骤(3)：步骤(3)为配制第二前体溶液的步骤。可以将tetra
‑
peg
‑
nhs与溶剂(如pbs缓冲溶液)混合，得到第二前体溶液。
[0082]
第二前体溶液的浓度优选为150
‑
250mg/ml，更优选为180
‑
220mg/ml，最优选为200mg/ml。此处浓度指的是tetra
‑
peg
‑
nhs在溶剂中的浓度。
[0083]
需要说明的是，配制第一前体溶液与配制第二前体溶液的顺序对制备工艺无影响。本发明为了便与描述，将配制第一前体溶液描述为步骤(2)，将配制第二前体溶液描述
为步骤(3)。应当理解的是，先配制第二前体溶液再配制第一前体溶液、同时配制第一前体溶液和第二前体溶液的制备效果与先配制第一前体溶液再配制第二前体溶液对制备工艺无影响。
[0084]
步骤(4)：步骤(4)为利用第一前体溶液和第二前体溶液获得功能化水凝胶的步骤。本发明先将第一前体溶液和第二前体溶液混合后静置成胶，得到复合水凝胶，然后将复合水凝胶进行激活处理，到功能化双网络水凝胶。
[0085]
激活处理按照可以如下方法进行：将所述复合水凝胶浸泡于含有价阴离子的溶液中；可选地，所述多价阴离子为柠檬酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根、过硫酸根、硼酸根中的任一种或多种。
[0086]
上述制备方法的制备原理为：
[0087]
本发明首先通过化学方法将kgn偶联于壳聚糖(chi)上，获得chi
‑
kgn化合物(即上述提及的壳聚糖
‑
kgn化合物)，然后使用原位成胶和盐溶液浸泡离子交联成胶相结合的方法制备了功能化双网络(dn)水凝胶，即peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶。
[0088]
本发明提供的制备方法具有如下优点：
[0089]
①
本发明采用原位成胶和盐溶液浸泡离子交联成胶相结合的方法制备了peg
‑
chi dn凝胶，所获得的dn凝胶不仅具有良好的力学性能和细胞亲和性，为骨再生提供力学支撑；还能缓慢释放kgn，持续为种子细胞成骨分化提供必要的生物活性因子。
[0090]
②
本发明制得的dn凝胶具有良好的微观结构。
[0091]
③
现有双网络水凝胶的制备步骤比较复杂，而本发明制备过程简单，价廉易得，可以通过比较简单的步骤制得双网络水凝胶。
[0092]
〈第三方面〉
[0093]
本发明在第一方面提供的功能化双网络水凝胶或者利用本发明在第二方面提供的制备方法制得的功能化双网络水凝胶可以应用在骨再生支架材料中，用于骨缺损修复。
[0094]
以下是本发明列举的实施例。
[0095]
实施例1
[0096]
chi
‑
kgn化合物的制备
[0097]
利用碳二亚胺化学法使kgn末端羧基与chi胺基之间形成化学连接的酰胺键，制备chi
‑
kgn化合物。
[0098]
制备方法包括如下步骤：
[0099]
称取kgn 120mg，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)726mg，n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)434.8mg溶于20ml蒸馏水中，调节溶液ph值至5.7，37℃下搅拌反应2h，充分活化kgn的羧基，得到活化的kgn溶液。
[0100]
称取壳聚糖3600mg加入至上述活化的kgn溶液中，再添加蒸馏水使溶液总体积达到150ml，37℃条件下搅拌反应24h。
[0101]
将反应后的反应物置于截留分子量为20kd的透析袋内透析，每12h更换一次蒸馏水，持续透析72h。
[0102]
将透析后的反应物冻干，得到纯化的材料，即为chi
‑
kgn化合物，
‑
20℃下保存，备用。
[0103]
peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶的制备
[0104]
称取制得的chi
‑
kgn化合物200mg溶于10ml的pbs溶液中，再加入600mg的tetra
‑
peg
‑
nh2(购自厦门赛诺邦格，货号06020700209)，充分溶解，制备前体溶液1。
[0105]
称取tetra
‑
peg
‑
nhs(购自厦门赛诺邦格，货号06020702909)300mg溶于2ml的pbs溶液中，制备前体溶液2。
[0106]
将前体溶液1和2混合后使用圆周震荡仪快速混匀，静置成胶，获得含有chi
‑
kgn的peg
‑
chi
‑
kgn复合水凝胶。
[0107]
待水凝胶成胶完全，在复合水凝胶上方加入硫酸钠溶液，静置过夜，获得peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶。
[0108]
所得材料为双网络水凝胶材料，由壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络相互穿插形成。相比于传统的水凝胶，双网络水凝胶具有更好的力学性能。chi以及两种四臂peg均对人体无毒、生物相容性好、生物可降解，制得的双网络水凝胶无细胞毒性。通过化学方法将kgn偶联于chi上，使双网络水凝胶功能化，可释放kgn，为种子细胞成骨分化提供必要的生物活性因子。
[0109]
实施例2
[0110]
chi
‑
kgn化合物的制备
[0111]
利用碳二亚胺化学法使kgn末端羧基与chi胺基之间形成化学连接的酰胺键，制备chi
‑
kgn化合物。
[0112]
制备方法包括如下步骤：
[0113]
称取kgn 120mg，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)726mg，n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)434.8mg溶于20ml蒸馏水中，调节溶液ph值至5.7，37℃下搅拌反应2h，充分活化kgn的羧基，得到活化的kgn溶液。
[0114]
称取壳聚糖4800mg加入至上述活化的kgn溶液中，再添加蒸馏水使溶液总体积达到150ml，37℃条件下搅拌反应24h。
[0115]
将反应后的反应物置于截留分子量为20kd的透析袋内透析，每12h更换一次蒸馏水，持续透析72h。
[0116]
将透析后的反应物冻干，得到纯化的材料，即为chi
‑
kgn化合物，
‑
20℃下保存，备用。
[0117]
peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶的制备
[0118]
称取制得的chi
‑
kgn化合物200mg溶于8ml的pbs溶液中，再加入400mg的tetra
‑
peg
‑
nh2(购自厦门赛诺邦格，货号06020700209)，充分溶解，制备前体溶液1。
[0119]
称取tetra
‑
peg
‑
nhs(购自厦门赛诺邦格，货号06020702909)400mg溶于2ml的pbs溶液中，制备前体溶液2。
[0120]
将前体溶液1和2混合后使用圆周震荡仪快速混匀，静置成胶，获得chi
‑
kgn含量为2％的peg
‑
chi
‑
kgn复合水凝胶。
[0121]
待水凝胶成胶完全，在复合水凝胶上方加入饱和柠檬酸钠溶液，静置过夜，获得peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶。
[0122]
所得材料为双网络水凝胶材料，由壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络相互穿插形成。相比于传统的水凝胶，双网络水凝胶具有更好的力学性能。chi以及两种四臂peg均对人体无毒、生物相容性好、生物可降解，制得的双网络水凝胶无细胞毒性。通过化学方
法将kgn偶联于chi上，使双网络水凝胶功能化，可释放kgn，为种子细胞成骨分化提供必要的生物活性因子。
[0123]
实施例3
[0124]
chi
‑
kgn化合物的制备
[0125]
利用碳二亚胺化学法使kgn末端羧基与chi胺基之间形成化学连接的酰胺键，制备chi
‑
kgn化合物。
[0126]
制备方法包括如下步骤：
[0127]
称取kgn 120mg，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)726mg，n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)434.8mg溶于20ml蒸馏水中，调节溶液ph值至5.7，37℃下搅拌反应2h，充分活化kgn的羧基，得到活化的kgn溶液。
[0128]
称取壳聚糖4000mg加入至上述活化的kgn溶液中，再添加蒸馏水使溶液总体积达到150ml，37℃条件下搅拌反应24h。
[0129]
将反应后的反应物置于截留分子量为20kd的透析袋内透析，每12h更换一次蒸馏水，持续透析72h。
[0130]
将透析后的反应物冻干，得到纯化的材料，即为chi
‑
kgn化合物，
‑
20℃下保存，备用。
[0131]
peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶的制备
[0132]
称取制得的chi
‑
kgn化合物200mg溶于8ml的pbs溶液中，再加入400mg的tetra
‑
peg
‑
nh2(购自厦门赛诺邦格，货号06020700209)，充分溶解，制备前体溶液1。
[0133]
称取tetra
‑
peg
‑
nhs(购自厦门赛诺邦格，货号06020702909)400mg溶于2ml的pbs溶液中，制备前体溶液2。
[0134]
将前体溶液1和2混合后使用圆周震荡仪快速混匀，静置成胶，获得chi
‑
kgn含量(含量为chi
‑
kgn质量与加入液体的体积之比)为2％的peg
‑
chi
‑
kgn复合水凝胶。
[0135]
待水凝胶成胶完全，在复合水凝胶上方加入饱和柠檬酸钠溶液，静置过夜，获得peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶。
[0136]
所得材料为双网络水凝胶材料，由壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络相互穿插形成。相比于传统的水凝胶，双网络水凝胶具有更好的力学性能。chi以及两种四臂peg均对人体无毒、生物相容性好、生物可降解，制得的双网络水凝胶无细胞毒性。通过化学方法将kgn偶联于chi上，使双网络水凝胶功能化，可释放kgn，为种子细胞成骨分化提供必要的生物活性因子。
[0137]
以实施例3制得的材料为例，对本发明提供的功能化双网络水凝胶的性能进行详细说明。水凝胶sem观察
[0138]
将水凝胶在
‑
80℃冷冻干燥48h，将干燥的样品小心地粘在导电树脂上，并在其表面喷涂一层薄金，使用jsm
‑
7900fsem、以3kv的加速电压获得场发射sem图像。图1显示了peg
‑
chi
‑
kgn dn水凝胶形貌，从图1中可以看出，材料具有良好的微观结构。
[0139]
流变学试验
[0140]
使用thermo
‑
haake流变仪、直径35mm的锥形平行板装置测量4种水凝胶的成胶时间和剪切模量。
[0141]
在恒定应变为0.05％、振荡频率为1rad/s的条件下进行时间扫描实验，将处于溶
液状态(0.5ml)的样品放置在两个平板之间，间隙设置为0.5mm，g
′
与g
″
的交汇处为成胶时间。
[0142]
频率扫描实验在0.1
‑
10rad/s的频率范围内进行，恒定应变为0.05％，将水凝胶(d＝35mm，h＝3.5mm)放置在两个平行板之间，间隙设置为3mm，测定水凝胶的剪切模量。
[0143]
图2显示了不同结构的水凝胶的剪切性能。
[0144]
需要说明的是：
[0145]
peg
‑
chi dn水凝胶的制备思路与实施例3的区别在于未加kgn，具体制备步骤包括：
[0146]
称取chi 200mg溶于8ml的pbs溶液中，再加入400mg的tetra
‑
peg
‑
nh2(购自厦门赛诺邦格，货号06020700209)，充分溶解，制备前体溶液1。
[0147]
称取tetra
‑
peg
‑
nhs(购自厦门赛诺邦格，货号06020702909)400mg溶于2ml的pbs溶液中，制备前体溶液2。
[0148]
将前体溶液1和2混合后使用圆周震荡仪快速混匀，静置成胶，获得peg
‑
chi复合水凝胶(即peg
‑
chi composite gel)。
[0149]
待peg
‑
chi复合水凝胶成胶完全，在复合水凝胶上方加入饱和柠檬酸钠溶液，静置过夜，获得peg
‑
chi dn水凝胶。
[0150]
live/dead染色观察水凝胶上细胞状态
[0151]
细胞
‑
支架复合物培养3d后，pbs溶液冲洗2次，去除支架上多余的培养基。
[0152]
将样品完全浸泡于live/dead染色工作液(钙黄绿素am 2mm；溴乙啡锭二聚体
‑
1 4mm)中，37℃，孵育1h。
[0153]
使用激光共聚焦显微镜，用488nm或568nm的激发波长检测钙黄绿素am(活细胞＝绿色)或溴乙啡锭二聚体
‑
1(死细胞＝红色)的荧光。
[0154]
观察水凝胶上bmmscs的数量及细胞状态。
[0155]
图3显示了不同水凝胶材料中细胞的活性，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。从图3中可以看出，功能化双网络水凝胶无细胞毒性。
[0156]
小鼠颅顶骨缺损修复动物实验
[0157]
(1)细胞接种，复合培养
[0158]
将第三代1
×
107/mlbmmscs悬液滴注在支架表面，放入细胞培养箱内孵育2h后，准备植入实验动物体内。
[0159]
(2)构建小鼠颅顶临界骨缺损模型，并进行骨组织再生疗效评价
[0160]
选取8周龄c57bl/6小鼠，全身麻醉后，备皮消毒，沿头盖骨正中线纵向切开皮肤约1cm，暴露颅顶骨，用棉签移去颅骨膜后，用直径3mm的打孔器于颅缝左右两侧钻孔，钻孔过程中注意及时降温及去除存留骨粉，当钻头穿透全层颅骨，有落空感后即拔出钻头停止钻孔，以防止损伤颅骨下硬脑膜。
[0161]
实验分组：a假手术组、b骨缺损空白对照组、c骨缺损修复组，手术后12周处死进行影像学检测
[0162]
将组织置于固定液中充分固定，使用scanoμct扫描颅顶骨样本。scanoμct的参数设定像素大小20μm、千伏峰值30kvp、电流200μa，利用scanoco软件将扫描得到的数据重建，倒入amira软件进行图像采集和新生骨面积分析。结果见图4。
[0163]
后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。